曹勛榮 呂桂雪 魏雯雯 （濟(jì)南市第二婦幼保健院婦產(chǎn)科，濟(jì)南 271100）

宮頸癌是常見(jiàn)生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，原位癌多發(fā)生于20～45 歲，而鱗狀浸潤(rùn)性癌高發(fā)年齡為45～55 歲，是女性癌癥死亡的主要原因之一，尤其在發(fā)展中地區(qū)發(fā)病率和病死率更高。宮頸癌發(fā)病部位隱匿，缺乏典型早期臨床癥狀，且腫瘤細(xì)胞具有超強(qiáng)惡性增殖及靶器官轉(zhuǎn)移能力，病情進(jìn)展迅速，多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)切除的最佳時(shí)機(jī)［1］。研究顯示，復(fù)發(fā)及惡性侵襲是中晚期宮頸癌患者失去生命的重要原因［2］。因此從疾病分子機(jī)制入手，積極探索癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的特異性分子標(biāo)志物，不僅有利于宮頸癌早期診斷，更有助于靶向治療開(kāi)展，降低患者病死率。胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN，又稱CD147）是一種屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白。研究顯示，CD147 能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞MMPs 表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)、侵襲、黏附和惡性轉(zhuǎn)移［3］。CD147 在喉鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，且伴有單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（monocarboxylate transporter 1，MCT1）高表達(dá)，而異常表達(dá)CD147 和MCT1的腫瘤患者預(yù)后不良［4］。但關(guān)于CD147在宮頸癌中作用的報(bào)道較少。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是一種借助基因技術(shù)手段沉默目的基因表達(dá)的RNA 干擾技術(shù)［5］。本研究探討臨床宮頸癌組織及宮頸癌細(xì)胞中CD147 表達(dá)，借助RNAi 技術(shù)探究其對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，為宮頸癌靶向治療提供可靠靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床組織樣本 選取2016 年2 月至2019 年2 月濟(jì)南市第二婦幼保健院病理組織室110 份宮頸組織，包括20 例正常宮頸上皮組織和90 例宮頸癌組織（30 例原位宮頸癌組織和60 例鱗狀宮頸癌組織）。所有患者均是首次確診，且未進(jìn)行放化療及免疫、內(nèi)分泌等干預(yù)?；颊吣挲g、生育與否、身高、體重等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?；颊呋蚣覍僦橥狻１狙芯拷?jīng)濟(jì)南市第二婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及主要試劑 30 只SPF 級(jí)4～6 周齡SD 裸鼠（130～180 g）由廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK（粵）2021-0246，飼養(yǎng)于濟(jì)南市第二婦幼保健院SPF 級(jí)動(dòng)物房，自由攝食飲水，恒溫恒濕下適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周用于實(shí)驗(yàn)；HeLa 宮頸癌細(xì)胞株由美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）提供；利用RNAi 及構(gòu)建的腺病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-shRNA-CD147 及GFP-shRNA-CD147-NC質(zhì)粒由上海吉瑪基因公司提供；大鼠抗人GAPDH、兔抗人CD147、MCT1抗體（美國(guó)Abcam 公司）；EdU 試劑盒、免疫組化試劑盒、Transwell 小室、Western blot 試劑盒（上海碧云天生物有限公司）；微量加樣器（德國(guó)Eppendorf公司）；智能細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）； IXplore Standard 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI 公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)臨床樣本中CD147 表達(dá) 將樣本組織常規(guī)固定，石蠟包埋，制成4 μm切片，枸櫞酸緩沖液修復(fù)，過(guò)氧化氫阻斷，加入一抗4 ℃暗盒孵育過(guò)夜，加入二抗，顯色，清洗，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡檢，以視野中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性［6］，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野由兩位資深病理研究人員根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例判斷CD147 陽(yáng)性與陰性表達(dá)，并將CD147 表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、臨床分期和淋巴轉(zhuǎn)移情況等臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HeLa 細(xì)胞，接種于含滅活10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)85%時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。以GFP-shRNA-CD147-NC 和GFP-shRNA-CD147 分 別轉(zhuǎn)染對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，另取空白細(xì)胞作為正常組，3組細(xì)胞均常規(guī)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡觀察，PCR儀測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 各組細(xì)胞形態(tài)改變 調(diào)整細(xì)胞濃度，以5×104個(gè)/孔接種于6 孔板，分組處理同上，輕輕混勻后恒溫恒濕常規(guī)培養(yǎng)24 h，10%甲醛固定，倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.4 EdU 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力 調(diào)整細(xì)胞濃度，以5×104個(gè)/孔接種于6 孔板，分組處理同上，輕輕混勻后恒溫恒濕常規(guī)培養(yǎng)24 h，10%甲醛固定并進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按照試劑盒要求操作。

1.2.5 Transwell 檢測(cè)各組細(xì)胞遷移和侵襲能力 在Transwell 小室平板平鋪一層Matrigel 基質(zhì)膠（約50 μl），并將無(wú)血清培養(yǎng)基中的各組單細(xì)胞懸液加至上室（侵襲實(shí)驗(yàn)中鋪Matrigel 膠，遷移實(shí)驗(yàn)中不鋪膠），小室下室平鋪含滅活10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h，清洗，甲醛固定，染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。

1.2.6 裸鼠成瘤模型檢測(cè)各組細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移能力 調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×106個(gè)/孔接種于24 孔板，分組處理同上，常規(guī)培養(yǎng)至密度為1×107個(gè)/ml時(shí)，以新的培養(yǎng)液將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。將裸鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，誘導(dǎo)麻醉后，在每只裸鼠背部皮下注射100 μl 對(duì)應(yīng)組細(xì)胞懸液，尾靜脈注射1 μmol/L Luciferin 劑后連接活體成像系統(tǒng)（IVIS），實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)裸鼠病灶轉(zhuǎn)移，采用系統(tǒng)自帶軟件統(tǒng)計(jì)分析熒光分布及強(qiáng)度，得到病灶轉(zhuǎn)移比例，4 周后留取圖像，處死動(dòng)物，取各組動(dòng)物瘤體組織稱重。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞CD147、MCT1 表達(dá) 胰酶消化細(xì)胞，離心稀釋成單細(xì)胞懸液，分組處理同上，按1×105個(gè)/孔接種至6 孔板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，加入蛋白裂解液，分別提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定濃度，沸水變性，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，清洗，封閉液孵育30 min，加入一抗（1∶500）孵育過(guò)夜，加入二抗（1∶1 000），二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，以GAPDH 為內(nèi)參，Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD147表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，與正常宮頸組織相比，原位宮頸癌組織中CD147 陽(yáng)性表達(dá)比例明顯升高，與原位宮頸癌組織相比，鱗狀宮頸癌組織中CD147陽(yáng)性表達(dá)比例明顯升高（均P＜0.05），說(shuō)明CD147表達(dá)與宮頸癌病情進(jìn)展關(guān)系密切（圖1）。

圖1 CD147表達(dá)（×400）Fig.1 CD147 expression （×400）

2.2 CD147 表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD147 表達(dá)與宮頸癌患者年齡及臨床分期無(wú)關(guān)（P＞0.05），與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移關(guān)系密切（均P＜0.05，表1）。

表1 CD147 表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 （n=90）Tab.1 Relationship between expression of CD147 and clinicopathological parameters of cervical cancer patients （n=90）

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均有明顯熒光出現(xiàn)，PCR 結(jié)果顯示，與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞CD147 mRNA 表達(dá)明顯降低，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功（圖2）。

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（×400）Fig.2 Cell transfection （×400）

2.4 各組細(xì)胞形態(tài)變化 倒置相差顯微鏡觀察顯示，正常組和對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，排列規(guī)整，胞質(zhì)界限清晰，胞漿中核糖體、線粒體等細(xì)胞器形態(tài)穩(wěn)定，核膜完整；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)趨于緩慢，且排列紊亂，胞漿中空泡樣變性明顯，部分細(xì)胞核膜缺損嚴(yán)重，染色體聚集明顯，培養(yǎng)基中出現(xiàn)一定量漂浮細(xì)胞，說(shuō)明沉默CD147 表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，CD147 表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞穩(wěn)定形態(tài)維系中發(fā)揮重要作用（圖3）。

圖3 各組細(xì)胞形態(tài)（×400）Fig.3 Cell morphology of each group （×400）

2.5 各組細(xì)胞增殖能力 EdU標(biāo)記后，與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞EdU 陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯下降（P＜0.05）。正常組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明干擾CD147 表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞增殖能力明顯受限（圖4）。

圖4 EdU染色（×400）Fig.4 EdU staining （×400）

2.6 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力 Transwell 結(jié)果顯示，與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)和通過(guò)Matrigel 基質(zhì)膠數(shù)明顯減少（均P＜0.05）；正常組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明干擾CD147 表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞侵襲與遷移能力明顯下降（圖5、圖6）。

圖5 細(xì)胞遷移（×400）Fig.5 Cell migration （×400）

圖6 細(xì)胞侵襲（×400）Fig.6 Cell invasion （×400）

2.7 各組細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，4 周后，實(shí)驗(yàn)組裸鼠內(nèi)移植瘤明顯變小，瘤體重量明顯減少（P＜0.05），正常組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖7）。裸鼠體內(nèi)病灶轉(zhuǎn)移情況結(jié)果顯示，與正常組相比，4 周后，實(shí)驗(yàn)組裸鼠內(nèi)種植瘤病灶轉(zhuǎn)移比例明顯降低 （P＜0.05），正常組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明干擾CD147 表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)與惡性轉(zhuǎn)移能力明顯下降（圖8）。

圖7 裸鼠成瘤Fig.7 Tumor formation in nude mice

圖8 病灶轉(zhuǎn)移圖像Fig.8 Metastasis image

2.8 各組細(xì)胞CD147、MCT1 表達(dá) CD147 的基因ID 為BSG，MCT1 的基因ID 為SLC16A1，GENEMANIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://genemania.org/）發(fā)現(xiàn)CD147 和MCT1存在特異性調(diào)控位點(diǎn)（圖9）；Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞CD147、MCT1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），正常組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明干擾CD147 表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞CD147和MCT1表達(dá)明顯下降（圖10）。

圖9 CD147與MCT1存在特異性調(diào)控位點(diǎn)Fig.9 Specific regulatory sites between CD147 and MCT1

圖10 各組細(xì)胞CD147、MCT1表達(dá)Fig.10 CD147 and MCT1 expressions of cells in each group

3 討論

作為婦科常見(jiàn)惡性腫瘤，宮頸癌多發(fā)生于20～55 歲女性，嚴(yán)重威脅全球女性健康。隨著社會(huì)發(fā)展，生活方式轉(zhuǎn)變，盡管宮頸癌早期篩查技術(shù)有所提高，但發(fā)病年齡日趨年輕化，尚未生育患者增多，患者再次復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率不斷升高，多數(shù)宮頸癌患者長(zhǎng)期生存率并不令人滿意［7］。宮頸癌分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段，尋找疾病進(jìn)展的潛在分子標(biāo)志物，積極開(kāi)發(fā)行而有效的分子靶向藥物是臨床醫(yī)師面臨的重大挑戰(zhàn)之一。

CD147 是一種定位于細(xì)胞膜表面的約為58 kD的跨膜蛋白，在人體胸腺細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞和組織中表達(dá)。研究顯示，CD147 在正常組織或細(xì)胞表達(dá)較低，在泌尿系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌、肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，因此CD147是惡性腫瘤靶向治療的研究熱點(diǎn)［8］。FANG 等［9］研究顯示，CD147 在前列腺癌中表達(dá)升高，且升高的CD147 介導(dǎo)Wnt/β-catenin 途徑，推動(dòng)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)患者病情進(jìn)展。MIN等［10］研究顯示，在腎細(xì)胞癌中抑制CD147 表達(dá)，能明顯抑制腫瘤細(xì)胞能量代謝，下調(diào)癌細(xì)胞增殖能力。YIN 等［11］研究顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌系中CD147 表達(dá)升高，干擾其表達(dá)能明顯抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)外增殖與侵襲能力。本研究免疫組化結(jié)果顯示，CD147 在宮頸癌組織表達(dá)升高，其表達(dá)升高伴隨病情進(jìn)展，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD147表達(dá)與宮頸癌患者腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，說(shuō)明在宮頸癌中研究CD147 表達(dá)具有臨床意義。采用shRNA 技術(shù)沉默其表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)受限，體外增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移能力下調(diào)，體內(nèi)生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移能力隨之下降，說(shuō)明其可能成為宮頸癌臨床治療的潛在靶點(diǎn)。

宮頸癌病情進(jìn)展是一個(gè)多基因參與調(diào)控的多分子共同作用的多階段緩慢過(guò)程，致癌因子刺激下，患者宮頸鱗狀上皮細(xì)胞異常增殖及激活參與分化，形成不典型增生宮頸上皮（原位癌），多種基因協(xié)同作用推動(dòng)病情發(fā)展，逐漸演化為鱗狀上皮內(nèi)病變、浸潤(rùn)癌，向淋巴、結(jié)腸等靶向器官發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移，危及患者生命［12］。MCT1 是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行糖酵解獲取能量的重要介導(dǎo)因子。研究顯示，MCT1 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、胃癌等腫瘤組織中表達(dá)升高，且其表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系密切［13］。LOGOTHETI等［14］研究顯示，在膀胱癌中抑制MCT1 表達(dá)能明顯抑制腫瘤細(xì)胞代謝重編程，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。AL-MOUSAWI 等［15］研究報(bào)道，在結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 中下調(diào)MCT1 表達(dá)能明顯減少腫瘤細(xì)胞侵襲和惡性轉(zhuǎn)移過(guò)程中所需能量。本研究在GENEMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)CD147 與MCT1 存在特異性調(diào)控位點(diǎn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，沉默CD147 表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MCT1 表達(dá)明顯降低。

綜上，宮頸癌組織中CD147 表達(dá)升高，抑制CD147 表達(dá)能明顯下調(diào)腫瘤細(xì)胞體外和體內(nèi)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。但能否將CD147 制成特異性探針用于診斷宮頸癌病情進(jìn)展仍需深入研究。