陶松若，廖翠怡，彭金菊，張騰月，戴 悅，馬 驛,2,3*

(1.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，廣東湛江 524088；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東茂名 525032；3.粵西地區(qū)畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088)

土壤環(huán)境中存在著大量具有解磷能力的微生物，能夠?qū)㈦y溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的磷素[1]。據(jù)研究報(bào)道，施入解磷菌群能有效提高土壤中的有效磷、全磷含量以及堿性磷酸酶活性，進(jìn)而促進(jìn)油菜的生長發(fā)育，其中細(xì)菌的促進(jìn)效果最明顯[2]。將解磷菌制成解磷菌肥施入土壤能提高玉米株高、氮磷含量，增加土壤的可溶性磷含量[3]。此外，解磷微生物釋放的磷素還可以降低土壤中重金屬的活性，減弱因外部環(huán)境使用含磷物質(zhì)而導(dǎo)致的污染[4]。

氟苯尼考為動物專用抗生素，廣泛應(yīng)用于動物細(xì)菌性疾病的防治[5]。氟苯尼考進(jìn)入動物機(jī)體后，一部分藥物會在動物體內(nèi)殘留，另一部分藥物及其代謝物隨著動物排泄物進(jìn)入土壤中，給生態(tài)環(huán)境帶來污染[6]?？股剡M(jìn)入土壤環(huán)境中能影響土壤微生物群落功能多樣性[7]。目前，有關(guān)氟苯尼考對解磷菌解磷能力的影響鮮見報(bào)道。該試驗(yàn)利用鉬銻抗分光光度法，測定解磷菌在不同濃度氟苯尼考的條件下培養(yǎng)解磷能力之間的差異，旨在為氟苯尼考在環(huán)境中殘留對環(huán)境微生物產(chǎn)生的生態(tài)毒理影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試土壤。采自廣東海洋大學(xué)校內(nèi)菜地，經(jīng)檢測不含氟苯尼考。土壤理化性質(zhì)：pH 5.42、堿解氮22.16 mg/kg、全氮0.55 g/kg、速效磷46.80 mg/kg、速效鉀263.25 mg/kg、有機(jī)質(zhì)10.97 g/kg、鹽度88 μS/cm。

1.1.2藥品與試劑。氟苯尼考(含量98%，山東國邦藥業(yè)有限公司，批號701-2005101)；LB液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基(北京路橋技術(shù)股份有限公司)；無機(jī)磷固體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；無機(jī)磷液體培養(yǎng)基(北京酷來搏科技有限公司)；抗壞血酸、酒石酸銻鉀、鉬酸銨、KH2PO4(上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司)；無水乙醇、濃H2SO4均為分析純；氟苯尼考藥液(ρ=1 mg/mL)：稱取0.05 g的氟苯尼考粉末，加入無水乙醇溶解，完全溶解后移入50 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度線。

1.1.3鉬銻抗分光光度法試劑。鉬銻抗分光光度法所需試劑參照王明歡等[8]的方法進(jìn)行配制。①10%抗壞血酸：將10 g抗壞血酸(AR)用少量蒸餾水溶解后定容至100 mL，用棕色瓶保存于4 ℃。②13%鉬酸銨溶液：將13 g鉬酸銨(AR)用少量蒸餾水溶解后定容至100 mL。③0.35%酒石酸銻鉀溶液：將0.35 g酒石酸銻鉀(AR)用少量蒸餾水溶解后定容至100 mL。④硫酸溶液：將150 mL的濃硫酸(AR)用玻璃棒緩緩引流入150 mL蒸餾水中，配制成300 mL的硫酸溶液。⑤鉬酸鹽溶液：將13%鉬酸銨溶液用玻璃棒引流徐徐加入硫酸溶液中，再用玻璃棒攪拌充分混勻，待溶液冷卻后再緩緩加入0.35%酒石酸銻鉀溶液，冷卻后儲存在棕色玻璃瓶中于4 ℃保存。⑥磷酸鹽儲備溶液(ρ=100 mg/L):稱取0.439 0 g KH2PO4經(jīng)105 ℃烘干2 h后溶于200 mL蒸餾水中，加入5 mL(1+1)濃硫酸，轉(zhuǎn)入1 000 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。⑦磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液(ρ=5 mg/L):量取5 mL 的磷酸鹽儲備溶液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.4主要儀器?？烧{(diào)微量移液器(Eppendorf，德國)；生化培養(yǎng)箱(SPX-250，上海福絮實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備廠)；不銹鋼手提式滅菌器(DSX-280B，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)；超凈工作臺(SW-CJ-1D，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電子天平(JJ323BC，常熟市萬杰測試儀器廠)；臺式恒溫?fù)u床(TS-100C，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)；可見分光光度計(jì)(V-1000，上海翱藝儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1解磷菌的分離培養(yǎng)。稱取土壤樣品用蒸餾水稀釋制備濃度適合的菌懸液，吸取菌懸液于無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，均勻涂布，30 ℃培養(yǎng)72 h。挑取具有明顯、透明溶磷圈的單一菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，30 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后加30%甘油于-20 ℃保存。采用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組并擴(kuò)增16S rDNA片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司測序，測序結(jié)果在NCBI上Blast后對比分析。

1.2.2繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別吸取5 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液0、1、2、3、4、5、6 mL于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)磷溶液，加入1 mL 抗壞血酸，充分混勻后加入2 mL鉬酸鹽，顯色20 min后用分光光度計(jì)讀取700 nm的吸光度。以蒸餾水作為參照，標(biāo)準(zhǔn)磷濃度作為橫坐標(biāo)、OD700值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3磷含量測定。將菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜，作為種子液。于50 mL無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中加入氟苯尼考使培養(yǎng)基中含藥濃度分別為0、0.1、1.0、10.0、50.0 μg/mL，按照1%的接種量將種子液加入藥物培養(yǎng)基中，加入等體積的蒸餾水作為空白對照，每組3個(gè)重復(fù)；在30 ℃的條件下，160 r/min搖床振蕩5 d，每24 h取2 mL培養(yǎng)液10 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液移入50 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，加入1 mL抗壞血酸，充分混勻后加入2 mL鉬酸鹽溶液，顯色20 min后用分光光度計(jì)讀取700 nm的吸光度?？扇苄粤缀?mg/L)的計(jì)算公式為P=K×V/V1，式中，P為可溶性磷含量；K為從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的速效磷含量(mg/L)；V為顯色液總體積(mL)；V1為上清液體積(mL)[9]。

1.2.4細(xì)菌濃度測定。于培養(yǎng)的第5天量取細(xì)菌培養(yǎng)液，用LB液體培養(yǎng)基稀釋到適合的濃度。吸取不同濃度的細(xì)菌懸液各10 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h，之后選取菌落長勢良好的平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，菌液濃度計(jì)算公式：菌液濃度(CFU/mL)=(菌落數(shù)×稀釋度)/0.01。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理用Origin 2021函數(shù)繪圖軟件整理數(shù)據(jù)并作圖；試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 23統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行解磷菌溶磷含量的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌16S rDNA鑒定結(jié)果測序結(jié)果經(jīng)Blast后對比分析，分離的10株土壤優(yōu)勢解磷菌主要為伯克霍爾德菌屬、羅爾斯頓菌屬和窄食單胞菌屬細(xì)菌。

2.2 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制從圖1可以看出，磷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度及對應(yīng)的吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.252 5x-0.000 7(R2=0.998 9)，表明線性回歸良好。

圖1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Phosphorus standard curve

2.3 磷含量將從土壤中分離出的10株解磷菌于不同濃度氟苯尼考的條件下培養(yǎng)，每24 h測量其培養(yǎng)液中的速效磷含量，選取最具代表性的培養(yǎng)時(shí)間的測定值繪制曲線圖，10株解磷菌在不同藥物濃度下的溶磷效果見表1。從表1可以看出，10株解磷菌在50.0 μg/mL藥物濃度下，培養(yǎng)基中速效磷含量明顯低于其他藥物濃度組。其中，菌株P(guān)64、P33、P51、P53、P32、P42的溶磷含量隨藥物濃度的增加逐漸下降，與藥物濃度呈反比；菌株P(guān)35、P93在藥物濃度為0～0.1 μg/mL時(shí)，溶磷含量上升，藥物濃度為>0.1～50.0 μg/mL時(shí)，溶磷含量下降；而菌株P(guān)62、P13并沒有表現(xiàn)出規(guī)律的溶磷效果，P13的溶磷效果波動較大。

表1 10株解磷菌在不同藥物濃度下培養(yǎng)的溶磷效果

2.3 細(xì)菌濃度從10株解磷菌在第5天時(shí)菌液濃度(表2)可以看出，菌株P(guān)42的菌液濃度在藥物濃度為0～50.0 μg/mL 時(shí)整體呈上升趨勢；菌株P(guān)64在藥物濃度為0～10.0 μg/mL時(shí)，菌液濃度逐漸下降，在50.0 μg/mL時(shí)反而回升；菌株P(guān)51在藥物濃度為0～1.0 μg/mL時(shí)菌液濃度逐漸下降，在10.0 μg/mL時(shí)上升之后又回降；菌株P(guān)53的菌液濃度在藥物濃度為0～50.0 μg/mL時(shí)呈逐漸下降趨勢，在50.0 μg/mL 時(shí)降至0；而其他菌株在藥物濃度0～50.0 μg/mL時(shí)，菌液濃度并沒有太大變化。

表2 10株解磷菌培養(yǎng)第5天時(shí)菌液濃度

對10株解磷菌培養(yǎng)至第5天時(shí)的速效磷含量和菌液濃度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖2所示。從線性方程可以看出，10株菌的速效磷含量與菌液濃度均無明顯相關(guān)性，r值為-0.311～0.879，P≥0.05，說明10株解磷菌溶磷效果的降低與菌體的生長繁殖并無明顯關(guān)聯(lián)。

圖2 速效磷含量與菌液濃度相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between available phosphorus content and bacterial solution concentration

3 討論與結(jié)論

解磷菌主要有3種不同的解磷機(jī)理：一是解磷菌自身能分泌大量酸性物質(zhì)，包括檸檬酸、草酸、酒石酸、乙酸、甲酸和琥珀酸等，這些酸性物質(zhì)能溶解土壤中的難溶性磷酸鹽；二是解磷菌在進(jìn)行呼吸作用時(shí)釋放出二氧化碳等物質(zhì)，能增加土壤的酸度，從而增強(qiáng)難溶性磷酸鹽的溶解度[10]；三是通過分泌磷酸酶、植酸酶等物質(zhì)使有機(jī)磷酸酯或有機(jī)磷酸鹽降解，從而提高土壤中有效磷含量[11]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，生物炭理化性質(zhì)能夠刺激解磷微生物的生長與活性，增強(qiáng)解磷菌分泌磷酸酶的能力，從而提升解磷效果[12]。羅利均[13]通過紫外線-氯化鋰對解磷菌誘導(dǎo)變異，結(jié)果顯示，菌株的植酸酶基因phyC上的第81、89、148位氨基酸發(fā)生變異，該區(qū)域?qū)儆谥菜崦傅慕Y(jié)構(gòu)功能域，菌株增加了2個(gè)對Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而增強(qiáng)了菌株的解磷能力。郭藝鵬等[14]對解磷菌進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)發(fā)酵和滅活后培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)常規(guī)培養(yǎng)的解磷菌都表現(xiàn)出較好的解磷能力，滅活后的解磷菌解磷能力基本消失。張晶晶等[15]將從土壤中分離得到的14株解磷菌用利福平進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果顯示，大多數(shù)解磷菌的解磷能力下降，有些菌株甚至失去解磷能力。該研究設(shè)置不同濃度的氟苯尼考對解磷菌的生長進(jìn)行脅迫，當(dāng)藥物濃度為50.0 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)基中速效磷含量明顯比其他藥物濃度組的低；6株菌(P64、P33、P51、P53、P32、P42)的溶磷含量隨藥物濃度的增加逐漸下降；菌株P(guān)35、P93在藥物濃度為0～0.1 μg/mL時(shí)，溶磷含量上升，藥物濃度為0.1～50.0 μg/mL時(shí)，溶磷含量下降；而菌株P(guān)62、P13并沒有表現(xiàn)出規(guī)律的溶磷效果，P13的溶磷效果有較大的波動。在高濃度藥物條件下，菌株的溶磷效果下降，然而對應(yīng)的菌液濃度卻沒有太大的變化，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，10株菌的培養(yǎng)液中速效磷含量與菌液濃度并無明顯相關(guān)性，說明菌株溶磷效果的下降與菌液的生長繁殖關(guān)聯(lián)并不大。

抗生素在微生物環(huán)境中殘留，會增加細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)，抗生素的種類和濃度的增加也可能改變微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性和功能[16]，還會對微生物的碳源利用率、特殊菌群的功能結(jié)構(gòu)及酶活性等產(chǎn)生抑制作用[17]。當(dāng)土壤中磺胺甲噁唑的殘留濃度達(dá)到100 mg/kg時(shí)，土壤中微生物種群密度在7 d后能觀察到明顯下降，且對糖類的利用率也有抑制作用[18]。土壤中土霉素的殘留濃度達(dá)到140 mg/kg時(shí)，微生物利用碳源的種類被顯著改變，土壤中脲酶活性及堿性磷酸酶活性受到明顯抑制[19]。該研究在培養(yǎng)基中加入不同濃度的氟苯尼考，當(dāng)藥物濃度為50.0 μg/mL時(shí)，解磷菌的解磷能力顯著下降，說明高濃度氟苯尼考對解磷菌的解磷功能產(chǎn)生了抑制。