李云蕊,劉俊杰,艾明雄,孫顯國

(1.云南省楚雄彝族自治州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，云南 楚雄 675000;2.昆明正大豬業(yè)有限公司，云南 昆明 650000)

工業(yè)生產(chǎn)排放的汞離子(Hg2+)直接破壞自然環(huán)境，且通過食物鏈進行生物累積進一步威脅公眾健康。Hg2+對蛋白質(zhì)和酶中的硫醇基具有高親和性，即使極低劑量的接觸也可能導(dǎo)致認(rèn)知和運動障礙，增大心血管疾病，甚至癌癥的發(fā)生幾率[1-3]。因此，在低濃度下對Hg2+進行靈敏檢測對于環(huán)境保護和疾病預(yù)防都具有重要意義。Hg2+常見的檢測技術(shù)包括原子吸收光譜法[4]、原子熒光光譜法[5]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[6]、X射線吸收光譜法[7]。然而這些技術(shù)不僅需要大型專業(yè)儀器和訓(xùn)練有素的工作人員，而且存在繁瑣、耗時、不適合便攜式使用、無法現(xiàn)場檢測等局限。因此，開發(fā)一種簡單、快速、靈敏、選擇性監(jiān)測Hg2+的高效分析方法的非常必要。

與傳統(tǒng)分析技術(shù)相比，電化學(xué)生物傳感器在便攜性、低成本、簡單性、選擇性、靈敏度方面更具優(yōu)勢[8]。近年來，研究人員在構(gòu)建新型Hg2+電化學(xué)生物傳感器方面做出了許多貢獻(xiàn)。特別是，隨著DNA納米技術(shù)的發(fā)展，將新型DNA納米機器和多種核酸信號放大策略集成到電化學(xué)生物傳感器的開發(fā)研究中，對Hg2+檢測的特異性優(yōu)化、靈敏度提升具有重要意義[9-11]。本文闡述了近年來構(gòu)建的Hg2+電化學(xué)生物傳感器的研究進展，主要包括簡單的Hg2+電化學(xué)生物傳感器、核酸信號放大策略對Hg2+檢測靈敏度的提升，以及納米機器在Hg2+電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用。

1 簡單的Hg2+電化學(xué)生物傳感器

1.1 電化學(xué)生物傳感器原理

電化學(xué)生物傳感器主要包括生物識別元件、信號轉(zhuǎn)換器、數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)三部分(圖1)。當(dāng)生物識別元件與目標(biāo)分析物特異性結(jié)合時，其相互作用經(jīng)信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為電流、累積電荷、阻抗或電位的變化，數(shù)據(jù)分析處理后即可輸出與分析物濃度相關(guān)的電信號，實現(xiàn)對分析物的定量檢測[12]。針對不同的檢測需求，全細(xì)胞、組織、酶、抗體、適配體、DNA等均可作為生物識別元件，使得電化學(xué)生物傳感器在疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品質(zhì)量管理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[13-15]。

圖1 電化學(xué)生物傳感器示意圖

1.2 T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)

寡核苷酸是一種高效、環(huán)保,具有生物特異性的分析工具。一些重金屬離子對某些DNA堿基具有選擇性，可通過配位鍵形成穩(wěn)定的堿基對。2004年，Ono和Togashi[16]首次報道了當(dāng)Hg2+存在時，包含胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(T-T)錯配堿基對的DNA雙鏈呈現(xiàn)較強的熱穩(wěn)定性,而其他重金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Pd2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Pb2+等，對T-T錯配DNA雙鏈的熱穩(wěn)定性并無顯著增強。經(jīng)核磁共振實驗，進一步證實了Hg2+易與T-T堿基對特異性結(jié)合形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，其結(jié)合的相互作用力甚至高于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的T-A沃森-克里克堿基對[17-18]。因此，依賴于Hg2+與T-T錯配堿基的特異性結(jié)合可以設(shè)計高選擇性的Hg2+電化學(xué)生物傳感器。

1.3 基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)構(gòu)建的簡單電化學(xué)生物傳感器

如圖2所示，Wu等[19]人通過自組裝將富T堿基的DNA單鏈固載在金電極上，利用Hg2+和T堿基之間的特異性結(jié)合作用來選擇性地將Hg2+捕獲于電極表面，并采用差分脈沖伏安法對Hg2+進行測定，開發(fā)了一種基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的簡單傳感器一步實現(xiàn)Hg2+檢測。另外，Niu等[20]人采用兩種T-T堿基錯配的DNA單鏈P1和P2：P1首先固定于電極表面，P2標(biāo)記有電活性物質(zhì)二茂鐵(Fc)。Hg2+誘導(dǎo)作用下，P1和P2之間憑借T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，成功在電極表面組裝形成穩(wěn)定DNA雙鏈，并產(chǎn)生與Hg2+濃度成正比例的Fc電化學(xué)信號，實現(xiàn)在 1 nmoL/L～10 μmoL/L 濃度范圍內(nèi)對Hg2+線性響應(yīng)[20]。因此，可以說，T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的應(yīng)用顯著促進了Hg2+電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展[21-22]。

圖2 一步法檢測Hg2+的電化學(xué)生物傳感器示意圖

2 核酸信號放大策略對Hg2+檢測靈敏度的提升

基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)構(gòu)建的簡單電化學(xué)生物傳感器中，多個Hg2+對應(yīng)一個DNA探針產(chǎn)生較弱的電信號響應(yīng)，因此靈敏度相對有限。隨著各種信號放大策略不斷被提出[23]，研究人員越來越關(guān)注核酸信號放大策略在Hg2+電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用，以追求更優(yōu)越的性能。

2.1 酶輔助的Hg2+循環(huán)放大策略

外切酶Ⅲ(Exo-Ⅲ)不依賴于特定核酸序列，不需要特定的識別位點，具有3’至5’端外切脫氧核糖核酸活性，可以催化具有3’平末端或凹陷末端的雙鏈DNA從3’端逐步降解。利用這一特性，ExoⅢ已被用于輔助Hg2+的循環(huán)利用，以放大信號，提高Hg2+檢測的靈敏度[24-27]。在Wu[28]構(gòu)建的傳感器中(如圖3)，一端標(biāo)記有電活性物質(zhì)Fc的DNA單鏈P1被固定在金電極表面，Hg2+存在時P1與DNA P2互補形成3’平末端雙鏈，觸發(fā)Exo-Ⅲ從3’端逐步降解該雙鏈DNA中的P1，導(dǎo)致電極表面Fc的數(shù)量減少，同時釋放出Hg2+。ExoⅢ輔助釋放出的Hg2+繼續(xù)參與以上這一過程，使得Hg2+被充分循環(huán)利用，實現(xiàn)少量的Hg2+即可減少大量的Fc，產(chǎn)生顯著的Fc信號降低，檢測限低至 6.2 pmoL/L。

圖3 基于Exo-Ⅲ輔助Hg2+循環(huán)放大策略的傳感器示意圖

2.2 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)[29-31]作為一種強有力的信號放大技術(shù)，由于非酶性和等溫性而顯示出一定的優(yōu)勢。HCR由Dirks和Piece率先報道[32]，一個典型的HCR(如圖4)包括一對末端有粘性的互補DNA發(fā)夾(H1、H2)和一個啟動子(I鏈)。在沒有I鏈的情況下，H1和H2穩(wěn)定共存。一旦引入I鏈，由于I鏈與H1的粘性末端及莖部堿基互補，H1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)就會被打開。而打開的H1與H2的粘性末端及莖部堿基也互補，使得H2的發(fā)夾結(jié)構(gòu)繼續(xù)被打開，從而觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致H1、H2、H1、H2、H1......依次被循環(huán)打開，形成具有H1-H2多重重復(fù)結(jié)構(gòu)的長DNA雙鏈聚合物?；谶@樣的HCR放大原理，Yu等[33]人結(jié)合特異性T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，制備了一種新型的電化學(xué)生物傳感器。在目標(biāo)物Hg2+存在的情況下，T-Hg2+-T作用使得HCR的啟動鏈成功被引入電極表面，觸發(fā)H1和H2級聯(lián)反應(yīng)自組裝成長DNA雙鏈聚合物。此過程巧妙地將少量的Hg2+轉(zhuǎn)化成極長的DNA雙鏈聚合物，DNA雙鏈聚合物中進一步嵌入大量的電活性物質(zhì)甲苯胺藍(lán)TB以輸出放大的信號，實現(xiàn)高效檢測Hg2+，檢測限低至 0.2 pmoL/L。

圖4 HCR的工作原理

2.3 DNAzyme輔助的信號放大策略

陽離子特異性DNAzymes，一類功能性核酸，因良好的穩(wěn)定性、易制備、設(shè)計靈活、可循環(huán)催化含有核糖核酸堿基rA的DNA底物在rA處裂解成兩段[34]，常被用作一種理想的生物催化劑來構(gòu)建靈敏的非酶分析方法[35-37]。Cai等[38]人通過結(jié)合Hg2+誘導(dǎo)激活的Mg2+特異性DNAzyme(Mg2+-DNAzyme)用于信號放大，提出了一種高靈敏度檢測Hg2+的電化學(xué)阻抗生物傳感器，并驗證了其在實際樣品分析中具有應(yīng)用潛力。如圖5所示，圖中A部分首先合成了兩種分別修飾DNA發(fā)夾H3和H4的共聚物鏈P1和P2；圖中B部分將Hg2+作為觸發(fā)器，在T-Hg2+-T作用下使得D1與D2鏈互補結(jié)合形成特定序列的DNAzyme。Mg2+幫助下，DNAzyme選擇性地結(jié)合底物H2并在rA處發(fā)生裂解作用輸出sDNA片段。值得強調(diào)的是，少量的Hg2+輸入雖只能激活少量的DNAzyme，但DNAzyme對H2的裂解作用循環(huán)持續(xù)發(fā)生，可以輸出大量的sDNA，以進一步與電極表面固載的H1雜交，從而觸發(fā)P1和P2中發(fā)夾DNA之間的HCR，在電極表面組裝形成一層DNA水凝膠?？偟膩碚f，Hg2+的輸入經(jīng)DNAzyme作用產(chǎn)生大量的sDNA，sDNA觸發(fā)HCR得到非導(dǎo)電DNA水凝膠，非導(dǎo)電DNA水凝膠極大地阻礙了電子轉(zhuǎn)移，為構(gòu)建檢測Hg2+的高靈敏阻抗生物傳感器提供了可能。在最佳條件下，該阻抗型生物傳感器在 0.1 pmoL/L～10 nmoL/L 的濃度范圍內(nèi)對Hg2+具有良好的響應(yīng)，檢測限為 0.042 pmoL/L。

圖5 基于DNAzyme輔助放大信號的傳感器示意圖

2.4 催化發(fā)夾自組裝

催化發(fā)夾自組裝(CHA)是一種焓驅(qū)動的無酶放大技術(shù)。與HCR類似，典型的CHA[39]設(shè)計了一對互補的DNA發(fā)夾(H1和H2)，但互補的堿基部分被鎖定在各自的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中。如圖6所示，當(dāng)沒有啟動鏈存在時，H1和H2的反應(yīng)在動力學(xué)上受限，以發(fā)夾的狀態(tài)穩(wěn)定存在。啟動鏈存在時，啟動鏈與H1的粘性末端和莖部堿基互補，觸發(fā)DNA鏈置換反應(yīng)打開H1的莖部，H1新裸露的單鏈DNA區(qū)域繼續(xù)與H2的黏性末端和莖部堿基互補觸發(fā)第二次鏈置換反應(yīng)。在第二次鏈置換過程中，H1與H2從發(fā)夾結(jié)構(gòu)已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為H1/H2互補雙鏈，啟動鏈同時也被置換下來繼續(xù)催化H1與H2的下一輪雜交。簡而言之，啟動鏈的輸入加速了兩個DNA發(fā)夾之間的雜交，轉(zhuǎn)化為大量H1/H2互補雙鏈輸出，該過程即為CHA。

圖6 CHA的工作原理

將目標(biāo)核酸作為啟動鏈激活CHA已經(jīng)提出了許多靈敏的核酸檢測方法[40-42]。為了設(shè)計一個Hg2+響應(yīng)型CHA，Zhong等[43]人引入了Helper DNA和三個發(fā)夾探針，H1探針兩端用硫醇基修飾，H2和H3用Fc標(biāo)記。將Hg2+引入體系時，在T-Hg2+-T作用驅(qū)動下，Helper DNA打開H1，被打開的H1裸露部分充當(dāng)啟動鏈誘導(dǎo)發(fā)夾H2和H3的催化自組裝，形成剛性DNA三角結(jié)構(gòu)，同時釋放出Hg2+。釋放出的Hg2+繼續(xù)調(diào)控CHA循環(huán)發(fā)生，擴增出大量DNA三角結(jié)構(gòu)。輸出的DNA三角結(jié)構(gòu)容易與電極接觸，將Fc引入電極表面產(chǎn)生放大的電化學(xué)信號，實現(xiàn)對Hg2+的靈敏檢測，檢測下限低至 0.12 pmoL/L。

3 納米機器在Hg2+電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

3.1 納米開關(guān)

DNA納米機器具有相對較高的穩(wěn)定性、靈活的可編程性和良好的生物相容性而被廣泛應(yīng)用?；诓煌墓押塑账峤Y(jié)構(gòu)已經(jīng)設(shè)計出了功能多樣的DNA納米器件，比如，依據(jù)T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)調(diào)控的DNA構(gòu)象轉(zhuǎn)換，研究人員將富T堿基的適體鏈作為分子開關(guān)構(gòu)建了一個超靈敏控制釋放型適體傳感器[44]。適體鏈為單鏈時，是分子開關(guān)的關(guān)閉狀態(tài)。隨著Hg2+的引入，T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的形成使得適配體彎曲成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，分子開關(guān)被打開，產(chǎn)生與Hg2+的濃度呈正相關(guān)電信號響應(yīng)，實現(xiàn)了對Hg2+的超靈敏定量檢測。

此外，Ma等[45]人利用DNA三向連接結(jié)構(gòu)提出了另一種DNA納米開關(guān)。如圖7所示，DNA納米開關(guān)由兩個相鄰但不連續(xù)的Watson-Crick堿基配對雙莖與一個序列特定的DNA配體識別域共同組成。DNA配體識別域位于雙莖中間，能夠捕獲分析物Hg2+。通過凝膠電泳分析，隨著識別域中T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)逐漸形成，雙莖與DNA配體識別域之間的三向連接處會

圖7 基于納米開關(guān)的傳感器示意圖

發(fā)生細(xì)微的構(gòu)象變化使得DNA納米開關(guān)被激活，實現(xiàn)開(電導(dǎo)率增強)與關(guān)(電導(dǎo)率抑制)。這種“開”和“關(guān)”雙響應(yīng)的固定化DNA開關(guān)能被nmoL/L水平的Hg2+激活，將其用于電化學(xué)傳感器中對Hg2+具有靈敏的定量分析能力。

3.2 “蟹爪”狀DNA納米機器

Chang等[46]人巧妙設(shè)計了一種簡潔高效的“蟹爪”狀DNA納米機器作為信號放大器，用于Hg2+超靈敏電化學(xué)分析。如圖8所示，在目標(biāo)Hg2+存在下，通過T-Hg2+-T作用調(diào)控四條DNA鏈(A、B、C和D)可快速簡潔地自組裝成“蟹爪”狀DNA納米機器，一個“蟹爪”狀DNA納米機器具備四個DNAzyme。Mg2+輔助下，該DNA納米機器可以同時觸發(fā)四個相同的DNAzyme循環(huán)裂解底物反應(yīng)，將目標(biāo)Hg2+的輸入顯著轉(zhuǎn)化為大量標(biāo)記有Fc的DNA片段(H1’-Fc)，提高了檢測靈敏度。因此，該“蟹爪”狀DNA納米機器經(jīng)巧妙設(shè)計被賦予的強大DNAzyme循環(huán)裂解作用輔助電化學(xué)傳感平臺實現(xiàn)了在 10 fmoL/L～100 nmoL/L 范圍內(nèi)對Hg2+簡單而快速的定量檢測，為金屬污染物分析和環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)中DNA納米機器的開發(fā)利用提供了參考。

圖8 “蟹爪”狀DNA納米機器的工作原理

典型的Hg2+電化學(xué)生物傳感器的相關(guān)信息總結(jié)于表1中?？梢钥闯?，基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)構(gòu)建的簡單電化學(xué)生物傳感器已經(jīng)呈現(xiàn)出對Hg2+的高選擇性響應(yīng)能力；而Exo-Ⅲ輔助Hg2+循環(huán)放大策略、HCR、DNAzyme輔助信號放大、CHA等核酸信號放大策略以及納米機器的采用則更是明顯拓寬了Hg2+電化學(xué)生物傳感器的線性響應(yīng)范圍，檢測下限低至pmoL/L級，實現(xiàn)了對Hg2+的靈敏檢測。

表1 不同汞離子電化學(xué)生物傳感器對比表

4 結(jié)語

綜上所述，通過集成酶輔助Hg2+循環(huán)放大策略、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、DNAzyme輔助信號放大、催化發(fā)夾自組裝等核酸信號放大策略和新型DNA納米機器,電化學(xué)生物傳感平臺的檢測靈敏度已經(jīng)明顯提升，推動Hg2+定量分析取得巨大進展。但在實際應(yīng)用中，Hg2+電化學(xué)生物傳感器仍然存在部分問題亟需解決：1)傳感器生物敏感元件的適用條件較窄，酸堿度及溫度偏離最優(yōu)條件都會產(chǎn)生影響；2)檢測功能單一，很少有傳感器在滿足Hg2+檢測需求的同時可以同步檢測其他種類離子；3)實際樣品如肉類、蔬菜、水果、谷物等的前處理流程還需要規(guī)范和簡化。若處理不當(dāng)，殘留的樣品雜質(zhì)會直接干擾傳感器對Hg2+的信號響應(yīng)，造成傳感器檢測性能嚴(yán)重下降。因此，我們?nèi)孕柙谔嵘蛢?yōu)化電化學(xué)生物傳感器的抗干擾能力方面進行努力以增強其實時現(xiàn)場分析能力。未來更加高效、功能多樣化的納米器件的設(shè)計與制備將是一個新的研究方向，有助于拓寬電化學(xué)生物傳感器的適用范圍，實現(xiàn)多種離子的同步檢測，應(yīng)對更加復(fù)雜的實際樣品。