謝軍瑤，鞏健男，韓曉瑾，李建強(qiáng)

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，山西 太原 030002）

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因之一［1］。其中，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是肺癌最常見的組織學(xué)類型，約占所有肺癌的50%。LUAD具有惡性程度高、早期缺乏典型的臨床癥狀、早期易發(fā)生局部浸潤和轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差等特點(diǎn)［2］。近幾十年來，包括非侵入性手術(shù)切除、化療、放療和免疫治療在內(nèi)的多模式治療策略已取得巨大進(jìn)展，但LUAD 的治愈結(jié)果仍不令人滿意，5 年的相對總生存率約為22%［3］。為了提高患者生存率，迫切需要確定預(yù)后標(biāo)志物和有效的藥物靶點(diǎn)。

多梳蛋白家族（polycomb group protein， PcG）是形成染色質(zhì)修飾復(fù)合物的重要表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，其組成與細(xì)胞環(huán)境相關(guān)。在哺乳動(dòng)物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種主要的多梳蛋白抑制復(fù)合物（polycomb repressive complex， PRC），即PRC1（組蛋白泛素連接酶）和PRC2（組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶）。PRC 在表觀遺傳修飾的啟動(dòng)和維持中起重要作用，并參與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展。PHD 鋅指蛋白19（PHD finger protein 19， PHF19）包含一個(gè)Tudor 結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)植物同源結(jié)構(gòu)域和一個(gè)擴(kuò)展同源結(jié)構(gòu)域，是PRC2 中的重 要 成 員 之 一［4，5］。PHF19 可 通 過 自 身Tudor 區(qū) 域結(jié)合于H3 賴氨酸36 位點(diǎn)來參與染色體活化［6］。PHF19 在表觀遺傳調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，是多 種 病 理 生 理 過 程 的 關(guān) 鍵 調(diào) 控 因 子［7，8］。另 外，PHF19 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲過程中起著重要作用。Zhu 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，PHF19 是與肝細(xì)胞癌免疫浸潤和預(yù)后相關(guān)的致癌指標(biāo)。Jain 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，PHF19 在控制前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲性之間的平衡方面有重要作用。Schinke 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，PHF19 可作為多發(fā)性骨髓瘤的治療靶點(diǎn)。然而，PHF19 在LUAD 中的作用尚不清楚。

眾所周知，免疫治療是近年來出現(xiàn)的一種高效的腫瘤治療方法。之前的研究表明［12］，腫瘤微環(huán)境（the tumor microenvironment，TME）中細(xì)胞的成分在腫瘤增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移、化療耐藥性以及癌癥的其它標(biāo)志中起調(diào)節(jié)作用。Zhang 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，TME 中腫瘤浸潤免疫細(xì)胞（tumor-infiltrating immune cells，TIICs）調(diào)節(jié)癌癥的進(jìn)展并發(fā)揮潛在的預(yù)后價(jià)值。由于TIICs 是有吸引力的治療靶點(diǎn)，因此發(fā)現(xiàn)更多的免疫靶點(diǎn)或免疫機(jī)制對于TIICs 的研究至關(guān)重要。然而，對PHF19 與免疫浸潤的相關(guān)性知之甚少。

本研究探討了PHF19 在LUAD 中的表達(dá)水平、臨床預(yù)后、遺傳改變、甲基化值、生物學(xué)功能和免疫調(diào)節(jié)作用。其中，主要探討了PHF19 表達(dá)與LUAD 免疫調(diào)節(jié)之間的潛在關(guān)系?？傊?，本研究提示PHF19 在LUAD 中具有重要的預(yù)后價(jià)值和免疫相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取和預(yù)處理

所有原始數(shù)據(jù)均從癌癥基因組圖譜（TCGA）（https：//cancergenome.nih.gov/）數(shù) 據(jù) 庫 中 下 載。從TCGA 數(shù)據(jù)庫獲取TCGA-LUAD 的RNA 隊(duì)列數(shù)據(jù)，并對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理以去除丟失和重復(fù)的結(jié)果。

1.2 PHF19 在LUAD 中的表達(dá)分析

利 用TIMER 數(shù) 據(jù) 庫［14］（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）的“Diff Exp”模塊分析了泛癌中PHF19 的表達(dá)譜。Wilcoxon 檢驗(yàn)比較差異表達(dá)情況，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

利 用UALCAN 數(shù) 據(jù) 庫［15］（http：//ualcan.path.uab.edu）分析PHF19 的表達(dá)在LUAD 不同臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等中的差異。t檢驗(yàn)分析表達(dá)差異，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 PHF19 表達(dá)在LUAD 患者中的預(yù)后價(jià)值

通過Kaplan-Meier 生存曲線和Log rank 檢驗(yàn)對PHF19 mRNA 高表達(dá)組和低表達(dá)組的TCGALUAD 隊(duì)列進(jìn)行生存分析，以評估PHF19 表達(dá)在LUAD 患者總生存期（OS）的預(yù)后價(jià)值，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 PHF19 在LUAD 中的基因突變分析

利 用cBioPortal 數(shù) 據(jù) 庫［16］（http：//www.cbioportal.org/）分 析 了230 例LUAD 患 者PHF19 基 因的突變情況，并且可視化每個(gè)個(gè)體樣本中突變的完整細(xì)節(jié)。

利用TIMER 數(shù)據(jù)庫評估PHF19 與TP53 突變的關(guān)系。Wilcoxon 檢驗(yàn)比較差異表達(dá)情況，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 PHF19 在LUAD 中的啟動(dòng)子甲基化水平分析

為了確定LUAD 中PHF19 啟動(dòng)子的甲基化水平，利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析正常和腫瘤組織之間的PHF19 甲基化值。t檢驗(yàn)分析表達(dá)差異，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 PHF19 共表達(dá)基因的富集分析

LinkedOmics 數(shù) 據(jù) 庫［17］（http：//www.linkedomics.org/login.php）包含了來自TCGA 數(shù)據(jù)庫32 種癌癥類型的多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。在LinkedOmics 的“LinkFinder”模 塊 中，使 用Pearson 檢 驗(yàn) 對PHF19 的共表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并通過熱圖和火山圖顯示結(jié)果。在“LinkInterpreter”模塊中，利用基因集富集分析（Gene set enrichment analysis， GSEA）對PHF19及其共表達(dá)基因的GO 功能和KEGG 通路進(jìn)行了探索。最 后，基 于KEGG 數(shù) 據(jù) 庫［18］（https：//www.kegg.jp/），探索 PHF19 及其關(guān)聯(lián)基因在細(xì)胞周期通路中的作用和位置關(guān)系并生成路線圖。

1.7 PHF19 與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析

利用TIMER 數(shù)據(jù)庫“Gene”模塊探索PHF19表達(dá)與TIICs 浸潤水平之間的關(guān)系，利用“Correlation”模塊探索PHF19 表達(dá)與TIICs 的免疫標(biāo)志物和免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因之間的關(guān)系。采用Spearman 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHF19 在泛癌中的表達(dá)分析

利用TIMER 分析了來自TCGA 數(shù)據(jù)庫的PHF19 mRNA 在不同腫瘤組織和鄰近正常組織中的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，PHF19 在泛癌中上調(diào)，而在LUAD 組織中顯著上調(diào)（P＜0.001），見圖1。

圖1 PHF19 在泛癌中的表達(dá)Fig 1 Expression of PHF19 in pan-cancer

2.2 PHF19 表達(dá)與LUAD 臨床病理特征的關(guān)系

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析PHF19 表達(dá)在LUAD 組織和正常肺組織中的差異，結(jié)果顯示：515例LUAD 組織中PHF19 的表達(dá)明顯高于59 例正常肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝1.624E-12），見圖2A。

分析PHF19 表達(dá)在LUAD 中不同臨床分期中的差異，結(jié)果顯示：Stage 1 組、Stage 2 組、Stage 3 組和Stage 4 組中PHF19 的表達(dá)與正常肺組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜1E-12，P＜1E-12，P＝1.624E-12，P＝3.417E-06），見圖2B。

分析PHF19 表達(dá)在LUAD 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的差異，結(jié)果顯示：N0組、N1組、N2組中PHF19的表達(dá)與正常肺組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜1E-12，P＜1E-12，P＝1.626E-12），而在N3 組患者中PHF19的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（1.349E-01），見圖2C。

2.3 PHF19 表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系

PHF19 低表達(dá)組患者的OS 明顯高于PHF19高表達(dá)組（HR=1.21，P=0.022），見圖2D。結(jié)果表明，PHF19 表達(dá)與患者OS 顯著相關(guān)，可成為預(yù)測LUAD 患者生存的一個(gè)生物標(biāo)志物。

2.4 PHF19 在LUAD 中 的 基 因 突 變

利用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫分析了LUAD 中PHF19 的突變狀態(tài)，結(jié)果顯示：0.9%的患者出現(xiàn)遺傳變異，擴(kuò)增和錯(cuò)義突變是最常見的突變，見圖3A、B。

利用TIMER 數(shù)據(jù)庫評估PHF19 與TP53 突變的關(guān)系，結(jié)果顯示：TP53 突變體中PHF19 表達(dá)明顯高于TP53 野生型，即PHF19 的高表達(dá)與TP53 的突變呈正相關(guān)（P＜0.001），見圖3C。

圖3 PHF19 在LUAD 中的基因突變Fig 3 PHF19 gene mutation in LUAD

2.5 PHF19 在LUAD 中的啟動(dòng)子甲基化

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫比較了正常組織和腫瘤組織之間PHF19 的甲基化值。結(jié)果顯示，PHF19的啟動(dòng)子甲基化水平在LUAD 中顯著降低（P=4.088E-05），表明PHF19 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能是由于啟動(dòng)子甲基化的改變，見圖4。

圖4 LUAD 中PHF19 的啟動(dòng)子甲基化水平Fig 4 Promoter methylation levels of PHF19 in LUAD

2.6 PHF19 共表達(dá)基因的富集分析

基于515 名TCGA -LUAD 患者的PHF19 mRNA 測序數(shù)據(jù)，利用LinkedOmics 的“LinkFinder”模塊，分析PHF19 在LUAD 中的共表達(dá)基因，以探索其在腫瘤組織中的潛在功能。深紅色點(diǎn)表示的基因與PHF19 呈正相關(guān)，深綠點(diǎn)表示的基因與PHF19 呈負(fù)相關(guān)（FDR＜0.01），見圖5A。并且篩選出關(guān)聯(lián)最緊密和最疏遠(yuǎn)的Top 50 基因繪制熱圖，見 圖5B、C。 在“LinkInterpreter”模 塊 中，利 用GSEA 對PHF19 及其共表達(dá)基因的GO 功能和KEGG 通路進(jìn)行探索。GO 項(xiàng)分析表明，這些關(guān)聯(lián)基因主要富集于染色體分離、DNA 復(fù)制、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、雙股斷裂修復(fù)、細(xì)胞周期G2/M 相變、細(xì)胞周期G1/S 相變等生物過程中，見圖5D。KEGG 分析主要富集于細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制、同源重組、黃體酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、錯(cuò)配修復(fù)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、p53 信號通路、核苷酸切除修復(fù)等通路中，其中，以細(xì)胞周期通路最明顯，見圖5E。此外，進(jìn)一步探索PHF19 及關(guān)聯(lián)基因在細(xì)胞周期通路中的作用和位置關(guān)系，生成路線圖并用紅色標(biāo)記標(biāo)出通路中對應(yīng)基因的相關(guān)位置，大部分基因與細(xì)胞周期的G1/S 期和G2/M 期有關(guān)，見圖5F。這些結(jié)果表明，PHF19 可能參與LUAD 細(xì)胞增殖和凋亡。

圖5 LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫分析LUAD 組織中的PHF19 共表達(dá)基因Fig 5 The PHF19 co-expressed gene in LUAD tissues analysed by the LinkedOmics database

2.7 PHF19 表達(dá)與TIICs 浸潤水平之間的關(guān)系

PHF19 的表達(dá)與CD4+T 細(xì)胞（r=0.136，P=2.80E-03）、中性粒細(xì)胞（r=0.169，P=1.96E-04）、樹突狀細(xì)胞（r=0.163，P=3.02E-04）的浸潤呈顯著正相關(guān)，與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤呈無相關(guān)性（P＞0.05），見圖6。

圖6 LUAD 組織中PHF19 表達(dá)與TIICs 浸潤水平之間的關(guān)系Fig 6 Relationship between PHF19 expression and TIICs infiltration level in LUAD tissues

2.8 PHF19表達(dá)與TIICs的免疫標(biāo)志物之間的關(guān)系

PHF19 的表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞的免疫標(biāo)志物（CD8A、CD8B）、CD4+T細(xì)胞的免疫標(biāo)志物（CD4）、M1型巨噬細(xì)胞的免疫標(biāo)志物（IRF5）、M2型巨噬細(xì)胞的免疫標(biāo)志物（CD163、VSIG4）、中性粒細(xì)胞的免疫標(biāo)志物（ITGAM）、樹突狀細(xì)胞的免疫標(biāo)志物（NRP1、ITGAX）呈正相關(guān)，與中性粒細(xì)胞的免疫標(biāo)志物（CEACAM8）、樹突狀細(xì)胞的免疫標(biāo)志物（CD1C）呈負(fù)相關(guān)，見表1。

表1 通過TIMER 數(shù)據(jù)庫檢測LUAD 組織中PHF19 表達(dá)與TIICs 的免疫標(biāo)志物之間的關(guān)系Tab 1 The relationship between the expression of PHF19 in LUAD tissue and the immune markers of TIICs detected by the TIMER database

2.9 PHF19表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因之間的關(guān)系

PHF19 的表達(dá)與LUAD 組織TME 中PD-L1、PD-1 和CTLA-4 相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)（均P＜0.05），表明PHF19 可能通過參與LUAD 的免疫逃逸從而導(dǎo)致癌癥發(fā)生，見圖7。

圖 7 LUAD組織中PHF19表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因之間的關(guān)系Fig 7 Relationship between PHF19 expression and immune checkpoint related genes in LUAD tissues

3 討論

LUAD 是一種惡性腫瘤，其特征是肺和支氣管中細(xì)胞不受控制的生長。盡管過去幾十年LUAD的診斷和治療取得了很大進(jìn)展，但晚期患者的預(yù)后仍然很差。其中，大量研究集中在LUAD 的免疫治療上，幾種免疫檢查點(diǎn)抑制劑提高了晚期LUAD 患者的存活率［19］。然而，由于治療上耐藥，大量患者逐漸對免疫治療無反應(yīng)。因此，探索LUAD 的敏感診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

表觀遺傳機(jī)制與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌發(fā)展的不同階段發(fā)生了各種各樣的表觀遺傳修飾，其中一些修飾是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵［20］。表觀遺傳學(xué)是指影響基因表達(dá)而不修改主基因組DNA 序列的有絲分裂遺傳變化。表觀遺傳特征包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 和染色質(zhì)的重塑。表觀遺傳調(diào)控基因突變引起的表觀基因組圖譜變化具有明確的臨床意義，尤其對預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層及預(yù)測疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)具有重要意義［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，0.9%的LUAD 患者出現(xiàn)了PHF19 遺傳變異，擴(kuò)增和錯(cuò)義突變是最常見的突變，提示PHF19 可能成為LUAD 的預(yù)測指標(biāo)。眾所周知，TP53 突變是LUAD 中最常見的突變之一，它影響LUAD 的進(jìn)展和預(yù)后。TP53 突變體中PHF19 的表達(dá)明顯高于TP53 野生型，這可以部分解釋TP53 的突變可以促進(jìn)LUAD 的進(jìn)展。之前的研究還發(fā)現(xiàn)［22］，LUAD 中的TP53 突變狀態(tài)與較高的PD-L1 表達(dá)水平相關(guān)。上述結(jié)果為LUAD 的免疫治療進(jìn)一步提供支持。另外，啟動(dòng)子DNA 甲基化已被證明會(huì)影響轉(zhuǎn)錄抑制并參與腫瘤腫瘤發(fā)生［23］。上述分析結(jié)果顯示，PHF19 的啟動(dòng)子甲基化水平在LUAD 中顯著降低，表明PHF19 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能是由于啟動(dòng)子甲基化的改變。

為了進(jìn)一步了解PHF19 參與致癌的潛在分子機(jī)制，本研究首先利用LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫確定PHF19 的共表達(dá)基因，結(jié)果顯示，LUAD 中與PHF19 共表達(dá)的基因有ASF1B、HMGB2、CDT1、KIF18B、PTTG1 等。其 中，與PHF19 最 相 關(guān) 的ASF1B 和HMGB2 已經(jīng)被證實(shí)可以促進(jìn)LUAD 的增 殖 和 侵 襲，并 可 以 作 為 潛 在 靶 標(biāo)［24，25］。這 提 示PHF19 可能參與LUAD 的進(jìn)展。接下來，通過功能富集分析了PHF19 共表達(dá)基因在LUAD 中的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。GO 項(xiàng)分析發(fā)現(xiàn)，PHF19 的生物學(xué)過程主要集中在細(xì)胞分裂過程中。KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，PHF19 在細(xì)胞周期途徑中顯著富集。同時(shí)，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步探索了PHF19 及關(guān)聯(lián)基因在細(xì)胞周期通路中的作用和位置關(guān)系，可視化發(fā)現(xiàn)大部分相關(guān)基因與細(xì)胞周期的G1/S 期和G2/M 期有關(guān)，進(jìn)一步表明PHF19 可能通過細(xì)胞周期通路參與LUAD 進(jìn) 展。Mason M 等［26］研 究 發(fā) 現(xiàn)，低 水 平 的PHF19 可以導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤的生長和細(xì)胞周期停滯。García-Montolio 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，慢性髓系白血病細(xì)胞中低水平的PHF19 可以引起細(xì)胞周期停滯并促進(jìn)其向紅系途徑分化。這與本研究分析的結(jié)果一致，故我們推測PHF19 可能是LUAD 腫瘤細(xì)胞增殖的必要條件。

癌癥的生長和擴(kuò)散不僅取決于腫瘤細(xì)胞的特征，還取決于與TME 中TIICs 的相互作用，這與LUAD 患者的生存率呈正相關(guān)［28］。本研究表明，PHF19 的表達(dá)不僅與TME 中部分免疫細(xì)胞亞型浸潤相關(guān)，而且還與這些免疫細(xì)胞的生物標(biāo)志物相關(guān)，但不絕對一致。Zhang 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，TME 中的中性粒細(xì)胞浸潤增強(qiáng)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在體外的增殖和侵襲能力。另外，由于樹突狀細(xì)胞具有啟動(dòng)和調(diào)節(jié)T 細(xì)胞反應(yīng)的獨(dú)特能力，已被廣泛用于肺癌在內(nèi)的許多腫瘤的免疫治療［30］。上述結(jié)果提示，TIICs 可能是PHF19 介導(dǎo)的LUAD 致癌作用的部分原因。免疫檢查點(diǎn)阻斷法已經(jīng)成為各種惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。然而，只有一小部分特定類型的癌癥患者對免疫治療有反應(yīng)，這可能是由于免疫激活不足，無法識別腫瘤特異性抗原［31］。因此，必須確定其它潛在的治療靶點(diǎn)。之前研究已經(jīng)表明，PD-1、PD-L1 和CTLA-4 是負(fù)責(zé)腫瘤免疫逃逸的重要免疫檢查點(diǎn)。PD-1 通路是TME 局部免疫抑制的關(guān)鍵介質(zhì)［32］，通過抑制免疫細(xì)胞上的PD-1 受體或腫瘤細(xì)胞上的PD-L1 配體來阻斷PD-1 途徑可以抑制腫瘤生長。本研究探討了PHF19 與3 種免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，LUAD 組織中二者呈顯著正相關(guān)，提示PHF19 可能在LUAD的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明，PHF19 可以作為LUAD 免疫治療的有效靶點(diǎn)，為腫瘤患者的臨床治療提供新的希望。

總之，本研究利用生物信息學(xué)分析技術(shù)，探討了PHF19 在LUAD 中的表達(dá)水平、臨床預(yù)后、遺傳改變、甲基化值、生物學(xué)功能和免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，PHF19 可能是LUAD 患者一種新的潛在預(yù)后和免疫相關(guān)生物標(biāo)志物。本研究為進(jìn)一步研究PHF19 在LUAD 的發(fā)展和治療中的具體機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。然而，這項(xiàng)研究是基于公共數(shù)據(jù)庫的，所以有一些局限性。因此，還需要更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這種生物學(xué)影響。

作者貢獻(xiàn)度說明：

謝軍瑤：研究課題的提出、設(shè)計(jì)和論文初稿寫作；鞏健男：研究課題數(shù)據(jù)分析和論文修改；；韓曉瑾：數(shù)據(jù)獲?。焕罱◤?qiáng)：審閱及指導(dǎo)工作。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。