張 巖，宋桂華，于素平，呂偉剛，郭彥榮，陳小松，張冰雪，周鴻雲(yún)

（河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

支氣管哮喘是臨床常見的呼吸道慢性疾病之一。近年來，現(xiàn)代醫(yī)學對哮喘的研究不斷深入，防治藥物也日漸增多，但是哮喘的發(fā)病率并沒有顯著的下降趨勢［1］。研究發(fā)現(xiàn)，24%的哮喘患者需要使用GINA4-5 級的治療方案，17%的患者癥狀控制較差，其中包括3.7%依從性較好的患者［2］，哮喘的控制現(xiàn)狀不夠理想。全球哮喘防治倡議方案是哮喘的首選治療方案，特別是在急性發(fā)作期，β2-AR 激動劑吸入治療得到廣泛的應(yīng)用。相關(guān)統(tǒng)計表明［3］，近年來β2-AR 受體激動劑使用率已達73.4%，但長期使用β2-AR 激動劑可使其敏感性下降，成為哮喘難以控制的主要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)其原因主要與氣 道 黏 膜β2-AR 數(shù) 目 的 減 少，β-AR 激 酶（GRK2，GRK3）和β-抑制蛋白（β-arrestin）介導的β2-AR 同源減敏及細胞內(nèi)化后再循環(huán)密切相關(guān)［4-6］，從而導致藥物平喘效果欠佳。故對于β2-AR 減敏的哮喘患者尋求一種更有效的治療方法意義重大。

既往研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素及部分中藥可改善氣道黏膜上皮β2-AR 的數(shù)目，從而增加β2-AR 的敏感性［7，8］，但具體機制尚不確切，未進行深入的研究工作。β2-AR 減敏哮喘模型的造模方法尚未得到公認，且未進行多方位的相關(guān)試驗驗證。目前對β2-AR 減敏哮喘模型的研究主要集中在10 年前，造模周期多為35 天［9］，造模時間長，增加了模型的死亡幾率。我們課題組在前期進行了多次動物試驗［10，11］，成功模擬了21 天為周期的哮喘小鼠造模方法，并在此基礎(chǔ)上進行β2-AR 減敏哮喘模型的制備，經(jīng)驗證成功，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級 雄 性BALB /c 小 鼠30 只，體 重18～22 g，6 周齡，購于河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK（豫） 2020-0002。

1.2 主要試劑及儀器

卵清蛋白（OVA，批號：SLBD23）；氫氧化鋁粉（批號： 24623-75-3）；磷酸化蛋白酶抑制劑（Servicebio，貨 號：G2007）；β-actin（Servicebio，貨 號：GB12001）；RNA 提取液（Servicebio，貨號：G3013）；β2-AR（博奧森，貨號：bs-0947R）；IgE 試劑盒（sino best，貨號：CK-E30441）；乙酰甲膽堿（Mch，貨號：USP-1396364，USP）。

高速冷凍型微量離心臺式機（DragonLab 公司，型號：D3024R），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016），EMK 動物肺功能檢測儀等。

1.3 動物分組

共30 只小鼠根據(jù)體重按隨機數(shù)字表法分為空白組（A）、普通哮喘模型組（B）及β2-AR 減敏哮喘模型組（C）各10 只。除A 組外，其余2 組進行致敏。配制新鮮混懸液（生理鹽水1 mL、OVA 1 mg、氫氧化鋁200 mg），分別于第0 天、第7 天在小鼠兩側(cè)腹股溝、腹及前足跖4 點進行皮下注射混懸液各0.15 mL，同時腹腔注射0.5 mL，于實驗第14 天進行激發(fā)。B 組 小 鼠 置 于25 cm × 25 cm × 20 cm 大 小 的密閉容器中，使用高頻霧化器（CE，Germany）及1% OVA 試劑對小鼠進行霧化吸入激發(fā)，霧量控制為0.5 mL/min，每次霧化30 min，連續(xù)7 d。C 組同B 組激發(fā)前給予霧化吸入0.01%沙丁胺醇30 min，同時60 μg 的沙丁胺醇進行β2-AR 減敏，連續(xù)7 天，造模方法如圖1。試驗過程中普通哮喘模型組及β2-AR 減敏哮喘模型組各死亡1 只，造模成功小鼠首先表現(xiàn)為煩躁，頻繁抓耳撓腮，活動增強，后出現(xiàn)呼吸氣促，靜伏扎堆，皮毛豎立，較為嚴重出現(xiàn)縮胸，收腹，伸頸等喘息癥狀表現(xiàn)。

圖1 β2-AR 減敏哮喘小鼠造模方法Fig 1 The method of β2-AR desensitization asthma mice model

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 氣道高反應(yīng)性測定 最后一次OVA 誘導后24 小時，小鼠按順序分別吸入50 μL 的生理鹽水，6.5、12.5、25、50、100 mg/mL Mch，肺功能檢測小鼠的氣道阻力。

1.4.2 ELISA 檢測 處死小鼠，采取摘除眼球的方法收集血標本，ELISA 測定血清中IgE 含量。

1.4.3 觀察肺組織病理改變 首先清洗固定后的組織塊，按照時間順序進行乙醇脫水：75%乙醇8 h；85%乙醇5 h；95%乙醇3 h；100%乙醇1.5 h。其中95% 及100% 乙醇各換液一次，以保證充分脫水，然后置入二甲苯約2 h，至組織透明為止。浸蠟與包埋，切片與貼片：切片厚5 μm，采用電鏡觀察肺組織病理改變。

1.4.4 基因分析 RT-PCR 檢測肺組織中β2-ARm-RNA 的表達：（1）提取總RNA：肺組織勻漿后提取總RNA，測定樣品RNA 濃度和純度，置于-80 ℃冰箱中保存。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：參照試劑盒說明書配置，反應(yīng)終體積20 μL，42 ℃反應(yīng)30 min，85 ℃反應(yīng)5 min，反應(yīng)產(chǎn)物-20 ℃保存。（3）引物設(shè)計利用NCBI 在線引物設(shè)計工具設(shè)計β2-AR 及內(nèi)參GAPDH 的引物序列，上游引物為GAGCCTGCTGACCAAGAATAAG，下游引物為GCAAGTCTCCT CGGTGTAACAAT，并由武漢塞維爾生物科技有限公司合成。（4）實時熒光定量PCR 反應(yīng)以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，參照相關(guān)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，35～40 個循環(huán)，根據(jù)擴增曲線和溶解曲線，使用2-△△Ct 法分析各組相關(guān)基因的表達情況。

1.4.5 Western blot 法檢測肺組織中β2-AR 含量 用配制好的蛋白裂解液獲取蛋白總濃度，電泳后用轉(zhuǎn)濕儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜素。將5%脫脂奶密封過夜，環(huán)境溫度設(shè)置為4 ℃，其后添加一抗，搖動2 h 后，進行TBS-Tween 洗膜，共3 次，加入二抗，操作方法同前，最后應(yīng)用發(fā)光劑在X 光片上曝光、顯影、定影。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 氣道高反應(yīng)性測定

最后一次行OVA 激發(fā)后24 h，待小鼠呼吸平穩(wěn)后按照時間順序給予吸入50 μL 的生理鹽水，6.5、12.5、25、50、100 mg/mL Mch，檢測小鼠氣道阻力：當Mch 為12.5 mg/mL 時，β2-AR 減敏哮喘模型組與空白組相比，有統(tǒng)計學差異（t=-3.6，P＜0.01），β2-AR 減敏哮喘模型組與普通哮喘模型組相比，有統(tǒng)計學差異（t=-2.2，P＜0.05）；當Mch 為25 mg/mL 時，普通哮喘模型組與空白組相比，有統(tǒng)計學差異（t=-7.7，P＜0.01），β2-AR 減敏哮喘模型組與空白組相比，有統(tǒng)計學差異（t=-4.7，P＜0.01）；當Mch 為50 mg/mL 時，普通哮喘模型組與空白組相比，有統(tǒng)計學差異（t=-82.2，P＜0.01），β2-AR 減敏哮喘模型組與空白組相比，有統(tǒng)計學差異（t=-81.7，P＜0.01），β2-AR 減敏哮喘模型組與普通哮喘模型組相比，有統(tǒng)計學差異（t=15.3，P＜0.01）；當Mch 為100 mg/mL 時，普通哮喘模型組與空白組相比，有統(tǒng)計學差異（t=-121.3，P＜0.01），β2-AR減敏哮喘模型組與空白組相比，有統(tǒng)計學差異（t=-133.3，P＜0.01），β2-AR 減敏哮喘模型組與普通哮喘模型組相比，有統(tǒng)計學差異（t=-12.3，P＜0.01），見表1。

表1 各組氣道阻力結(jié)果比較 ［±s， cmH2O/（mL·s）］Tab 1 Comparison of airway resistance results in each group ［±s， cmH2O/（mL·s）］

表1 各組氣道阻力結(jié)果比較 ［±s， cmH2O/（mL·s）］Tab 1 Comparison of airway resistance results in each group ［±s， cmH2O/（mL·s）］

注：與空白組相比，*P＜0.05；與空白組相比，△P＜0.01；與普通哮喘模型組相比，■P＜0.05；與普通哮喘模型組相比，◆P＜0.01。

空白組Mch (mg/mL)β2-AR 減敏哮喘模型組106.3±6.3 110.9±3.7 125.7±7.8△■131.8±10.0△286.0±4.4△◆351.6±4.5*△◆0 6.25 12.5 25 50 100 103.4±3.5 107.3±5.6 115.7±3.8 116.1±3.3 124.6±4.2 136.5±2.3普通哮喘模型組104.9±3.5 108.0±3.7 118.5±5.3*129.2±4.1△259.6±2.7△325.6±4.3*

2.2 各組血液中IgE 水平

與空白組相比，普通哮喘模型組及β2-AR 減敏哮喘模型組IgE 水平均明顯上升（t= - 55.0，-62.8，P＜0.01）；但兩者之間比較差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.8，P＞0.05），見表2。

表2 各組IgE 檢測結(jié)果比較 （±s）Tab 2 Comparison of IgE test results in each group（±s）

表2 各組IgE 檢測結(jié)果比較 （±s）Tab 2 Comparison of IgE test results in each group（±s）

注：與空白組相比，*P＜0.01。

組 別IgE (ng/mL)β2-AR 減敏哮喘模型組242.9±7.5*空白組90.1±1.7普通哮喘模型組235.9±8.2*

2.3 各組小鼠肺組織病理學結(jié)果

HE 染色發(fā)現(xiàn)普通哮喘模型組及β2-AR 減敏哮喘模型組小鼠肺組織支氣管和支氣管壁可見大量炎癥細胞浸潤，上皮脫落，肺泡與間質(zhì)充血、水腫，各級支氣管管壁增厚，管道變窄?？瞻捉M支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯病理改變。且β2-AR 減敏哮喘模型組較普通哮喘模型組病理改變更加明顯，見圖2。

圖2 HE 染色肺組織病理切片（×400）Fig 2 HE staining results of lung tissue pathological slices（×400）

2.4 RT-PCR 檢測肺組織中β2-ARmRNA 的表達

β2-AR 減敏哮喘模型組的表達（0.81±0.91）與空白組（1.20±0.45）相比下降，無統(tǒng)計學差異（t=1.2，P=0.24）；與普通哮喘模型組（1.54±0.07）相比，差異顯著（t=-2.4，P=0.02），見圖3，。

圖3 各組肺組織β2-ARmRNA 的表達情況Fig 3 β2-ARmRNA expression in lung tissue

2.5 Western blot 測定各組肺組織中β2-AR 的表達情況

β2-AR 減敏哮喘模型組的表達（0.24±0.17）與空白組（0.59±0.29）相比下降，有統(tǒng)計學差異（t=-3.1，P=0.006）；與普通哮喘模型組（0.75±0.40）相比，差異更加顯著（t=-3.5，P=0.003），見圖4。

圖4 Western Blot 檢測小鼠肺組織 β2-AR 蛋白的表達Fig 4 β2-AR protein expression in lung tissue of the mice by Western blot

3 討論

β2-AR 激動劑可擴張支氣管，且對肥大細胞具有一定的保護作用，可抑制肥大細胞脫顆粒，減少白三稀及其他炎癥介質(zhì)的釋放，是哮喘發(fā)作首選藥物［12，13］。但 長 期 重 復 使 用β2-AR 激 動 劑 導 致β2-AR敏感性下調(diào)，進而引起哮喘難以控制。盡管目前已經(jīng)開發(fā)出長效類β2-AR 激動劑與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用的吸入劑型，但對部分患者臨床療效仍不滿意，不能有效的、短時間控制哮喘的發(fā)作，故對β2-AR 減敏的研究仍非常重要。

目前對β2-AR 減敏的研究主要集中在細胞外同源減敏及細胞內(nèi)β2-AR 循環(huán)降解方面，主要采用以BALB/C小鼠哮喘模型的基礎(chǔ)上，沙丁胺醇反復刺激來進行β2-AR 減敏哮喘模型的制備，周期為35天［9］，造模時間相對較長，易出現(xiàn)試驗動物的死亡，故尋求一種新的短期的造模方法對β2-AR 減敏機制的研究及尋求治療的靶點藥物尤為重要。本研究在課題組前期已成功造模的哮喘小鼠模型基礎(chǔ)之上［10，11］，參考相關(guān)文獻，探索性的建立了周期為21天β2-AR 減敏哮喘小鼠模型的制備方法，采用對小鼠肺組織HE 染色觀察了模型是否具有典型的哮喘氣道黏膜病理結(jié)構(gòu)，肺功能及血清IgE 檢測驗證模型是否具有哮喘氣道高反應(yīng)性及炎癥反應(yīng)特征，RT-PCR 及Western blot 實驗技術(shù)，對肺組織中β2-AR 及β2-ARmRNA 的表達進行測量，觀察β2-AR數(shù)目是否下降，綜合驗證β2-AR 減敏哮喘小鼠模型是否成功。

氣道炎癥是哮喘的主要病理特征之一［14］。本研究結(jié)果表明，對肺組織進行HE 染色后β2-AR 減敏哮喘小鼠模型具有典型的哮喘氣道病理改變，與空白組相比有明顯的氣道炎癥浸潤，黏液過度分泌及膠原沉積，且均較普通哮喘模型組的病理表現(xiàn)明顯加重，從病理上證實該模型成功。氣道高反應(yīng)性是哮喘的基本特征之一［15］，肺功能檢測在哮喘的診療及鑒別診斷中占有重要地位［16，17］。本研究對試驗小鼠進行肺功能檢測提示，經(jīng)霧化吸入及腹腔注射沙丁胺醇的小鼠模型氣道反應(yīng)性明顯增加，這一結(jié)果與既往文獻報道長期或頻繁使用β2受體激動劑導致支氣管平滑肌對其耐受性增加的觀點是一致的［18］，驗證了β2-AR 減敏哮喘小鼠模型具有更高的氣道高反應(yīng)性，符合β2-AR 耐藥患者的臨床表現(xiàn)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)特異性IgE 和總IgE 是多種表型哮喘的生物標志物［19］，IgE 介導的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)在支氣管哮喘發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用，本研究中使用沙丁胺醇干預(yù)后模型小鼠血清IgE 的表達較空白組明顯增強，而現(xiàn)代醫(yī)學認為IgE 增高為哮喘患者典型臨床表現(xiàn)之一，從而進一步證實β2-AR 減敏哮喘小鼠模型具有哮喘的典型特征。對三組模型肺組織中β2-AR 及β2-ARmRNA 的測定發(fā)現(xiàn)，β2-AR減敏哮喘小鼠模型中兩者的表達均較空白組及普通哮喘模型組有下降趨勢，且較普通哮喘模型組的下降更為明顯，從而證實了模型肺組織中具有β2-AR 數(shù)量較少的特點，進一步驗證了β2-AR 減敏哮喘小鼠模型的成功。普通哮喘小鼠肺組織中β2-AR及β2-ARmRNA 的表達均較空白組上升，呈現(xiàn)一致性的表現(xiàn)，可能與哮喘狀態(tài)下β2-AR 大量向肺組織聚集相關(guān)，但這一結(jié)果與既往研究不一致，如高海鵬研究發(fā)現(xiàn)哮喘大鼠發(fā)作期肺組織β2-ARmRNA 水平與空白組相比顯著降低［20］，這也許與造模及取材時間不一致相關(guān)。此外肺內(nèi)β2-AR 的變化在不同的細胞類型并不完全一致，相關(guān)研究［21］提示正常大鼠肺組織內(nèi)以血管，氣道上皮β2-ARmRNA 分布最多，大氣道平滑肌及肺泡上皮β2-ARmRNA 水平相對較低，可能不同的造模方法對其有一定的影響，具體機制有待進一步探索。

綜上所述，本實驗建立的小鼠模型，在氣道阻力水平、血清IgE 水平、肺組織病理及β2-AR 表達水平均符合β2-AR 減敏哮喘模型標準，為進一步探索β2-AR 減敏哮喘的發(fā)病機制及靶向藥物的選擇提供了實驗基礎(chǔ)。

作者貢獻度說明：

張巖：課題審計及論文撰寫；宋桂華：質(zhì)量控制及論文校審；于素平：數(shù)據(jù)的分析；呂偉剛、周鴻雲(yún)、張冰雪：動物造模；郭彥榮，陳小松：指標檢測。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。