熊志勇，王 磊，魏永春，馬文英

（北京理工大學(xué)珠海學(xué)院材料與環(huán)境學(xué)院，廣東珠海 519088）

0 引言

近年來(lái)，全球食品安全惡性事件頻發(fā)，成為影響公共健康的重要因素，食品安全問(wèn)題越來(lái)越成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)，其中，食源性致病菌是危害食品安全和人類(lèi)健康的主要因素[1-3]。因食用水產(chǎn)品引起爆發(fā)性食物中毒也頻繁發(fā)生，水產(chǎn)品中常見(jiàn)病原菌檢測(cè)品種有副溶血弧菌、單增李斯特氏菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等。這些致病菌可引起劇烈嘔吐、腹瀉、頭痛、發(fā)熱，嚴(yán)重者常有脫水、全身痙攣、神志不清、血壓下降等休克癥狀而危及生命。因此，建立針對(duì)水產(chǎn)品中致病微生物的有效檢測(cè)體系，快速并且準(zhǔn)確地完成對(duì)食品中致病菌的檢測(cè)已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關(guān)鍵。

這些致病微生物常規(guī)檢測(cè)方法需要分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)等多個(gè)步驟，檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、靈敏度低，而且每次只能檢測(cè)出一種致病菌。其靈敏度也受雜菌干擾的一定影響，存在一定的假陰性，且無(wú)法對(duì)人工難以培養(yǎng)的病原微生物進(jìn)行檢測(cè)，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足現(xiàn)代檢測(cè)要求。

隨著分子生物學(xué)發(fā)展，在分子生物學(xué)水平基礎(chǔ)上建立的檢測(cè)技術(shù)逐步成為食品中致病菌的檢測(cè)方法。如DNA 指紋圖譜、免疫捕獲、分型技術(shù)、菌落雜交、PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、基因芯片等，也已經(jīng)顯示出它在食源性致病菌檢測(cè)方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。其中PCR 方法該技術(shù)具有高效、高產(chǎn)、低成本、速度快等優(yōu)點(diǎn)，有較好的可操作性，目前已在多種致病性微生物的檢測(cè)中得到應(yīng)用[4-8]。

針對(duì)水產(chǎn)品常見(jiàn)致病性微生物副溶血性弧菌耐熱溶血毒素tlh 基因及其毒力基因trh 和tdh 基因、單增李斯特菌溶血素hly 基因、沙門(mén)氏菌invA 基因和大腸桿菌O157 rfbe、stx 1 和stx 2 基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物，建立能快速同時(shí)一體化檢測(cè)該常見(jiàn)4 種致病性微生物的PCR 反應(yīng)體系。從特異性和靈敏度方面對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，并將其直接應(yīng)用于水產(chǎn)品樣品中進(jìn)行的實(shí)際檢測(cè)。同時(shí)，也為PCR 技術(shù)應(yīng)用到其他致病菌的高效檢測(cè)奠定了一定的基礎(chǔ)，為開(kāi)展病原菌的早期預(yù)警、監(jiān)測(cè)、分析和調(diào)查發(fā)揮積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

58 株標(biāo)準(zhǔn)菌株，武漢工程大學(xué)提供。包括金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、小腸結(jié)膜炎耶爾森菌亞種和銅綠假單胞菌。

1.1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；ZHWY-2102 型雙層大容量全溫度恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；HC-2518R 型高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-6C 型電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；Tocan240 型凝膠成像系統(tǒng)；TC-96HBPCR 型擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；UV-7504 型單光束紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品；DS-1 型高速組織搗碎機(jī)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基

細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒（硅膠膜離心柱法）、Bst DNA 聚合酶、10×ThermoPol Reaction buffer、10 mmol/L dNTPs，廣州東盛生物科技有限公司提供；新鮮海帶，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

副溶血性弧菌選擇性培養(yǎng)基，青島海博生物公司提供；大腸桿菌O157 選擇性培養(yǎng)基，CHROmagar公司提供；沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基（SS），上海科興商貿(mào)有限公司提供。

單增李斯特菌選擇性培養(yǎng)基：蛋白胨15.0 g，酵母膏粉5.0 g，瓊脂15.0 g，氯化鈉5.0 g，色素2.3 g，抑制劑5.0 g，去離子水（平板） 1 L。

3%氯化鈉堿性蛋白胨水：氯化鈉5 g，硝酸鉀0.1 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 L，加熱溶解。

LB 肉湯液體培養(yǎng)基：LB 肉湯21 g，蒸餾水1 L，加熱溶解。

LB 肉湯固體培養(yǎng)基：1 L LB 肉湯液體培養(yǎng)基加15 g 技術(shù)瓊脂粉。

單增李斯特菌選擇性培養(yǎng)基、LB 肉湯、技術(shù)瓊脂粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

稱(chēng)取LB 肉湯21 g 溶于1 L 蒸餾水中，加熱溶解，分裝，于121 ℃下滅菌，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基備用。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，按5%的接種量向已滅菌的培養(yǎng)基中加菌種母液，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

1.2.2 試驗(yàn)菌株的篩選

將58 株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種到副溶血性弧菌選擇性培養(yǎng)基、沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基、單增李斯特菌選擇性培養(yǎng)基和大腸桿菌O157 選擇性培養(yǎng)基中，于37 ℃下靜置培養(yǎng)48 h，篩選出試驗(yàn)所需4 種菌株。

1.2.3 DNA 模板的提取

（1） 試劑盒法。根據(jù)細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA。

（2） 水煮法。取過(guò)夜培養(yǎng)的菌懸液1 mL 加到1.5 mL 無(wú)菌離心管中，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心2 min，盡量吸棄上清，加入50 μL 洗脫液TE，混勻后沸水浴5 min，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心5 min，取上清-20 ℃下保存。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，檢索GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/472320310） 中已公布的副溶血性弧菌tlh 基因、單增李斯特菌溶血素hly 基因、沙門(mén)氏菌invA 基因和大腸桿菌O157 rfbe、stx 1 和stx 2 基因序列，利用PrimerExplorer V4 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)LAMP 引物，將2 條外引物F3、B3 用于試驗(yàn)PCR 體系，并將設(shè)計(jì)好的引物與Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，保證4 種食源性致病微生物引物的高度特異性。

3 種致病性微生物靶基因及其引物序列見(jiàn)表1。

表1 3 種致病性微生物靶基因及其引物序列

1.2.5 PCR 反應(yīng)體系建立

PCR 擴(kuò)增體系選取50 μL，2×TaqPCRMasterMix（含染料） 25 μL，引物F 2 μL，引物B 2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。

由于選擇擴(kuò)增目的片段小，擴(kuò)增所需時(shí)間短，因此設(shè)定反應(yīng)程序：94 ℃，5 min；94 ℃～30 s，55 ℃～30 s，72 ℃～30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.6 PCR 反應(yīng)特異性與靈敏度試驗(yàn)

將1.2.2 篩選出的全部試驗(yàn)菌株進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，添加相應(yīng)的引物。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，對(duì)該方法的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)，以水為模板作陰性對(duì)照。其中，溶血弧菌引物的測(cè)試菌株包括副溶血弧菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌共20 株；單核細(xì)胞增生李斯特菌引物的測(cè)試包括單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌共20 株；沙門(mén)菌引物的測(cè)試菌株包括沙門(mén)菌、蠟樣芽胞桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌亞種共20 株；大腸桿菌引物的測(cè)試菌株包括大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌共20 株。

以副溶血性弧菌作為試驗(yàn)菌株測(cè)定反應(yīng)體系的靈敏度，使用單束光紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，之后，以10 倍倍比稀釋DNA 原液至1×10-1～1×10-9，取各稀釋梯度DNA 溶液2 μL 作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行LAMP 檢測(cè)。同時(shí)，以水為模板，作為陰性對(duì)照。

1.2.7 多檢測(cè)靶點(diǎn)同步PCR 試驗(yàn)

在優(yōu)化PCR 反應(yīng)體系后，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)針對(duì)8 個(gè)靶點(diǎn)同步檢測(cè)的一體化系統(tǒng)。通過(guò)將58 株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別針對(duì)其8 個(gè)靶點(diǎn)在同一PCR 程序中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 儀為96 孔，一次可同時(shí)檢測(cè)12 株菌，以考查菌株一體化檢測(cè)特異性。

1.2.8 人工污染海產(chǎn)品樣品靈敏度試驗(yàn)

以4 種菌株作為試驗(yàn)菌株測(cè)定模擬樣品的靈敏度。海帶25 g 加入到3%氯化鈉堿性蛋白胨225 mL中，于DS-1 型高速組織搗碎機(jī)中勻漿約60 s，制成海帶勻漿。將待接種的菌液等梯度稀釋?zhuān)瑹o(wú)菌操作取1×10-1～1×10-9每個(gè)梯度稀釋純菌培養(yǎng)液1 mL 分別加入到9 mL 的海帶勻漿中混勻。人工污染的各稀釋梯度勻漿分別取1.0～1.5 mL 無(wú)菌離心管中，以轉(zhuǎn)速3 000 r/m 離心5 min，吸取上清液到另一支1.5 mL無(wú)菌離心管中，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心5 min，盡量吸棄上清液，沉淀用0.9%無(wú)菌生理鹽水1 mL 重新懸浮，按1.2.2（2） 水煮法提取DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。同時(shí)，以未染菌的海帶勻漿為模板進(jìn)行擴(kuò)增，作為陰性對(duì)照，并做平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)菌株篩選

經(jīng)過(guò)4 種選擇培養(yǎng)基的篩選，從58 株標(biāo)準(zhǔn)菌株中篩選出的目的菌株，副溶血經(jīng)弧菌8 株、李斯特菌10 株、沙門(mén)氏菌9 株及大腸桿菌6 株。挑選出供后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 特異性與靈敏度檢測(cè)

結(jié)果顯示，以tlh、tdh、trh 基因設(shè)計(jì)的副溶血性弧菌引物，對(duì)8 株副溶血性弧菌結(jié)果呈陽(yáng)性，而對(duì)其他12 株對(duì)比菌株擴(kuò)增結(jié)果呈陰性（見(jiàn)圖1）；以hly 基因設(shè)計(jì)的單增李斯特菌引物，對(duì)10 株單增李斯特菌擴(kuò)增結(jié)果呈陽(yáng)性，對(duì)其他大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等對(duì)照菌株結(jié)果呈陰性（見(jiàn)圖2）；以invA 基因設(shè)計(jì)的沙門(mén)氏菌引物，對(duì)9 株沙門(mén)氏菌擴(kuò)增結(jié)果呈陽(yáng)性，對(duì)其他11 株對(duì)比菌株擴(kuò)增結(jié)果呈陰性（見(jiàn)圖3）；對(duì)6 株大腸桿菌O157 擴(kuò)增結(jié)果呈陽(yáng)性，對(duì)其他14 株對(duì)比菌株擴(kuò)增結(jié)果呈陰性（見(jiàn)圖4，圖中顯示為rfbe 基因擴(kuò)增結(jié)果，stx 1、stx 2 擴(kuò)增結(jié)果圖略）。針對(duì)4 種菌株的6 對(duì)引物對(duì)目的菌株檢出率為100%，對(duì)非目標(biāo)菌株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，研究結(jié)果表明，檢測(cè)方法特異性為100%。

副溶血弧菌特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，單增李斯特菌特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，沙門(mén)氏菌特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，大腸桿菌O157 特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖1 副溶血弧菌特異性檢測(cè)結(jié)果

圖2 單增李斯特菌特異性檢測(cè)結(jié)果

圖3 沙門(mén)氏菌特異性檢測(cè)結(jié)果

圖4 大腸桿菌O157 特異性檢測(cè)結(jié)果

于37 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)的副溶血性弧菌懸浮菌液，經(jīng)平板細(xì)胞計(jì)數(shù)得出，細(xì)胞起始菌落總數(shù)為2.07×108CFU/mL，以10 倍梯度進(jìn)行菌液稀釋?zhuān)迷噭┖蠨NA 提取法，對(duì)菌液進(jìn)行DNA 提取，進(jìn)行PCR 靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)。

PCR 靈敏度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5 可知，當(dāng)菌液菌落總數(shù)為2.07×102～2.07×108CFU/mL 時(shí)，都進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增，菌落總數(shù)少于2.07×102CFU/mL 沒(méi)有PCR 擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，由于DNA 提取的體系是50 μL，其中只用2 μL作為PCR 反應(yīng)的模板，所以試驗(yàn)方法建立的PCR 反應(yīng)體系的檢測(cè)靈敏度為8.28×101CFU/mL。

圖5 PCR 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2.3 多靶點(diǎn)同步PCR 檢測(cè)

利用PCR 儀，針對(duì)8 個(gè)靶點(diǎn)可一次同時(shí)檢測(cè)12 株菌。結(jié)果顯示該試驗(yàn)選用的58 株標(biāo)準(zhǔn)菌株利用本試驗(yàn)建立的PCR 程序同步檢出率為100%，表明建立的簡(jiǎn)易PCR 體系，可用于多位點(diǎn)多菌株的同步檢測(cè)。在將來(lái)新一代324 孔PCR 儀中，將可能對(duì)40 個(gè)水產(chǎn)品的8 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行同步檢測(cè)，極大地提高檢測(cè)效率。

2.4 人工污染海產(chǎn)品樣品的靈敏度檢測(cè)

待接種的副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802，經(jīng)平板計(jì)數(shù)，其菌落總數(shù)為4×107CFU/mL。取10 倍倍比稀釋1×10-1～1×10-91 mL 菌液接入9 mL 海帶勻漿中，混勻作為人工污染海產(chǎn)品樣品原樣，使得人工污染海產(chǎn)品樣品原樣中副溶血弧菌菌落總數(shù)為4×107CFU/mL（9 mL 海帶勻漿相當(dāng)于1 g 海帶）。人工污染后，各取1 mL 海帶勻漿提取DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

人工污染副溶血弧菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測(cè)見(jiàn)圖6。

圖6 人工污染副溶血弧菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測(cè)

由圖6 可知，人工污染海產(chǎn)品樣品中菌含量為4×106～4×103CFU/mL 時(shí)，均發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生擴(kuò)增片段，當(dāng)菌落總數(shù)為4×102CFU/mL 時(shí)，不產(chǎn)生片段，擴(kuò)增反應(yīng)不發(fā)生。因此，判定該法直接檢測(cè) 食品樣品中的副溶血性弧菌的檢測(cè)限為4×103CFU/mL。

待接種的單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 19118，經(jīng)平板計(jì)數(shù)，其菌落總數(shù)為2.14×109CFU/mL。取10 倍倍比稀釋1×10-1～1×10-91 mL 菌液接入9 mL海帶勻漿中，混勻作為人工污染海產(chǎn)品樣品原樣，使得人工污染海產(chǎn)品樣品原樣中單增李斯特菌為2.14×109CFU/mL（9 mL 海帶勻漿相當(dāng)于1 g 海帶）。人工污染后，各取1 mL 海帶勻漿提取DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

人工污染單增李斯特菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測(cè)見(jiàn)圖7。

圖7 人工污染單增李斯特菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測(cè)

由圖7 可知，人工污染海產(chǎn)品樣品中菌落總數(shù)為2.14×109～2.14×103CFU/mL 時(shí)，均發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生擴(kuò)增片段，當(dāng)菌落總數(shù)為2.14×102CFU/mL時(shí)，不產(chǎn)生片段，擴(kuò)增反應(yīng)不發(fā)生。因此，判定該法直接檢測(cè)食品樣品中的副溶血性弧菌的檢測(cè)限為2.14×103CFU/mL。

待接種的沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29269，經(jīng)平板計(jì)數(shù)，其菌落總數(shù)為8×107CFU/mL。取10 倍倍比稀釋1×10-1～1×10-91 mL 菌液接入9 mL 海帶勻漿中，混勻作為人工污染海產(chǎn)品樣品原樣，使得人工污染海產(chǎn)品樣品原樣中單增李斯特菌為8×107CFU/mL（9 mL 海帶勻漿相當(dāng)于1 g 海帶）。人工污染后，各取1 mL 海帶勻漿提取DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

人工污染沙門(mén)氏菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測(cè)見(jiàn)圖8。

圖8 人工污染沙門(mén)氏菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測(cè)

由圖8 可知，人工污染海產(chǎn)品樣品中菌落總數(shù)為8×107～8×104CFU/mL 時(shí)，均發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生擴(kuò)增片段，當(dāng)菌落總數(shù)為8×103CFU/mL 時(shí)，不產(chǎn)生片段，擴(kuò)增反應(yīng)不發(fā)生。因此，判定該法直接檢測(cè)食品樣品中的副溶血性弧菌的檢測(cè)限為8×104CFU/mL。

待接種的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43895，經(jīng)平板計(jì)數(shù)，其菌落總數(shù)為1.07×109CFU/mL。取10 倍倍比稀釋1×10-1～1×10-91 mL 菌液接入9 mL 海帶勻漿中，混勻作為人工污染海產(chǎn)品樣品原樣，使得人工污染海產(chǎn)品樣品原樣中單增李斯特菌為1.07×109CFU/mL（9 mL 海帶勻漿相當(dāng)于1 g 海帶）。人工污染后，各取1 mL 海帶勻漿提取DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

人工污染大腸桿菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測(cè)見(jiàn)圖9。

圖9 人工污染大腸桿菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測(cè)

由圖9 可知，人工污染海產(chǎn)品樣品中菌落總數(shù)為1.07×109～1.07×103CFU/mL 時(shí)，均發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生擴(kuò)增片段，當(dāng)菌落總數(shù)為1.07×102CFU/mL時(shí)，不產(chǎn)生片段，擴(kuò)增反應(yīng)不發(fā)生。因此，判定該法直接檢測(cè)食品樣品中的副溶血性弧菌的檢測(cè)限為1.07×103CFU/mL。

3 結(jié)論

常規(guī)的分離培養(yǎng)和生化鑒定耗時(shí)長(zhǎng)，且靈敏度偏低，容易發(fā)生錯(cuò)檢和漏檢，不利于食源性突發(fā)疫情的快速診斷處置。PCR 技術(shù)相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)法和免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光法等，其特異性更強(qiáng)、靈敏度更高、操作更為簡(jiǎn)便快捷，已在食源性疾病病原檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[9-10]。

針對(duì)水產(chǎn)品中常見(jiàn)的4 種致病性微生物副溶血性弧菌、單增李斯特菌和沙門(mén)氏菌和大腸桿菌O157進(jìn)行研究，對(duì)其特異性高度保守基因設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行多靶點(diǎn)同步PCR 檢測(cè)，結(jié)果表明，目標(biāo)菌株擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性，特異性為100%，且具有較高的靈敏度，基因組DNA 的檢測(cè)限約為8.28×101CFU/mL，直接對(duì)水產(chǎn)品樣品的靈敏度檢測(cè)分別為4×103CFU/mL、2.14×103CFU/mL、8×104CFU/mL 和1.07×103CFU/mL，同前人所用PCR 方法只對(duì)一種菌株進(jìn)行檢測(cè)的靈敏度相近[11-12]，表明該方法具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

系統(tǒng)全面地分析了水產(chǎn)品中常見(jiàn)的4 種致病性微生物的PCR 檢測(cè)分析方法，對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)，并針對(duì)每種菌分別模擬真實(shí)食品體系，對(duì)該方法的實(shí)用性進(jìn)行檢測(cè)；研究選取的擴(kuò)增片段小，每個(gè)循環(huán)所需時(shí)間較短，每個(gè)PCR 擴(kuò)增程序僅為30 s，且設(shè)計(jì)的8 對(duì)引物長(zhǎng)度相近，因此可設(shè)定相同的PCR 退火溫度，所有目的菌株同時(shí)在相同PCR 程序下進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)多種菌株一體化同步檢測(cè)；試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的該檢測(cè)方法具有很強(qiáng)的特異性和較高的靈敏度，且在食品體系檢測(cè)中也具有較高靈敏度，表明該方法具有一定實(shí)用價(jià)值；設(shè)計(jì)的8 對(duì)引物具有高度特異性和靶向性，可用于其他檢測(cè)方法對(duì)上述幾種菌檢測(cè)的參考引物；研究采用的靶點(diǎn)具有高度特異性，該靶點(diǎn)可推廣至其他檢測(cè)方法中應(yīng)用，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)法、多重PCR 及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP） 等方法[13-15]。

建立的快速檢測(cè)方法更加有利于實(shí)現(xiàn)一體化同步檢測(cè)，為快速檢測(cè)多種食源性致病性微生物提供了平臺(tái)，具有較強(qiáng)的實(shí)用意義和推廣價(jià)值，對(duì)于提高食品衛(wèi)生水平、保證食品安全和推動(dòng)食品國(guó)際貿(mào)易發(fā)展具有重要的意義。