王龍飛，高玉海，楊世超，黃睿馨，李 幸，楊玉田，軒瑩瑩，唐漢琴，陳克明，3

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種女性特有的全身性骨代謝性疾病，主要發(fā)生于絕經(jīng)后5～10 年間，女性絕經(jīng)后卵巢功能衰退，雌激素水平降低導(dǎo)致骨量丟失，引起骨質(zhì)疏松［1］。PMOP 患者會出現(xiàn)骨代謝異常，骨形成和骨吸收平衡破壞，導(dǎo)致骨密度及骨組織含量降低，從而誘發(fā)腰背酸痛、全身乏力和骨折等一系列PMOP 癥 狀［2，3］。據(jù) 統(tǒng) 計(jì)，約10%～20%絕 經(jīng) 后 女性患有不同程度骨質(zhì)疏松，而絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)脆性骨折發(fā)生率和發(fā)病率很高，喪失勞動力者非常普遍，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［4，5］，隨著全球人口的老齡化，PMOP 的發(fā)病率急劇增加，由于PMOP的高發(fā)病率和破壞性并發(fā)癥，它已成為一個(gè)全球公共衛(wèi)生問題［6］。阿侖膦酸鈉是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一線骨吸收抑制劑，能使成骨細(xì)胞分泌骨保護(hù)素并且抑制破骨細(xì)胞的聚集作用，抑制破骨細(xì)胞形成來提高骨量［7］。本研究以去卵巢小鼠為PMOP 模型，觀察骨質(zhì)疏松小鼠骨強(qiáng)度，骨代謝和臟器病理學(xué)的變化，進(jìn)一步探討阿侖膦酸鈉抗PMOP 的作用潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

阿侖膦酸鈉（Sigma-Aldrich，產(chǎn)品批號：PHR1599）；骨鈣素（OCN）定量檢測試劑盒（泉州睿信生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：20220704-20334B）；抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）定量檢測試劑盒（泉州睿信生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：20220704-20441B）；I 型前膠原N 端前肽（PINP）定量檢測試劑盒（泉州睿信生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：20220704-20072B）；I 型膠原交聯(lián)C 端肽（CTX-I）定量檢測試劑盒（泉州睿信生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：20210518-35628B）；microCT（平生醫(yī)療科技昆山有限公司，中國）；BX51+DP71 型顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）；萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（Instron5565，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組處理

8 周齡SPF 級C57BL/6 小鼠30 只，體重（18±2）g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK（陜）2019-001。飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院SPF 級動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證編號：SYXK（軍）2017-0047。小鼠造模前按隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組，每組10 只，分別為假手術(shù)組（Sham）、去卵巢組（OVX）及去卵巢+阿侖膦酸鈉組（ALN）。除Sham組切除卵巢體積相同脂肪外，其余各組均由背部行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。術(shù)后連續(xù)肌注3 d 青霉素。ALN組每周阿侖磷酸鈉400 μg/kg 皮下注射2 次，Sham組和OVX 組每周等體積的生理鹽水皮下注射2 次。為防止切卵巢后小鼠體重上升過快，每天給小鼠定量喂食，所有小鼠的喂食量按照假手術(shù)組每天進(jìn)食量給予，術(shù)后1 周開始給藥。實(shí)驗(yàn)期間注意皮毛的色澤、觀察小鼠生理反應(yīng)與生活習(xí)性的變化，每一周稱一次體重。給藥第12 周處死小鼠取材，取材前禁食不禁水24 h。

1.3 臟器病理學(xué)指標(biāo)分析

小鼠取材時(shí)，摘取主要臟器包括心、肝、脾、肺、腎和子宮，剝離周圍多余組織，稱量臟器的體質(zhì)量并計(jì)算臟器系數(shù)（臟器系數(shù)=臟器體質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量）。固定于10%甲醛固定液中，進(jìn)行石蠟包埋、切片和HE 染色（蘇木精-伊紅染色法），顯微鏡下觀察各臟器有無病理學(xué)改變。

1.4 骨組織病理學(xué)指標(biāo)分析

小鼠取材時(shí)，將剛剝離的股骨放在多聚甲醛固定24～48 h，固定后放入EDTA 脫鈣液，每7 d 換一次脫鈣液，直到用針穿透骨組織的時(shí)候沒有阻力為止。進(jìn)行石蠟包埋、切片和HE 染色（蘇木精-伊紅染色法），顯微鏡下觀察骨組織有無病理學(xué)改變。

1.5 microCT 分析

小鼠取材時(shí)，每組隨機(jī)挑出6 根左側(cè)股骨固定在4%多聚甲醛中。固定好的樣本存放于4℃冰箱內(nèi)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用鑷子取出樣本并用紗布擦走多余的液體后，用干凈的紙巾將樣品包裹放入Micro CT 試驗(yàn)機(jī)中。掃描后得到大量層切圖片，再經(jīng)重建軟件進(jìn)行3D 重建，截取最大剖面圖與橫截面圖。選擇骨骺線下1 mm～1.5 mm 處為感興趣區(qū)進(jìn)行分析，得到分析區(qū)域松質(zhì)骨的骨形態(tài)參數(shù)。選擇骨骺線下2.5 mm～3 mm 處為感興趣區(qū)進(jìn)行分析，得出該區(qū)域皮質(zhì)骨的骨形態(tài)參數(shù)。得到橫截面圖、最大剖面圖以及骨形態(tài)參數(shù)包括骨小梁骨密度（Tb.BMD）、骨小梁數(shù)（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨體積分?jǐn)?shù)（Tb.BV/TV）、皮質(zhì)骨密度（Ct.BMD）和皮質(zhì)骨厚度（Ct.Th）。

1.6 L4 椎體生物力學(xué)檢測

從冰箱取出紗布包裹的椎骨，常溫下自然解凍后用于骨生物力學(xué)檢測。腰椎壓縮實(shí)驗(yàn)：從小鼠椎骨中剝離第4 腰椎椎體（L4），去除周圍多余的肌肉組織，用砂紙磨平L4 錐體的上表面與下表面，直到上表面與下表面平行且能豎直立于桌面為止，加載速度設(shè)為1 mm/min，開始實(shí)驗(yàn)后力試驗(yàn)機(jī)垂直平穩(wěn)的施壓于椎骨，直至椎骨被壓碎后實(shí)驗(yàn)停止，記錄其彈性模量和最大載荷。

1.7 血清生化指標(biāo)檢測

小鼠取血采用腹主動脈抽血，每只小鼠取血量0.6 mL 左右，取血結(jié)束后室溫下靜置30 min，設(shè)置3 000 r/min，時(shí)間15 min，取離心后的上層血清后放入-80℃超低溫冰箱保存；自然解凍后，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測450 nm 處的吸光度OD 值，按說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出骨鈣素（osteocalcin，OCN）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b）、I 型前膠原N 端前肽（procollagen type I aminoterminal peptide，PINP）和Ⅰ型膠原C 端肽（C-terminal type I collagen telopeptide，CTX-I）的 含 量，結(jié) 果 表 示 為ng/mL。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同組間差異用單因素方差分析，符合正態(tài)分布且方差齊性用LSD，不符合方差齊性用塔姆黑尼T2，進(jìn)行兩兩比較，若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALN 對小鼠臟器系數(shù)的影響

如表1 所示，小鼠的心、肝、脾、肺、腎的器官指數(shù)組別間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Sham 組子宮系數(shù)為（0.005 4±0.000 7），OVX 組和ALN 組小鼠的子宮系數(shù)分別為（0.002 6±0.000 9）和（0.002 5±0.000 7），由以上數(shù)據(jù)可以看出Sham 組子宮系數(shù)顯著的高于OVX 組和ALN 組（P＜0.01），這是由于小鼠切除卵巢后由于雌激素缺乏導(dǎo)致子宮發(fā)生萎縮使子宮系數(shù)降低。

表1 各組小鼠的主要器官的器官系數(shù)比較（n=10，±s）Tab 1 Comparison of organ coefficients of major organs in each group（n=10，±s）

表1 各組小鼠的主要器官的器官系數(shù)比較（n=10，±s）Tab 1 Comparison of organ coefficients of major organs in each group（n=10，±s）

注：與Sham 相比,##P＜0.01。

指標(biāo)F P Sham 組OVX 組ALN 組0.198 0.170 0.945 0.254 0.215 0.000心肝脾肺雙腎子宮0.005 7±0.001 0 0.037 5±0.003 3 0.003 2±0.000 4 0.007 1±0.000 7 0.012 1±0.000 6 0.005 4±0.000 7 0.005 4±0.000 6 0.038 9±0.001 6 0.003 1±0.000 5 0.007 1±0.000 7 0.011 0±0.000 9 0.002 6±0.000 9##0.005 0±0.000 5 0.035 6±0.003 8 0.003 2±0.000 4 0.006 5±0.000 4 0.011 4±0.001 5 0.002 5±0.000 7##1.783 1.939 0.056 1.525 1.667 31.565

2.2 臟器的病理學(xué)觀察結(jié)果

從小鼠的臟器心、肝、脾、肺、腎，肉眼觀察并無形態(tài)和色澤的明顯改變，但是子宮有明顯的萎縮。顯微鏡下觀察小鼠主要臟器的HE 切片，未發(fā)現(xiàn)各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎病理學(xué)異常改變（圖1）。OVX 組和ALN 組子宮內(nèi)膜組織腺體稀少并且萎縮變薄，表面為一層小而圓的單層上皮細(xì)胞；Sham 組子宮內(nèi)膜較厚，腺體較多，表面為一層高而密的假柱狀上皮。

圖1 小鼠主要臟器組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE， 40×）Fig 1 Histopathological examination results of major organs in mice（HE，40×）

2.3 骨組織的病理學(xué)觀察結(jié)果

通過對小鼠股骨進(jìn)行脫鈣切片和HE 染色后進(jìn)行觀察（圖2），發(fā)現(xiàn)OVX 組的骨髓腔脂肪細(xì)胞填充較多，骨小梁比較稀疏和細(xì)小。Sham 組和ALN 組的骨髓腔脂肪細(xì)胞填充較少，骨小梁比較致密和緊湊。

圖2 小鼠骨組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE， 10×）Fig 2 Bone histopathological examination results of mice（HE，10×）

2.4 micro CT 掃描及分析

股骨正中剖面圖（圖3）顯示，OVX 組與Sham組相比，松質(zhì)骨比較疏松，骨小梁數(shù)量減少，骨小梁間間距擴(kuò)大，骨小梁與骨小梁間的連續(xù)性與延展性較差。其中ALN 組與Sham 組相比，股骨松質(zhì)骨的骨微結(jié)構(gòu)質(zhì)量基本一致。從骨小梁橫切圖（圖4）顯示，OVX 組骨小梁比較稀疏，Sham 組和ALN 組明顯更加緊密。從骨小梁3D 圖（圖5）看出OVX 組骨小梁數(shù)目明顯較少，Sham 組和ALN 組骨小梁數(shù)目明顯較多。從皮質(zhì)骨3D 圖（圖6）和皮質(zhì)骨橫切（圖7）未 發(fā) 現(xiàn)OVX 組 與Sham 組 和ALN 組 的 明 顯差異。

圖3 小鼠股骨Micro CT 成像分析最大剖面圖Fig 3 Maximum profile of Micro CT imaging analysis of mouse femur

圖4 小鼠股骨Micro CT 成像分析骨小梁橫切Fig 4 Micro CT imaging of trabecular bone transection in mouse femur

圖5 小鼠股骨Micro CT 成像分析骨小梁3DFig 5 Micro CT imaging of trabecular bone and in 3D of mouse femur

圖6 小鼠股骨Micro CT 成像分析皮質(zhì)骨3DFig 6 Micro CT imaging of mouse femur and 3D of cortical bone

圖7 小鼠股骨Micro CT 成像分析皮質(zhì)骨橫切Fig 7 Micro CT imaging of mouse femur cortical bone transection

由表2 可見，通過比較松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的骨形態(tài)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)ALN 組的小鼠與OVX 組小鼠比較，數(shù)值在Tb.BMD、Tb.N、Tb.Th 和Tb.BV/TV 均有顯著性增加、Tb.Sp 數(shù)值顯著性減少（P＜0.01），證明ALN 提高骨質(zhì)量，是通過增加骨密度和改善骨組織的結(jié)構(gòu)。ALN 組與OVX 組的Ct.BMD 和Ct.Th 比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表2 小鼠股骨Micro CT 松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨各指標(biāo)的比較（±s，n=10）Tab 2 Comparison of indexes of cancellous bone and cortical bone in mouse femur with micro CT（±s，n=10）

表2 小鼠股骨Micro CT 松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨各指標(biāo)的比較（±s，n=10）Tab 2 Comparison of indexes of cancellous bone and cortical bone in mouse femur with micro CT（±s，n=10）

注：與OVX 相比,**P＜0.01；與Sham 相比,##P＜0.01。

指標(biāo)Tb.BMD(g/cm3)Tb.N(mm-1)Tb.Sp(mm)Tb.Th(mm)Tb.BV/TV（%）Ct.BMD(g/cm3)Ct.Th(mm)Sham 組1.205±0.006 2.826±0.129 0.256±0.011 0.088±0.006 0.156±0.011 1.807±0.023 0.281±0.010 OVX 組1.182±0.003##2.586±0.154##0.304±0.023##0.079±0.004##0.105±0.013##1.790±0.021 0.275±0.011 ALN 組1.229±0.014**3.369±0.401**0.229±0.003**0.095±0.005**0.224±0.037**##1.785±0.014 0.275±0.006 F P 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 0.074 0.346 42.522 16.659 23.660 11.417 24.345 2.928 1.111

2.5 L4 椎體生物力學(xué)檢測結(jié)果

如表3 所示，小鼠椎骨第四錐體（L4）的壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALN 組的彈性模量和最大載荷數(shù)分別為（50.29±13.43）和（29.83±4.92），OVX 組的彈性模量和最大載荷數(shù)分別為（14.77±3.12）和（11.57±3.18），ALN 組的彈性模量和最大載荷數(shù)值都顯著高于OVX 組（P＜0.01），結(jié)果表明，ALN 可以提高實(shí)驗(yàn)小鼠的L4 椎體生物力學(xué)性能。

表3 小鼠L4 錐體壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=10，±s）Tab 3 Comparison of L4 cone compression test results inmice（n=10，±s）

表3 小鼠L4 錐體壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=10，±s）Tab 3 Comparison of L4 cone compression test results inmice（n=10，±s）

注：與OVX 相比，**P＜0.01。

最大載荷/N 29.37±4.64 11.57±3.18 29.83±4.92**17.663 0.002組別Sham 組OVX 組ALN 組FP彈性模量/mPa 49.44±22.01 14.77±3.12 50.29±13.43**6.314 0.019

2.6 ALN 對小鼠血清骨代謝生化指標(biāo)的影響

如表4 所示，OVX 組的血清的骨形成指標(biāo)OCN 和PINP 的平均含量為7.81 ng/mL 和29.91 ng/mL，ALN 組的血清OCN 和PINP 的平均含量為10.72 ng/mL 和56.65 ng/mL 顯 著 的 高 于OVX 組（P＜0.01）。 OVX 組 的 血 清 的 骨 吸 收 指 標(biāo)TRACP-5b 和CTX-I 的平均含量為7.47 ng/mL 和12.94 ng/mL，ALN 組的血清TRACP-5b 和CTX-I的平均含量為4.84 ng/mL 和8.86 ng/mL 顯著的低于OVX 組（P＜0.01）。OVX 組血清中骨形成指標(biāo)OCN 和PINP 與Sham 組相比都呈下降趨勢，骨吸收指標(biāo)TRACP-5b 和CTX-I 都呈上升趨勢，但是ALN 組的骨形成和骨吸收指標(biāo)與Sham 組的趨勢基本相似。數(shù)據(jù)結(jié)果表明ALN 組是促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收來預(yù)防切卵巢引起的小鼠的骨量丟失。以上結(jié)果表明，ALN 既能促進(jìn)小鼠骨形成又可以抑制骨吸收。

表4 小鼠給藥3 個(gè)月后各組OCN、TRACP-5b、PINP、CTX-I的比較（ng/mL，n=10，±s）Tab4 drugs in mice after 3 months each OCN，TRACP-5 b，PINP，the comparison of CTX-I（ng/mL，n=10，±s）

表4 小鼠給藥3 個(gè)月后各組OCN、TRACP-5b、PINP、CTX-I的比較（ng/mL，n=10，±s）Tab4 drugs in mice after 3 months each OCN，TRACP-5 b，PINP，the comparison of CTX-I（ng/mL，n=10，±s）

注：與OVX 相比，**P＜0.01；與Sham 相比，##P＜0.01。

組別Sham 組OVX 組ALN 組FP CTX-I 7.04±1.27 12.94±0.85##8.86±1.46**46.532 0.000 OCN 13.10±2.04 7.81±1.12##10.72±0.81**23.747 0.000 TRACP-5b 4.57±0.76 7.47±1.11##4.84±0.76**24.455 0.000 PINP 53.94±8.23 29.91±3.65##56.65±9.79**26.113 0.000

3 討論

絕經(jīng)性骨質(zhì)疏松是與婦女年齡緊密有關(guān)的骨科疾病，婦女到達(dá)一定年紀(jì)時(shí)體內(nèi)的雌激素就會下降導(dǎo)致骨組織結(jié)構(gòu)變化，使骨脆性增加和骨量減少導(dǎo)致骨折的發(fā)生［8］。絕經(jīng)性骨質(zhì)疏松有兩種，第一種為絕經(jīng)后早期骨質(zhì)疏松；第二種是絕經(jīng)后晚期骨質(zhì)疏松［9］。阿侖膦酸鈉是治療絕經(jīng)性骨質(zhì)疏松有效的藥物，主要通過抑制破骨細(xì)胞的活性并促進(jìn)凋亡，還能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分泌抑制因子來阻斷破骨細(xì)胞啟動的破骨過程，抑制骨吸收［10］。通過實(shí)驗(yàn)證明阿侖膦酸鈉可以有效的改善OVX 小鼠骨組織結(jié)構(gòu)、增加骨量、抑制破骨細(xì)胞的吸收和促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性。

在正常人體內(nèi)的骨微環(huán)境中，骨代謝的動態(tài)平衡對于維持骨量穩(wěn)定至關(guān)重要［11］。骨重建是嚴(yán)密調(diào)控的過程，通過連貫的骨吸收和骨形成活動，確保微損傷的修復(fù)和新骨替換舊骨，保證骨骼的完整性［12］。骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的最根本原因是由環(huán)境、遺傳、內(nèi)分泌和年齡因素等導(dǎo)致的骨代謝失衡，即骨形成作用弱于骨吸收作用，新的骨基質(zhì)的產(chǎn)生速度小于舊骨基質(zhì)的吸收。通過血清生化指標(biāo)證明阿侖膦酸鈉可以使小鼠的骨吸收與OVX 小鼠相比明顯的降低，骨形成與OVX 小鼠相比明顯的升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明阿侖膦酸鈉可以有效的降低骨吸收，增加骨形成來調(diào)節(jié)骨代謝。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算了各組小鼠主要臟器包括心、肝、脾、肺、腎與子宮的臟器系數(shù)，并利用SPASS軟件對其數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，ALN 組和OVX 組子宮系數(shù)明顯降低，OVX 組和ALN 組的子宮與Sham 組的子宮有顯著性差異。其它器官系數(shù)結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)差異；對于新鮮剝離的臟器組織，先經(jīng)肉眼仔細(xì)觀察組織的顏色、狀態(tài)、形狀和大小，通過對比Sham組，可以明顯的發(fā)現(xiàn)ALN 組和OVX 組子宮明顯的萎縮，這是因?yàn)樾∈蟮穆殉睬谐驩VX 組由于雌激素缺乏造成的子宮萎縮，其它器官對比并未發(fā)現(xiàn)明顯差異點(diǎn)。臟器病理切片直觀反映了微觀組織的真實(shí)狀態(tài)，顯微鏡下觀察各臟器的病理切片，發(fā)現(xiàn)各組小鼠的各個(gè)器官除了ALN 組和OVX 組的子宮內(nèi)膜組織腺體稀少并且萎縮變薄，其它器官均未見明顯病變。從臟器系數(shù)與臟器病理切片結(jié)果可以看出，ALN 未給切卵巢小鼠的生長產(chǎn)生不良影響，也未帶來明顯的毒副作用，證實(shí)了ALN 作用于切卵巢小鼠的安全性。

骨組織脫鈣是指將骨組織中的有機(jī)成分和骨鹽進(jìn)行分離，通過物理或者化學(xué)的方法，去除鈣鹽得到完整的膠原纖維組織和基質(zhì)［13］，組織會變軟從而方便制片和染色。EDTA 是一種比較理想的螯合脫鈣劑，不僅對組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)影響較小，而且還可以保存組織中的抗原物質(zhì)和某些酶類的活性［14］。10% EDTA 脫鈣液脫鈣后的骨組織行HE染色效果佳，且不易掉片。骨質(zhì)疏松會引起骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞的增多，脂肪細(xì)胞與成骨細(xì)胞屬于競爭性抑制的關(guān)系，脂肪細(xì)胞越多骨量就越少［15］。從脫鈣骨組織切片可以看出OVX 組的骨髓腔脂肪較多，骨小梁稀疏，ALN 組的骨髓腔脂肪細(xì)胞較少并且骨小梁比較致密，說明ALN 可以有效的提高骨量。

Micro CT 是骨組織微觀結(jié)構(gòu)鑒定的新方法，可以從三維層面精準(zhǔn)的反映皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)［16］。Micro CT 有直觀、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)，是骨科基礎(chǔ)疾病研究常用的一種有效的可靠手段，特別在骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的大小鼠實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用最多。本次以實(shí)驗(yàn)小鼠股骨為對象，分析最大剖面圖與立體三維重建圖，通過二維和三維的角度分析小鼠股骨的微觀結(jié)構(gòu)并得到準(zhǔn)確的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨量化指標(biāo)結(jié)果。直觀體現(xiàn)松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的微觀構(gòu)造，同樣得到皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨量化數(shù)值。Micro CT 結(jié)果顯示，ALN 都能增加骨小梁數(shù)量、加大骨小梁厚度、減小骨小梁間距、加強(qiáng)骨小梁的連續(xù)性，使得松質(zhì)骨內(nèi)部的骨小梁更加緊致，在微觀層面加強(qiáng)骨質(zhì)量并提高骨強(qiáng)度。說明ALN 可以預(yù)防小鼠切卵巢引起骨的丟失，增加骨質(zhì)量。

骨生物力學(xué)是從物理力學(xué)角度評價(jià)骨質(zhì)量的一種方法［17］，指在外界受力情況下，骨組織所呈現(xiàn)出的生物力學(xué)特性。骨生物力學(xué)能真實(shí)反映骨骼的強(qiáng)度與韌性，判斷骨骼的抗骨折能力。骨生物力學(xué)性能的改善也能代表骨質(zhì)量的好轉(zhuǎn)。在PMOP的小鼠實(shí)驗(yàn)中，常用的生物力學(xué)指標(biāo)包括最大載荷和彈性模量。從彈性模量和最大載荷數(shù)值的大小可以判斷骨組織強(qiáng)度的大小、韌性的好壞。本次研究對實(shí)驗(yàn)小鼠L4 錐體進(jìn)行了壓縮實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，ALN 組的L4 錐體生物力學(xué)性能顯著高于OVX 組，這是由于小鼠卵巢切除后雌激素不能產(chǎn)生，從而導(dǎo)致椎骨的生物力學(xué)下降。

骨代謝本質(zhì)是通過血清生化指標(biāo)反映的［18］，是觀察體內(nèi)代謝情況的窗口，直觀反映骨形成情況與骨吸收情況，客觀評價(jià)骨代謝活動和骨轉(zhuǎn)換率。血清骨代謝生化指標(biāo)由骨形成指標(biāo)與骨吸收指標(biāo)組成，常見的骨形成指標(biāo)包括OCN 和PINP，骨吸收指標(biāo)包括TRACP-5b 和CTX-I。骨形成指標(biāo)的高低代表了骨形成作用的高低，骨吸收指標(biāo)的高低代表了骨吸收作用的高低。骨形成指標(biāo)含量增高而骨吸收指標(biāo)含量減少時(shí)，新骨基質(zhì)的生成速率高于舊骨基質(zhì)的吸收。骨形成指標(biāo)含量減少而骨吸收指標(biāo)含量增多，說明新骨基質(zhì)的形成并不能及時(shí)填補(bǔ)舊骨基質(zhì)的吸收。在血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)OVX 組骨形成降低而骨吸收增加，證明了PMOP 模型的造模成功。測量結(jié)果表明，ALN 能抑制OVX 小鼠的破骨細(xì)胞活性來抑制骨吸收。

綜上所述，阿侖膦酸鈉可通過提高小鼠骨密度、優(yōu)化骨微結(jié)構(gòu)、提高骨強(qiáng)度、促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收來減少因切卵巢引起的骨質(zhì)量流失，并且對小鼠的臟器具有一定安全性，無明顯的副作用。本研究結(jié)果表明，阿侖膦酸鈉可以有效的治療切卵巢引起的骨質(zhì)疏松，為阿侖膦酸治療骨質(zhì)疏松和安全性提供了新的理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

王龍飛：課題設(shè)計(jì)、動物飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)采集、論文撰寫、論文修改；高玉海、 楊世超：實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)采集；黃睿馨、李幸、楊玉田、軒瑩瑩、唐漢琴：實(shí)驗(yàn)操作；陳克明：研究指導(dǎo)、論文校審。

所有作者聲明不存在利益沖突。