吳幫勇，易紅艷，馬燕琳，黃元華

（海南省人類生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，海南省地方?。ǖ刂泻Ｘ氀┡R床醫(yī)學(xué)研究中心，海南醫(yī)學(xué)院熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571199）

1 前言

在女性體內(nèi)，卵泡以始基卵泡的形式儲存于卵巢的皮質(zhì)部分，始基卵泡在多因素調(diào)控下處于休眠狀態(tài)。通常1 個月經(jīng)周期內(nèi)有數(shù)百個始基卵泡被募集激活，激活后始基卵泡才具備繼續(xù)發(fā)育為竇前卵泡、竇卵泡、排卵前卵泡和排卵的潛能，但1 個月經(jīng)周期內(nèi)一般只有1 個優(yōu)勢卵泡發(fā)育成熟［1］。由于遺傳、免疫、醫(yī)源性或其他原因，早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency， POI）患者在40 歲以前卵巢功能衰竭、出現(xiàn)閉經(jīng)，流行病學(xué)調(diào)查顯示POI 發(fā)病率約1%～2%，且有逐年增高的趨勢［2］。盡管這類患者不排卵，但卵巢中仍含有殘余的始基卵泡［3］，只是自身無法激活卵泡繼續(xù)發(fā)育［4］。既往POI 引起不孕的患者無法獲得自身卵母細(xì)胞行體外受精（in vitrofertilization， IVF），通常只能采取卵母細(xì)胞捐贈的治療方案［3］。

近年來，治療這類患者使其可以利用自身卵母細(xì)胞受孕一直備受關(guān)注。隨著不孕癥治療技術(shù)的發(fā)展，體外激活（in vitroactivation， IVA）技術(shù)的興起為這個難題提供了解決方案［4］，給POI 患者的輔助生殖治療開辟了新途徑。該技術(shù)主要是通過物理、化學(xué)等手段在體外刺激卵巢組織中處于休眠狀態(tài)的始基卵泡［4］，使其具備繼續(xù)發(fā)育至成熟卵泡的潛力。當(dāng)前，IVA 技術(shù)已成為解決那些無法通過自體激活始基卵泡的患者獲得自身成熟卵母細(xì)胞的重要途徑?；谂R床的需求和對IVA 作用機(jī)制研究的不斷深入，該技術(shù)已成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一大焦點(diǎn)，正逐步向臨床應(yīng)用推進(jìn)。

2 女性始基卵泡體外激活的機(jī)制研究

在女性體內(nèi)，休眠的始基卵泡由單層梭形原始卵泡顆粒細(xì)胞（primordial follicle granulosa cells， pf-GCs）包裹著初級卵母細(xì)胞組成，休眠狀態(tài)受到叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3a（forkhead box O3a， Foxo3a）、第10號染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10， PTEN）、結(jié)節(jié)性硬化癥基因1（tuberous sclerosis complex gene 1， Tsc1）、結(jié)節(jié)性硬化癥基因2（tuberous sclerosis complex gene 2， Tsc2）、叉頭框L2 基 因（forkhead box L2， Foxl2）、p27KIP1 基 因（p27KIP1 gene， p27）、核 糖 體 蛋 白S6（ribosomal protein S6， rpS6）、3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-phospholipid-dependent kinase-1， PDK1）和 抗 苗 勒氏管激素（anti-müllerian hormone， AMH）等因子的共同調(diào)控，當(dāng)某些因子的調(diào)控改變，始基卵泡的休眠狀態(tài)被打破從而激活繼續(xù)發(fā)育，或者發(fā)生退化、閉鎖［5］。始基卵泡的激活過程涉及pfGCs 的增殖分化和初級卵母細(xì)胞的生長發(fā)育等方面［6］。有研究稱，哺乳動物中pfGCs 在始基卵泡激活或休眠的調(diào)控中起主導(dǎo)作用［7］。始基卵泡中的pfGCs 可控制休眠初級卵母細(xì)胞的激活［7］，同時激活的初級卵母細(xì)胞能夠分泌刺激因子促進(jìn)pfGCs 的增殖發(fā)育［8］，兩者相互促進(jìn)，共同調(diào)控始基卵泡的激活發(fā)育。始基卵泡激活后，pfGCs 由初始的扁平狀變?yōu)榱⒎叫危w積增大；初級卵母細(xì)胞體積增大開始向下一階段發(fā)育，并分泌具有促進(jìn)顆粒細(xì)胞發(fā)育作用的特異性生長分化因子9（growth differentiation factor-9，GDF9）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（bone morphogenetic protein-15， BMP15）［8］。在女性體內(nèi)，當(dāng)激活的pf-GCs 數(shù)量增加到15 個時，初級卵母細(xì)胞開始快速生長［9］。

由于臨床的需求，近年來IVA 技術(shù)作為一項(xiàng)解決女性生育問題的新技術(shù)逐漸體現(xiàn)出臨床價值。目的是讓始基卵泡擺脫休眠的束縛從而具備繼續(xù)向下一階段卵泡發(fā)育的能力。研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)施IVA 技術(shù)時，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases， PI3K）/PTEN/蛋 白 激 酶B（protein kinase B， Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）、Hippo 等信號通路在始基卵泡的激活中起關(guān)鍵作用［10］，見圖1。

圖1 始基卵泡激活信號通路示意圖Fig 1 Schematic diagram of primordial follicle activation signal pathway

2.1 PI3K/PTEN/Akt 信號通路

PI3K 信號通路介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、凋亡、存活、生長、遷移和代謝活性等過程，不僅與糖尿病、癌癥等人類疾病密切相關(guān)［11］，在卵泡激活中也起重要作用［12］。當(dāng)前，PI3K/PTEN/Akt 信號通路是始基卵泡激活中研究最成熟的一條信號通路，也是啟動始基卵泡激活最關(guān)鍵的信號通路之一［13］。PI3K 由一個調(diào)節(jié)亞基（p85）和一個催化亞基（p110）組成，是初級卵母細(xì)胞膜上接收顆粒細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子［14］。在始基卵泡的激活過程中，初級卵母細(xì)胞PI3K 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是激活休眠始基卵泡的必要條件［12］。PI3K 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在PDK1 上聚合［15］，當(dāng)初級卵母細(xì)胞膜上的PI3K 受到上游受體絡(luò)氨酸激酶刺激將磷脂酰肌醇4，5 二磷酸（phosphatidylinositol （4，5）-bisphosphate， PIP2）磷酸化為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol （3，4，5）-trisphosphate，PIP3），PDK1 將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至Akt，胞內(nèi)游離的Akt 受到刺激后磷酸化，將信號從細(xì)胞膜傳送至細(xì)胞核內(nèi)。核內(nèi)的卵泡休眠因子Foxo3a 收到Akt 的信號后被抑制，移出細(xì)胞核［14］。脫離Foxo3a 的休眠抑制，初級卵母細(xì)胞被激活并繼續(xù)發(fā)育，從而誘發(fā)始基卵泡的激活發(fā)育。其中，PTEN 在該條信號通路中起到負(fù)調(diào)控作用，通過將PIP3 去磷酸化為PIP2而參與始基卵泡的激活和休眠調(diào)控［14］。2013 年，日本科學(xué)家Kazuhiro Kawamura 首次報道通過體外添加PI3K 激活劑740Y-P 和PTEN 抑制劑bpV（HOpic）作用于女性卵巢組織，成功激活POI 患者的卵泡最終獲得活產(chǎn)［4］，開啟了IVA 治療不孕癥的新模式。

2.2 mTOR 信號通路

在人體內(nèi)，mTOR 通過整合細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號，不僅參與細(xì)胞的生長、增殖等機(jī)制調(diào)控，還參與調(diào)控人腫瘤的發(fā)生發(fā)展，分為mTOR 復(fù)合物1（mTOR complex 1， mTORC1）和mTOR 復(fù)合物2（mTOR complex 2， mTORC2）兩種催化亞基［16］。在pfGCs 中，mTORC1 是接收卵泡激活信號的關(guān)鍵因 子［7］。pfGCs 通 過mTORC1-KIT 配 體（KIT ligand， KITL）信號通路將信號傳導(dǎo)至休眠的初級卵母細(xì)胞，誘發(fā)初級卵母細(xì)胞激活發(fā)育［17］。當(dāng)pfGCs受到營養(yǎng)、氧濃度和生長因子等因素改變的影響時，pfGCs 上的mTORC1 活性增強(qiáng)并進(jìn)一步刺激KITL，使KITL 分泌上調(diào)。初級卵母細(xì)胞上的KIT受體與分泌的KITL 結(jié)合，繼續(xù)刺激初級卵母細(xì)胞內(nèi) 的PI3K［17］，從 而 激 活PI3K/PTEN/Akt 信 號通路。

在初級卵母細(xì)胞中，mTORC1 也是休眠與激活的調(diào)控因子，處于PI3K/PTEN/ Akt 信號通路的下游，受到兩個腫瘤抑制因子Tsc1 和Tsc2 組成的異二聚體復(fù)合物的負(fù)調(diào)控［5］。當(dāng)Akt 抑制Tsc1/2 復(fù)合物繼而抑制下游的mTORC1 表達(dá)，導(dǎo)致mTORC1活性減弱，被抑制的mTORC1 促進(jìn)下游核糖體蛋白S6 激酶1（S6 Kinase 1， S6K1）磷酸化，S6K1 繼續(xù)刺激下游的rpS6，繼而促進(jìn)初級卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯和核糖體發(fā)生［18］，啟動初級卵母細(xì)胞的發(fā)育。另外，有研究稱mTORC2 參與調(diào)控Akt 從而介導(dǎo)下游激活機(jī)制的發(fā)生［19］。

2.3 Hippo 信號通路

研究表明，Hippo 信號通路在控制組織器官大小、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和再生中起重要作用，是組織過度生長的主要抑制通路［20］。在體外培養(yǎng)的條件下，通過切割卵巢組織可以激活Hippo 信號通路從而誘導(dǎo)卵泡的激活和早期發(fā)育。2018 年， Grosbois 的研究結(jié)果證實(shí)了在切碎培養(yǎng)的卵巢組織中，組織邊緣部位被激活的卵泡數(shù)量較組織中間部位多，其激活機(jī)制是由Hippo 信號通路受到破壞干擾而誘發(fā)的［8］。破壞干擾Hippo 信號通路介導(dǎo)卵泡激活的優(yōu)勢在于只采用物理切割方法，而不需要添加其他化學(xué)制劑即可實(shí)現(xiàn)休眠始基卵泡的體外激活，有效縮短卵巢組織的體外培養(yǎng)時間并提高了IVA 技術(shù)的安全性。通常，在通過PI3K/PTEN/Akt 信號通路實(shí)施IVA技術(shù)時，都會伴隨著Hippo 信號通路的激活，從而協(xié)同促進(jìn)IVA 的作用效果［4，8］。

在休眠的始基卵泡中，Hippo 信號通路介導(dǎo)的激活機(jī)制主要在pfGCs 中進(jìn)行。當(dāng)卵巢組織破碎后，組織邊緣pfGCs 之間的接觸抑制解除，Hippo 信號通路中的大腫瘤抑制基因1（large tumor suppressor 1， LATS1）表達(dá)增加，高表達(dá)的LATS1 抑制pf-GCs 特異性表達(dá)的磷酸化YES 相關(guān)蛋白（yes-associated protein， YAP）/ PDZ 結(jié)合域轉(zhuǎn)錄共激活因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif， TAZ），使其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。細(xì)胞核中累積的YAP/TAZ 可提高結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor， CTGF/CCN2）和含桿狀病毒重復(fù)序列1 蛋白（baculoviral IAP repeat containing 1， BIRC1）的轉(zhuǎn)錄，二者具有促進(jìn)pfGCs 發(fā)育的作用［10，20］。發(fā)育的pfGCs 再通過mTORC1-KITL 信號通路將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至初級卵母細(xì)胞并誘導(dǎo)激活，激活后的初級卵母細(xì)胞分泌的GDF9、BMP15 可與pf-GCs 中YAP 協(xié)同促進(jìn)受體調(diào)節(jié)型SMAD2/3 蛋白的磷酸化，并與共調(diào)節(jié)型的SMAD4 蛋白結(jié)合，形成YAP-SMAD2/3/4 復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，又可增進(jìn)pf-GCs 的發(fā)育［8］?？傊?，Hippo 信號通路可協(xié)同PI3K/PTEN/Akt 信號通路共同促進(jìn)休眠始基卵泡的激活發(fā)育［8］。

3 IVA 技術(shù)的臨床應(yīng)用研究

進(jìn)行卵巢組織體外培養(yǎng)的第一步就是將處于休眠狀態(tài)的始基卵泡激活，使卵泡具有在體外繼續(xù)發(fā)育的潛力。來源可為手術(shù)新鮮取出的卵巢組織［4］，也可為冷凍后解凍復(fù)蘇的卵巢組織［21］，最終使休眠的始基卵泡繼續(xù)發(fā)育，獲得成熟的卵母細(xì)胞用于受精。起初，IVA 技術(shù)在臨床上應(yīng)用的普遍做法是將離體卵巢組織髓質(zhì)部分去掉，留下的皮質(zhì)部分通過物理切碎破壞Hippo 信號通路，解除始基卵泡之間的休眠抑制。然后在體外培養(yǎng)時，添加PI3K/PTEN 信號通路的刺激因子，進(jìn)一步激活卵巢中處于休眠狀態(tài)的始基卵泡，從而實(shí)現(xiàn)激活效果［4］。而近來有研究發(fā)現(xiàn)，單純通過物理切割破壞Hippo 信號通路同樣可以實(shí)現(xiàn)始基卵泡的激活，這種無藥物添加的激活方式有效提高了IVA 技術(shù)的安全性［22］。近年來，IVA 技術(shù)逐漸突顯出優(yōu)勢，不僅可作為一種輔助受孕手段［4］，也是一種潛在的女性生育力保存策略［21］，因?yàn)镮VA 技術(shù)不需要行激素刺激，既適用于育齡女性也適用于青春期前女孩［23］。

3.1 IVA 技術(shù)與自體移植

卵巢組織內(nèi)的始基卵泡通過IVA 后重新獲得繼續(xù)發(fā)育的能力。但由于卵巢組織體內(nèi)生長環(huán)境的復(fù)雜性，現(xiàn)今體外培養(yǎng)技術(shù)模擬體內(nèi)卵泡發(fā)育的全過程仍處研究階段。所以，為了使卵泡獲得最優(yōu)的發(fā)育環(huán)境，卵巢組織激活后的最佳選擇是自體移植。2013 年，Kazuhiro Kawamura 團(tuán)隊(duì)利用手術(shù)新鮮取出的POI 患者卵巢組織進(jìn)行IVA，自體移植回患者體內(nèi)后監(jiān)測到有卵泡繼續(xù)生長發(fā)育，并回收到成熟卵母細(xì)胞，隨后通過體外受精、胚胎移植獲得1名健康出生的嬰兒［4］。2015 年，該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)采用相同方法對冷凍的卵巢組織進(jìn)行IVA，自體移植后也獲得1 例活產(chǎn)兒［21］，有效的將卵巢組織冷凍技術(shù)和IVA 技術(shù)相結(jié)合。2016 年，我國孫瑩璞教授團(tuán)隊(duì)在國內(nèi)首次利用該方法激活新鮮卵巢組織也獲得1 例活產(chǎn)兒［24］，進(jìn)一步驗(yàn)證了IVA 的有效性。

當(dāng)前，IVA 技術(shù)已逐漸成為治療女性不孕的一種新途徑，現(xiàn)今已有超過10 例IVA 治療POI 患者的活產(chǎn)兒出生［25］。在有生育力需求的卵巢病變患者中，這種體外激活—卵巢碎裂的方法不僅對治療POI 患者的不孕有成效，也對卵巢早衰患者、中年不孕婦女、接受絕育治療的癌癥患者以及其他卵巢儲備減少、卵泡休眠和發(fā)育的調(diào)控失衡的患者有潛在價值［4，26］。另外也有研究稱，對于含有次級卵泡的卵巢儲備減少患者、早期POI 患者和多囊卵巢綜合征患者，可直接通過無藥物刺激Hippo 信號通路后，將卵巢組織碎片自體移植來獲得妊娠［22，27］?，F(xiàn)今IVA 治療不孕患者累計(jì)妊娠已達(dá)26 例，活產(chǎn)18 例，另外還有不孕患者在持續(xù)妊娠中［28］。

3.2 IVA 技術(shù)與體外培養(yǎng)

卵巢組織體外培養(yǎng)是一個多步驟的培養(yǎng)過程，一般需要經(jīng)過始基卵泡的激活、卵泡分離、卵泡3D培養(yǎng)、未成熟卵母細(xì)胞體外成熟（in vitromaturation， IVM）、IVF 等階段［15，23，29］，其主要優(yōu)點(diǎn)是從始基卵泡的激活開始直到獲得成熟的卵母細(xì)胞實(shí)施IVF 的全過程都可以在體外進(jìn)行，無需將有病變的卵巢組織再移植回患者體內(nèi)，有效降低疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險。然而，當(dāng)前通過該技術(shù)的完全開展實(shí)施，只在動物中獲得分娩［30］。近年來隨著3D 培養(yǎng)體系的建立和多步培養(yǎng)系統(tǒng)的完善［15］，利用卵巢早衰患者卵巢組織，人類休眠卵泡在體外培養(yǎng)獲得的卵母細(xì)胞可以達(dá)到MII 階段［31］。但該技術(shù)還存在體外培養(yǎng)周期長，獲得卵母細(xì)胞的效率和發(fā)育能力低下等缺點(diǎn)，至今還沒有利用卵巢組織體外培養(yǎng)獲得的卵母細(xì)胞受精產(chǎn)生囊胚的報道［10］。

盡管目前還沒有對女性卵巢組織實(shí)施IVA 技術(shù)后繼續(xù)體外培養(yǎng)獲得妊娠的報告，但該技術(shù)在今后臨床應(yīng)用研究中仍然具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＳ捎谂园┌Y發(fā)病率的升高，更多患者在進(jìn)行癌癥的化療、放療時，需提前采取卵巢組織冷凍的生育力保存措施，然而治愈后身體無法達(dá)到自體移植和激活卵巢組織的條件；另外有的患者卵巢組織發(fā)生病變，采取卵巢組織生育力保存后，如果再將發(fā)病的卵巢組織移植回體內(nèi)，將會大大增加患者再患病的風(fēng)險。倘若對這類患者實(shí)施IVA 技術(shù)后體外培養(yǎng)，不僅是保障患者安全、降低發(fā)病風(fēng)險的有效方案，也是實(shí)現(xiàn)這類不孕母親獲得具備自身遺傳物質(zhì)孩子愿望的唯一途徑［23］。

4 不足與展望

盡管IVA 技術(shù)具有創(chuàng)新性，但通過IVA 技術(shù)開展IVF 的妊娠率僅為9%［25］。近來也有報道對IVA技術(shù)的有效性提出了質(zhì)疑［32］。有研究認(rèn)為，通過IVA 技術(shù)獲得的卵母細(xì)胞DNA 損傷增加、DNA 修復(fù)能力受損［33］。另外，由于國內(nèi)外IVA 技術(shù)尚處研究階段，無法證實(shí)IVA 藥物不存在致癌或其他有害作用的可能性［25］。所以，IVA 技術(shù)要在臨床上推廣還有很大的探索空間。

一些有生育力需求的患者不能通過自體激活始基卵泡來獲取成熟卵母細(xì)胞受孕，想利用自己的卵母細(xì)胞來獲得妊娠成為她們的訴求，IVA 技術(shù)則是一個有效的解決途徑。IVA 技術(shù)可利用卵巢組織中殘余卵泡進(jìn)行激活發(fā)育［4，21］，使卵巢中的殘余卵泡得到充分利用。就當(dāng)前IVA 技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀而言，想要將其推向臨床還需解決更多問題。比如，通過IVA 技術(shù)獲得的卵泡、卵母細(xì)胞的發(fā)育質(zhì)量還有待驗(yàn)證和提高；IVA 技術(shù)的體外培養(yǎng)體系也需要進(jìn)一步完善；同時也還需要更規(guī)范的臨床方案和倫理制度來保障安全實(shí)施。卵巢組織的體外培養(yǎng)與激活是一個復(fù)雜的、多階段的過程，隨著研究的不斷深入，相信IVA 技術(shù)越來越成熟，將會繼續(xù)拓寬生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展領(lǐng)域，造福于更多不孕患者。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。