楊小峰，李建東，張利斌，趙志剛

（1.忻州師范學(xué)院 生物系，山西 忻州 034000；2.忻州師范學(xué)院 附屬中學(xué)，山西 忻州 034000）

黑糯玉米是山西省忻州市特產(chǎn)，中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品，備受人們青睞，在全國(guó)享有盛譽(yù)[1]。然而，黑玉米芯卻是廢棄物，被人們所丟棄。研究表明，黑玉米芯中含有纖維素、半纖維素、淀粉等多糖，經(jīng)過(guò)降解可作為微生物發(fā)酵的碳源，此外，黑玉米芯中富含花青素，而花青素具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫和預(yù)防腫瘤等保健功能[2-5]。

木糖醇是人體糖代謝的中間體，可以直接進(jìn)入人體細(xì)胞并參與新陳代謝，此過(guò)程不需要胰島素，因此血糖不會(huì)增高。木糖醇亦具有保護(hù)肝臟的作用，是糖尿病人和肝病患者理想的輔助治療劑和代糖品[6-7]。

醋酸飲品能促進(jìn)新陳代謝，調(diào)節(jié)酸堿平衡，消除疲勞[8]。劇烈運(yùn)動(dòng)后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，使人感覺(jué)酸痛疲勞，此時(shí)補(bǔ)充醋酸，能促進(jìn)代謝恢復(fù)，消除疲勞。醋酸飲品目前以果醋居多[9]。

試驗(yàn)以山西省忻州市特色農(nóng)產(chǎn)品黑糯玉米的芯（常被遺棄） 為研究對(duì)象，用乙醇提取其中的花青素。將脫色碎芯作為微生物發(fā)酵的碳源，經(jīng)醋酸菌發(fā)酵成飲品。此外，仍以黑玉米芯為原料制成的木糖醇作為調(diào)味劑，而非傳統(tǒng)的蔗糖，使得飲品可專(zhuān)供高血糖、糖尿病患者飲用。最后，將從黑玉米芯中提取的花青素按比例添加到飲品中，制備成口感較佳且極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的保健飲品。

1 材料與方法

1.1 材料

黑玉米，山西省忻州市玉米所提供；α - 淀粉酶（50 U/mg），邢臺(tái)萬(wàn)達(dá)生物工程提供；纖維素酶（400 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg），上海源葉生物科技有限公司提供；高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司提供；醋酸菌，康源生物科技有限公司提供。

1.2 試劑

檸檬酸（分析純）、碳酸氫鈉（分析純）、酚酞溶液、斐林試劑等。

1.3 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器表有限公司產(chǎn)品；電子天平，天津市天馬儀器廠產(chǎn)品；RE-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；WS70-1 型紅外快速干燥箱，鞏義市英峪予華儀器廠產(chǎn)品；752N 型分光光度計(jì)，上海儀器分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 提取花青素并制備木糖醇

將黑玉米芯粉碎至顆粒狀，浸入含75%乙醇的平底燒瓶（1 L） 中，加檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值為4.0，將平底燒瓶放入水浴鍋中，在60 ℃下回流提取2 次，每次8 h。布氏漏斗真空過(guò)濾后取濾液，60 ℃下將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上回收乙醇，得到花青素濃縮液[10-11]。

取粉碎后的黑玉米芯，加水（料液比1∶4），再加檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值為2.0，攪拌均勻后倒入圓底燒瓶中，于60 ℃下水浴；水浴結(jié)束后用布氏漏斗真空抽濾得玉米殘?jiān)?，將殘?jiān)磸?fù)水洗至中性（pH 值=7），向殘?jiān)屑铀两](méi)玉米碎芯，放入恒溫培養(yǎng)箱中55 ℃下發(fā)酵48 h；發(fā)酵完成后，向玉米碎芯中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的稀硫酸溶液，攪拌均勻后于100 ℃沸水中水浴4 h；降溫至80 ℃，一邊攪拌一邊加入飽和碳酸鈣水溶液，調(diào)節(jié)pH 值至中性；利用布氏漏斗真空抽濾，過(guò)濾掉玉米碎芯和硫酸鈣沉淀，得濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，回流、濃縮后得木糖醇[13-16]。

1.4.2 制備酶解液并檢驗(yàn)其中還原性糖

取黑玉米脫色碎心40 g，加入240 mL 的蒸餾水，升溫到70 ℃，用碳酸氫鈉將pH 值調(diào)節(jié)為6.5，加入0.5%的α - 淀粉酶水解2 h；降溫至45 ℃，用飽和檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至4.5，加入0.5%纖維素酶水解1.5 h；升溫到50 ℃，用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH 值至7～8，加入0.1%中性蛋白酶水解2 h，最后將其放到100 ℃沸水中，滅酶10 min。用布氏漏斗過(guò)濾，收集濾液，即酶解液。

配置斐林試劑：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH 溶液（甲液），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的CuSO4溶液（乙液）。將2 mL 甲液和4～5 滴乙液混合制成Cu（OH）2懸濁液。

取10 mL 酶解液，滴加斐林試劑，若待測(cè)液中有葡萄糖，則會(huì)看到磚紅色沉淀。可根據(jù)沉淀的量判斷酶解液中還原性糖的含量。

1.4.3 酒精發(fā)酵

（1） 干酵母活化。按照葡萄糖∶干酵母∶蒸餾水= 0.5∶1∶10 的比例標(biāo)準(zhǔn)，稱(chēng)取干酵母，加到蒸餾水中，然后再加入葡萄糖，于37 ℃的水浴中保持30 min，活化完成。將活化好的酵母液冷卻備用[17]。

（2） 單因素試驗(yàn)。取出100 mL 的酶解液，倒入250 mL 的錐形瓶中，然后放入高壓滅菌鍋中，于121 ℃下滅菌20 min，將其溫度降至室溫后加入10%的活化酵母，再放入溫度為30 ℃的恒溫箱中發(fā)酵7 d。

（3） 正交試驗(yàn)因素與水平。為了得到更好的玉米芯醋酸發(fā)酵工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以發(fā)酵溫度（A）、pH 值（B）、活化酵母接種量（C） 和發(fā)酵時(shí)間（D） 作為考查因素。

酒精發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.4.4 醋酸發(fā)酵

（1） 醋酸菌活化。將葡萄糖加入無(wú)菌水中加熱溶解，冷卻后加入無(wú)水乙醇制成液體活化培養(yǎng)基，后將菌粉（0.5 g/100 mL） 接入活化培養(yǎng)基中，于32 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，備用。

（2） 單因素試驗(yàn)。取出100 mL 的酒精發(fā)酵液，將其倒入250 mL 的錐形瓶中，在高壓滅菌鍋中，121 ℃下滅菌20 min。溫度降至室溫后加入10%的活化醋酸菌，再放入30 ℃的恒溫箱中發(fā)酵7 d。

（3） 正交試驗(yàn)因素與水平。經(jīng)過(guò)酒精發(fā)酵優(yōu)化后，為了確定較好的玉米芯醋酸發(fā)酵工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以酒精度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C） 和接種量（D） 作為考查因素[17]。

醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.4.5 調(diào)味并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)

加入5%花青素濃縮液進(jìn)行調(diào)色；按0.5%加鹽進(jìn)行調(diào)味，并抑制醋酸過(guò)度氧化；加入3%的木糖醇進(jìn)行調(diào)味。

參考NY/T 2987—2016，取50 mL 樣品于透明玻璃杯中，在自然光亮處由10 人進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。對(duì)4個(gè)方面分別進(jìn)行評(píng)分，總分為100 分，記錄評(píng)分結(jié)果，計(jì)算平均值。

感官評(píng)價(jià)評(píng)分細(xì)則見(jiàn)表3。

表3 感官評(píng)價(jià)評(píng)分細(xì)則

1.4.6 指標(biāo)測(cè)定方法

參照GB 5009.266—2016 酒精計(jì)法測(cè)定酒精含量，參照GB 5009.239—2016 酸度法測(cè)定總酸度（以醋酸計(jì)），分別參照國(guó)標(biāo)GB 4789.2—2010 和GB 4789.3—2010 測(cè)定菌落總數(shù)和大腸桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 花青素和木糖醇的提取量

40 g 的黑糯玉米芯在上述條件下可提取出大約4 mL 的花青素濃縮液，40 g 的黑糯玉米芯在上述條件下可提取出大約10 mL 的木糖醇濃縮液。

2.2 酶解液中還原性糖的檢測(cè)

經(jīng)過(guò)斐林試劑檢測(cè)，酶解液中出現(xiàn)大量磚紅色沉淀，表明酶解率較高。

2.3 酒精發(fā)酵的優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

酒精發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4 可知，該酒精發(fā)酵的4 個(gè)因素中，較好的因素水平為A2B2C3D1，即溫度為30 ℃，pH 值為4.5，接種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為5 d，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次為初始pH 值＞接種量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間，以A2B2C3D1組合重復(fù)試驗(yàn)2 次，得到酒精度為7.01%Vol。

2.4 醋酸發(fā)酵的優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5 可知，該醋酸發(fā)酵的4 個(gè)因素中，較好的因素水平為A3B1C3D2，即酒精度為7.01%Vol，發(fā)酵時(shí)間為5 d，發(fā)酵溫度為32 ℃，接種量為10%，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次為酒精度＞接種量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間，以A3B1C3D2組合重復(fù)試驗(yàn)2 次，得到平均醋酸度為6.27 g/100 mL。

2.5 口感測(cè)評(píng)結(jié)果

口感測(cè)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 口感測(cè)驗(yàn)結(jié)果

由表6 可知，該醋酸發(fā)酵的4 個(gè)因素中，能觀察出試驗(yàn)7 是最好的，口感較佳、酸甜適中，且有淡淡的玉米清香。

2.6 理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)

醋酸發(fā)酵飲品總酸為6.27 g/100 mL，符合NY/T 2987—2016 和GB/T 30844—2014 中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

飲品中檢出菌落總數(shù)3.4 CFU/g，大腸桿菌未檢出，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求[18]。

3 結(jié)論

酒精發(fā)酵與醋酸發(fā)酵是醋酸飲品釀造的重要環(huán)節(jié)，試驗(yàn)以黑糯玉米芯作為原料，對(duì)其中花青素的提取和酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵進(jìn)行了工藝參數(shù)優(yōu)化?；ㄇ嗨靥崛÷瘦^高條件為75%乙醇，溫度60 ℃，pH 值4.0；酒精發(fā)酵最優(yōu)條件為溫度30 ℃，pH 值4.5，接種量10%，發(fā)酵時(shí)間5 d，得到酒精度7.01%Vol；醋酸發(fā)酵最佳條件為酒精度7.01%Vol，發(fā)酵溫度32 ℃，接種量10%，發(fā)酵時(shí)間5 d。此外，飲品以提取出的花青素為添加劑，增強(qiáng)了其保健功效；以提取的木糖醇為調(diào)味劑，而非傳統(tǒng)的蔗糖，使得飲品可專(zhuān)供高血糖及糖尿病患者飲用。