陳芳榮，毛東瑞，陳小菊

（海南省人民醫(yī)院，海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院 產(chǎn)科，海南 海口 570311）

子癇前期（preeclampsia， PE）是一種妊娠期特發(fā)性疾病，以孕期出現(xiàn)高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕卣?，?guó)外文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)病率和死亡率分別占孕婦的5%～7%［1］。成功的妊娠在很大程度上取決于母胎界面上獨(dú)特的免疫微環(huán)境［2］。胎兒來(lái)源的滋養(yǎng)細(xì)胞、孕婦蛻膜基質(zhì)細(xì)胞與孕婦蛻膜免疫細(xì)胞共同構(gòu)成母胎界面［3］。滋養(yǎng)細(xì)胞形成胎盤(pán)的胎兒部分，其功能障礙被證實(shí)與PE 的發(fā)病密切相關(guān)［4］。巨噬細(xì)胞是蛻膜中數(shù)量第二的免疫細(xì)胞，在妊娠期參與先天性子宮免疫、胚胎著床、胎盤(pán)形成和分娩起始，對(duì)于維持妊娠時(shí)期母胎界面的正常微環(huán)境起到重要的作用［5］。然而，巨噬細(xì)胞對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的具體作用尚不明確。作為一種細(xì)胞外囊泡，外泌體通過(guò)其包含的核酸、脂質(zhì)和蛋白等活性物質(zhì)，參與胎兒與孕婦物質(zhì)交換［6］。研究表明，蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體可以通過(guò)介導(dǎo)微小RNA（miRNA）調(diào)控妊娠疾?。?］，但該類(lèi)外泌體在PE 中作用尚未清晰。本研究將驗(yàn)證蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體中的miR-146a-5p對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的調(diào)控作用，及其相關(guān)分子機(jī)制，為PE分子調(diào)控機(jī)制深入理解提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2021 年1 月～2021 年12 月在海南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的PE 患者15 例（診斷及分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)謝幸主編第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》）作為PE 組，正常妊娠孕婦15 例為正常對(duì)照組。PE 組與正常組患者的年齡、孕周等一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)表1）。未曾患過(guò)高血壓、糖尿病、肝炎、甲亢、感染等內(nèi)外科疾病，無(wú)妊娠其他并發(fā)癥，無(wú)服用免疫抑制藥物史，且均為單胎妊娠首次剖宮產(chǎn)分娩。本研究經(jīng)過(guò)海南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（醫(yī)倫研［2021］300 號(hào)），并簽署了患者知情同意書(shū)。

表1 兩組患者一般資料比較（n=15）Tab 1 General data comparison between the two groups（n=15）

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)基（C11875500BT）、胎牛血清FBS（30044333）、青霉素/鏈霉素（15070063）購(gòu)于Gibco；外泌體RNA 純化試劑盒（EZB-exo-RN1）購(gòu)自美國(guó)EZBioscience 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（P312）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q331）購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；CCK8 檢測(cè)試劑購(gòu)于MedChemExpress公 司；CD14（ab221678）、CD63（ab134045）、HIF1α（ab179483）和GAPDH（ab181602 ）一抗購(gòu)于Abcam；HRP-羊抗兔IgG（BA1054）購(gòu)于博士德生物科技有限公司。HTR8/Snveo 和293T 細(xì)胞均購(gòu)買(mǎi)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛻膜巨噬細(xì)胞分離和原代培養(yǎng) 在兩組患者的胎盤(pán)娩出后立即刮取胎盤(pán)母面上的蛻膜組織，使用預(yù)冷的無(wú)菌PBS 沖洗干凈，將組織剪碎過(guò)濾，采用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。使用密度梯度法離心分離得到單個(gè)核細(xì)胞，接著采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行CD14 陽(yáng)性細(xì)胞分選，進(jìn)而獲得巨噬細(xì)胞。使用包括10%胎牛血清，100 mg/L 青霉素和鏈霉素的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37.5 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.3.2 外泌體分離 培養(yǎng)蛻膜巨噬細(xì)胞48 h 后，4 ℃， 1 2377 r/min 離心20 min，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清液至新試管。加入1/4 體積的ExoQuick Solution（購(gòu)自美國(guó)System Biosciences 公司），混勻置于4 ℃孵育2 h， 接著1 500 g 離心30 min，去除上清液，繼續(xù)離心5 min 去除殘留液體，最后使用無(wú)核酸酶水重懸外泌體。

1.3.3 巨噬細(xì)胞外泌體鑒定 使用透射電鏡拍照記錄外泌體粒徑長(zhǎng)度與外形。采用western blot 驗(yàn)證CD63 蛋白表達(dá)量。

1.3.4 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活性 滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8-Svneo 使用RPMI 1640 添加10% FBS 和1%青霉素/鏈霉素培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滋養(yǎng)細(xì)胞，以1 000個(gè)/孔密度接種于96 孔板中培養(yǎng)。按100 mg/L 的外泌體濃度將PE 組與對(duì)照組收集的外泌體加入到滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基中。在共培養(yǎng)的第1，2，3，4 和5天，分別每孔加入10 μL CCK8 溶液置于培養(yǎng)箱靜置2 h，放在酶標(biāo)儀中測(cè)量OD450 的OD 值。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 復(fù)孔進(jìn)行。

1.3.5 Transwell 檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滋養(yǎng)細(xì)胞，以1×104個(gè)/100 μL 密度接種于6 孔板的上層小室，下層加入800 μL 含 PE 或?qū)φ战M外泌體的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基。上層加入無(wú)血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后下層細(xì)胞使用1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色30 min 后用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。

1.3.6 qPCR 檢測(cè)外泌體中miR-146a-5p 表達(dá) 外泌體RNA 提取使用外泌體 RNA 純化試劑盒（BHS63743， 上海博湖生物科技有限公司）分別從兩組細(xì)胞上清分離的外泌體中提取RNA 后qPCR 檢測(cè)miR-146a-5p。用NanoDrop 2000 （美國(guó)賽默飛）評(píng)估提取RNA 的濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在ABI 7500qPCR 儀上進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 s，62 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸30 s， 40 個(gè)循環(huán)。以U6 基 因 為 內(nèi) 參，采 用2-ΔΔct法 計(jì) 算PE 組 相 對(duì) 于 正 常組中miR-146a-5p 的表達(dá)量。miR-146a-5p 上游引物 ：5＇- ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCA-3＇， 下游引物：5＇TGGTGTCGTGGAGTCG-3＇； U6 上 游 引 物：5＇CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇，下 游 引 物：5＇AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。

1.3.7 western blot 檢測(cè)外泌體中CD63 與滋養(yǎng)細(xì)胞中HIF1α 表達(dá) 使用添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液提取外泌體中總蛋白或外泌體處理后滋養(yǎng)細(xì)胞總蛋白，使用BCA 法測(cè)定蛋白樣品濃度和純度，接著進(jìn)行上樣、電泳及轉(zhuǎn)PVDF 膜操作，分別加入稀釋后的CD63，HIF1α、GAPDH 一抗置于4 ℃孵育過(guò)夜，第2 天TBST 洗滌PVDF 膜后加羊抗兔IgG 二抗，在37 ℃條件下孵育1 h，ECL 顯色，暗室曝光、拍照并將圖片進(jìn)行灰度分析。

1.3.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 根據(jù)Genebank收錄HIF1α 基因序列，利用引物分析軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)針對(duì)HIF1α-UTR 引物，以293T 細(xì)胞基因組DNA 為模板行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物連接到攜帶螢火蟲(chóng)熒光與海腎熒光的載體中，得到野生型HIF1α 載體（HIF1α-WT），根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，將結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)镚CGGACA，構(gòu)建得到突變熒光素酶載體（HIF1α-MUT），使用lipofectamineTM3000，將 上 述 質(zhì) 粒 和miR-146a-5p mimic 或mimic control 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞48 h，采用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光值與海腎熒光值，并計(jì)算各組相對(duì)螢火蟲(chóng)熒光值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體鑒定

透射電鏡結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞源性外泌體形態(tài)為直徑30～130 nm 的中間凹陷的“餅狀”結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1。CD63 蛋白表達(dá)結(jié)果表達(dá)，巨噬細(xì)胞不表達(dá)外泌體標(biāo)記蛋白CD63（0.02±0.00），而巨噬細(xì)胞源性外泌 體 中CD63 表 達(dá) 顯 著 較 高（86.88±18.27，P＜0.001），見(jiàn)圖2。以上結(jié)果表明，分離的巨噬細(xì)胞源性外泌體符合外泌體的特征，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 電鏡觀察蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體形態(tài)Fig 1 The morphology of exosomes of decidual macrophages observed by electron microscopy

圖2 western blot 檢測(cè)CD63 蛋白表達(dá)Fig 2 Detection of CD63 protein expression by Western blot

2.2 巨噬細(xì)胞源性外泌體抑制滋養(yǎng)細(xì)胞活力和遷移

CCK8 檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組顯著抑制滋養(yǎng)細(xì)胞活力，在第五天時(shí)實(shí)驗(yàn)組（1.916±0.12）相對(duì)正常對(duì)照組（1.30±0.06）差異更顯著（t=10.23，P＜0.001），見(jiàn)圖3A。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的滋養(yǎng)細(xì)胞遷移數(shù)（115.3±3.51）較對(duì) 照 組（212.3±5.03）顯 著 下 降（t=27.37，P＜0.001），見(jiàn)圖3B。這提示PE 蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體降低滋養(yǎng)細(xì)胞的活性和遷移能力。

圖3 蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體抑制滋養(yǎng)細(xì)胞活力和遷移Fig 3 Exosomes from decidual macrophages suppressed the proliferation and migration of trophoblast cells

2.3 qPCR 檢測(cè)外泌體中miR-146a-5p 表達(dá)

qPCR 結(jié)果顯示，同對(duì)照組相比（3.45±0.20），實(shí)驗(yàn)組miR-146a-5p 的相對(duì)表達(dá)顯著下降（1.00±0.09，t=19.48，P＜0.001），見(jiàn)圖4A。

圖4 miR-146a-5p 靶向調(diào)控HIF1αFig 4 miR-146a-5p binds directly to HIF1α

2.4 western blot 檢測(cè)外泌體處理滋養(yǎng)細(xì)胞中HIF1α 蛋白表達(dá)

外泌體處理滋養(yǎng)細(xì)胞后檢測(cè)HIF1α 蛋白表達(dá)結(jié)果表明，PE 蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體處理滋養(yǎng)細(xì)胞后HIF1α 蛋白表達(dá)量顯著增加（0.43±0.21vs.0.03±0.02，t=9.40，P＜0.001），見(jiàn)圖4B、4C。

2.5 miR-146a-5p 與HIF1α 結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)

通 過(guò)RNAhybrid 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p和 HIF1α之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)（WT），根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變型（MUT），見(jiàn)圖4D。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明，miR-146a-5p mimic 減少HIF1α-WT熒光素酶活性（0.42±0.03vs.1.02±0.04，t=19.69，P＜0.001），而對(duì)HIF1α-MUT 熒光素酶活性無(wú)明顯影響（1.05±0.10vs.1.03±0.09，t=0.17，P=0.88），見(jiàn)圖4E。以上結(jié)果提示，miR-146a-5p 與HIF1α 存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，負(fù)性調(diào)控HIF1的蛋白表達(dá)。

3 討論

作為母胎界面母體來(lái)源的重要組成部分，孕婦蛻膜組織是聯(lián)系胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞的橋梁，是完成正常妊娠功能與平衡孕婦與胎兒免疫功能的關(guān)鍵［8］。巨噬細(xì)胞作為妊娠期重要免疫細(xì)胞，具有吞噬、抗原提呈、分泌細(xì)胞活性因子等功能，是維持妊娠與免疫穩(wěn)定的關(guān)鍵免疫細(xì)胞之一［9］。滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與遷移能力的異?？桑?0］。但蛻膜巨噬細(xì)胞是否對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞具有調(diào)控作用，以及其參與調(diào)控子癇前期的分子機(jī)制尚不清楚。

外泌體是一種直徑為30～100 nm 的胞外囊泡，內(nèi)含DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA 等活性物質(zhì)，在不同細(xì)胞和組織之間的信號(hào)傳遞和物質(zhì)運(yùn)輸中起著重要作用［11］。分泌外泌體的細(xì)胞不同，會(huì)給外泌體帶來(lái)不同的功能，可以影響細(xì)胞增殖、侵襲、分化和免疫等［12］。例如，M2 型巨噬細(xì)胞分泌的外泌體緩解肥胖小鼠中的炎癥反應(yīng)并改善對(duì)胰島素的敏感性［13］。

存在于母胎界面的外泌體是母胎間信息交流的載體，在妊娠維持、PE 等正常和病理妊娠過(guò)程中都發(fā)揮重要的作用［14］。巨噬細(xì)胞通過(guò)外泌體調(diào)控胎盤(pán)釋放抗炎細(xì)胞因子，抑制母體炎癥和感染的反應(yīng)，從而防止對(duì)胎兒的傷害［15］。本研究中，我們分離PE 和正常妊娠蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體，將其和滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)PE 組蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體處理組相對(duì)對(duì)照組顯著抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的活力和遷移能力，表明PE 蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體可能通過(guò)降低滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與遷移能力，參與PE的發(fā)生、發(fā)展。

miRNA 可以調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成［16］。miR-146a 已被報(bào)道參與免疫調(diào)控、神經(jīng)發(fā)生、腫瘤發(fā)生發(fā)展、血管形成等［17］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a-5p 通過(guò)抑制TRAF6/NF-KB 信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子［18］。本研究中，通過(guò)提取PE 與正常蛻膜組織巨噬細(xì)胞組外泌體，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PE 組外泌體中miR-146a-5p 表達(dá)下調(diào)，并且這種變化與滋養(yǎng)細(xì)胞活力與遷移變化相關(guān)，因此認(rèn)為miR-146a-5p 可能通過(guò)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞活力與遷移參與PE 的發(fā)生。缺氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）是在生理和病理?xiàng)l件下對(duì)低氧張力的細(xì)胞反應(yīng)中起核心作用關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄的因子［19］。在10 周前，胎盤(pán)在低氧環(huán)境中生長(zhǎng)，HIF-1α 作為缺氧誘導(dǎo)因子在低氧下調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞正常生長(zhǎng)。［20］。研究證實(shí)，HIF-1α 能夠激活PE 病理學(xué)因子sFlt-1 基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致 sF1t-1 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而 促 進(jìn)PE 進(jìn) 展［21］。而miR-146a-5p 被 證 實(shí) 可 靶 向HIF-1a 減少糖尿病患者的視網(wǎng)膜病變［22］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PE 蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體中miR-146a-5p 表達(dá)量顯著減少，與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)后滋養(yǎng)細(xì)胞中HIF1α 蛋白表達(dá)顯著增加，提示miR-146a-5p 與HIF1α 可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)一步證實(shí)miR-146a-5p 和HIF1α 之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。這提示miR-146a-5p 調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞活性可能與靶向調(diào)控HIF1a 蛋白的表達(dá)有關(guān)。

然而本課題還存在一些不足之處，還需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行多中心研究以確認(rèn)臨床中miR-146a-5p/HIF1α 調(diào)控軸的作用與臨床意義，以及同時(shí)處理的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否PE 蛻膜巨噬細(xì)胞源性外泌體通過(guò)miR-146a-5p/HIF1α 抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究提示蛻膜巨噬細(xì)胞分泌外泌體可能是導(dǎo)致PE 的發(fā)生及進(jìn)展的重要原因之一，而外泌體中miR-146a-5p 低表達(dá)與其高度相關(guān)，可能通過(guò)靶向促進(jìn)HIF1α 的表達(dá)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞活力與遷移，從而介導(dǎo)PE 的發(fā)生，為PE 的機(jī)制研究和靶向診治提供了新的思路，但具體作用及機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

陳芳榮：經(jīng)費(fèi)支持與實(shí)驗(yàn)進(jìn)行；毛東瑞：數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)；陳小菊：課題設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。