單 宇， 張明玥， 沙麗娜， 張 亮， 劉曉航， 高曉黎,4

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 烏魯木齊 830017； 2新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院， 烏魯木齊 830054；3新疆第二醫(yī)學(xué)院， 新疆 克拉瑪依 834000； 4新疆及中亞特色醫(yī)藥資源教育部工程研究中心， 烏魯木齊 830017)

甘草酸是中藥甘草的主要活性成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抑制病毒增殖和對病毒滅活、促進(jìn)肝細(xì)胞增殖作用[1-3]。甘草酸制劑廣泛用于治療各種病毒性肝炎[4-6]、藥物性肝病[7-9]、肝硬化[10]，濕疹[11]、銀屑病[12]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[13-14]等。復(fù)方甘草酸苷片中主要活性成分甘草酸苷，由一分子甘草次酸和兩分子葡萄糖醛酸組成，口服后甘草酸苷水解為甘草酸，其中大部分甘草酸被腸道菌群代謝為甘草次酸吸收入血，剩余的甘草酸在腸道吸收入血在肝臟中代謝為甘草次酸，甘草次酸的藥理活性強(qiáng)于甘草酸[15-16]。體內(nèi)甘草酸的含量受制劑、腸道菌群、肝臟代謝水平等因素影響，遠(yuǎn)低于甘草次酸[17-19]。目前體內(nèi)甘草酸和甘草次酸的檢測方法主要有HPLC-UV和LC-MS/MS等方法[20-23]，但同時測定甘草酸及甘草次酸的分析方法較少。本實(shí)驗(yàn)探索建立更靈敏、高效的UPLC-MS/MS法同時檢測大鼠血漿中甘草酸及甘草次酸的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器ACQUITY 型超高效液相色譜儀，XEVO-TQS micro型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國Waters公司)；高速臺式低溫離心機(jī)(英國Thermo Fisher Scientific公司)；Milli-Q A10型純水儀(密理博公司)；MS105 型十萬分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 藥品與試劑甘草酸(上海源葉生物科技有限公司，B20417，純度≥98%)、甘草次酸(上海源葉生物科技有限公司，B20412，純度≥98%)、格列喹酮(上海源葉生物科技有限公司，B20444，純度≥98%)，甲醇、乙腈(Thermo Fisher Scientific公司，LC-MS級)，乙酸銨(CNW Technologies公司，HPLC級)，復(fù)方甘草酸苷片(美能?)(Akiyama Jozai Co.,Ltd，17322)。

1.3 動物SPF級SD 大鼠雌雄對半，體重275±25 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號為SYXK(新)2018-0003；飼養(yǎng)條件：普通級IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)，溫度 20～25℃，濕度40%～70%，光照12 h，自由進(jìn)食與飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動相：5 mmoL/L乙酸銨(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～0.3 min：80%B，1.8～5 min：10%B，5.5～8 min：80%B)，流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子檢測模式；三重四極桿分析器；掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)。脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流：800 L/Hr；待測物及內(nèi)標(biāo)檢測參數(shù)見表1。用于定量的離子反應(yīng)分別為甘草酸[M-H]-821.5/351.1、甘草次酸[M-H]-469.4/355.4、格列喹酮[M-H]-526.3/386.1。

表1 各待測物母離子、子離子、駐留時間、錐孔電壓及碰撞能量

2.3 溶液配制

2.3.1 對照品儲備液制備 精密稱取甘草酸對照品、甘草次酸對照品適量分別置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，制得濃度分別為200 μg/mL、4 000 μg/mL甘草酸和甘草次酸對照品儲備液。精密稱取內(nèi)標(biāo)格列喹酮適量置于100 mL容量瓶，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制得150 ng/mL格列喹酮內(nèi)標(biāo)溶液，以上溶液均儲存于4℃冰箱。

2.3.2 系列對照品溶液制備 從冰箱中取出各對照品儲備液，放置室溫后，用甲醇稀釋成不同濃度的系列溶液，最后按其濃度級別混合均勻，得1～11號混合對照品系列質(zhì)量濃度的溶液(甘草酸：0.1、0.2、0.5、1、3、6、9、12、18、24、29 μg/mL；甘草次酸0.4、9、28、67、90、112、140、168、196、224、269 μg/mL)。

2.4 血漿樣品前處理取100 μL血漿樣品于1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋2 min，加入1 000 μL甲醇沉淀蛋白，2 000 r/min渦旋混勻5 min，離心(4℃，14 000 r/min)10 min 得上清液1，取100 μL上清液1, 離心(4℃，14 000 r/min)10 min，得上清液2作為甘草次酸測試樣品，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。另取上清液850 μL，40℃水浴N2吹干，加90 μL甲醇復(fù)溶，3 000 r/min渦旋5 min，離心(4℃，14 000 r/min)10 min，得上清液3作為甘草酸測試樣品進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 分別取大鼠的空白血漿，配制空白樣品、甘草酸與甘草次酸對照品血漿質(zhì)量控制樣品，以及大鼠灌胃復(fù)方甘草酸苷片后的樣品，按“2.4”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法處理后進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。由圖1可見，甘草酸、甘草次酸和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為3.14、4.96、4.31 min，甘草酸、甘草次酸血漿中基質(zhì)與內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，內(nèi)標(biāo)無干擾。表明本方法對甘草酸、甘草次酸專屬性強(qiáng)。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 取1～11號混合對照品溶液10 μL，加入空白血漿90 μL，渦旋2 min，得混合對照品血漿，按“2.4”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法處理，按色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，以甘草酸或甘草次酸濃度為橫坐標(biāo)，甘草酸或甘草次酸與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算。甘草酸線性方程為：Y=0.545 051X+0.010 71(r=0.994 8)，線性范圍為：0.009 9～2.899 0 μg/mL，定量下限為0.009 0 μg/mL；甘草次酸線性方程為：Y=1.77 627X-0.004 328(r=0.998 3)，線性范圍為：0.040 0～26.890 0 μg/mL，定量下限為0.040 0 μg/mL。

2.5.3 準(zhǔn)確度與精密度 按“2.2.3”方法，將儲備液稀釋得到12～14號混合對照品高、中、低濃度溶液(甘草酸：0.3、5、15 μg/mL；甘草次酸1.2、100、150 μg/mL)取12～14混合對照品高、中、低濃度溶液10 μL，加入空白血漿90 μL，渦旋2 min，得混合對照品血漿，平行配制 6 份，按“2.4”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法處理，按色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，連續(xù)制備測定 3 批，按照當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算準(zhǔn)確度，計算甘草酸苷與甘草次酸的準(zhǔn)確度、日內(nèi)、日間精密度。甘草酸苷與甘草次酸準(zhǔn)確度在80%～120 %之內(nèi)，日內(nèi)精密度與日間精密度試驗(yàn)的RSD%均小于20%，準(zhǔn)確度好、精密度高，符合分析方法的要求，見表2、3。

注：a為空白血漿；b為甘草酸與甘草次酸對照品血漿質(zhì)量控制樣品；c為大鼠灌胃復(fù)方甘草酸苷片后的樣品。

表2 血漿中甘草酸準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度、日間精密度(n=6)

表3 血漿中甘草次酸準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度、日間精密度(n=6)

2.5.4 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng) 按“2.5.3”項(xiàng)制備低、中、高混合對照品血漿，按“2.4” 項(xiàng)下方法處理后測定，該組峰面積記作A。另取空白血漿按“2.4”項(xiàng)下方法處理，取980 μL于EP管中，分別加入10 μL低、中、高三個濃度的甘草酸與甘草次酸對照品血漿質(zhì)量控制樣品的混合工作溶液與 10 μL格列喹酮內(nèi)標(biāo)溶液,渦旋震蕩2 min，離心(4℃，14 000 r/min)10 min 得上清液1，取100 μL上清液1, 離心(4℃，14 000 r/min)10 min，得上清液2作為甘草次酸測試樣品進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。另取上清液850 μL，40℃水浴N2吹干，加90 μL甲醇復(fù)溶，3 000 r/min渦旋 5 min，離心(4℃，14 000 r/min)10 min，得上清液3作為甘草酸測試樣品進(jìn)行 UPLC-MS/MS 分析，按色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，該組峰面積記作 B。將與 B 組質(zhì)量濃度相同的低、中、高3個濃度甘草酸與甘草次酸對照品混合溶液以及格列喹酮內(nèi)標(biāo)溶液分別按色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，該組峰面積記作C。分別計算低、中、高血漿質(zhì)量控制樣品及內(nèi)標(biāo)的提取回收率(提取回收率=A/B×100%)；基質(zhì)效應(yīng)：分別計算低、中、高血漿質(zhì)量控制樣品及內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)(基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%)，得出分析物與內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子。甘草酸、甘草次酸的提取回收率，基質(zhì)效應(yīng)均在90%左右，表明方法的提取回收率較高且穩(wěn)定，質(zhì)譜響應(yīng)離子增加或抑制效果不明顯，符合對生物樣品測定要求，結(jié)果見表4。

表4 血漿中甘草酸與甘草次酸提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)(n=6)

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 考察了血漿樣品的短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。短期穩(wěn)定性包括血漿樣品室溫放置 4 h提取處理，進(jìn)樣器10℃放置24 h，及-20℃3次凍融循環(huán)后血漿樣品的穩(wěn)定性；長期穩(wěn)定性考察-80℃冰箱放置 15 d血漿樣品的穩(wěn)定性。在上述各條件下，樣品均保持穩(wěn)定，結(jié)果見表5。

表5 血漿中甘草酸與甘草次酸樣品的穩(wěn)定性(n=6)

2.5.6 殘留效應(yīng) 定量上限樣品后立即分析 3 針空白樣品，并在 3 批標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品后重復(fù)操作，空白樣品在甘草酸、甘草次酸、格列喹酮的保留時間均無響應(yīng)，且在生物樣品分析期間隨行空白樣品均無響應(yīng)，此方法無殘留效應(yīng)，符合生物樣品分析方法的要求。

3 藥動學(xué)試驗(yàn)

3.1 試驗(yàn)方法SD大鼠12只，雌雄各半，給藥前12 h禁食，自由飲水，動物在實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，于給藥后3 h自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)SPF級鼠糧。大鼠按劑量6.75 mg/kg灌胃復(fù)方甘草酸苷片溶液，于0、0.5、1、1.5、2、3、5、7、8、9、10、12、24、50 h眼眶靜脈叢采血，置于肝素化的EP管中，于4℃，5 000 r/min離心10 min，分離血漿，置于-80℃冰箱冷凍貯存?zhèn)溆茫鳛闃悠费獫{，總采血量1.4 mL，并對大鼠及時補(bǔ)液。

3.2 試驗(yàn)結(jié)果采用Winnonlin軟件，非房室模型統(tǒng)計分析其藥動學(xué)參數(shù)，甘草酸、甘草次酸血藥濃度-時間曲線分別如圖2和圖3所示，藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果如下：甘草酸Tmax為(1.83±0.41) h，Cmax為(0.42±0.04) μg/mL，AUC0-∞為(2.13±0.43) h·μg-1·mL-1，t1/2為(16.74±8.45) h。代謝產(chǎn)物甘草次酸Tmax為(7.5±1.64) h，Cmax為(3.58±0.65)μg/mL，AUC0-∞為(25.24±0.86) h·μg-1·mL-1，t1/2為(8.97±3.22) h。

圖2 甘草酸血藥濃度-時間曲線(n=6)

圖3 甘草次酸血藥濃度-時間曲線(n=6)

4 討論

常見的血漿樣品前處理方式為液液萃取法與沉淀蛋白法[23]，根據(jù)甘草酸及甘草次酸的理化性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)對血漿樣品的前處理方法進(jìn)行篩選，其中液液萃取法用乙酸乙酯提取后的血漿樣品與待測物質(zhì)存在干擾且存在乳化現(xiàn)象，提取回收率較低，故本實(shí)驗(yàn)采取沉淀蛋白法。前期實(shí)驗(yàn)對蛋白沉淀劑進(jìn)行篩選，血漿在流動相混合溶液作為沉淀劑時，處理后可見混懸物，效果不好；乙腈作為蛋白沉淀劑時，處理后樣品澄清透明，但每次測定分析后，色譜柱壓力大幅度增加，易損傷色譜柱。將蛋白沉淀劑改為甲醇，進(jìn)行沉淀劑體積考察后，發(fā)現(xiàn)最終確定的血漿前處理方法待測物與內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，色譜圖峰型較好，故采用甲醇沉淀法作為本實(shí)驗(yàn)的前處理方法。

甘草酸苷制劑口服后，甘草酸苷經(jīng)胃酸水解或經(jīng)肝中β-葡萄糖醛酸苷酶水解為甘草次酸，甘草次酸在肝腸循環(huán)中經(jīng)腸內(nèi)菌作用部分生成 3-表-甘草次酸及少量的 3 -脫氫甘草次酸[19]，最終代謝為甘草次酸。本實(shí)驗(yàn)中部分大鼠甘草次酸藥時曲線出現(xiàn)雙峰，證明甘草次酸進(jìn)入體內(nèi)后存在腸肝循環(huán)，提示該品種的吸收存在較大的個體間差異，人體生物等效性的研究需考慮增大試驗(yàn)樣本量，得到更可靠的結(jié)果。

本試驗(yàn)建立了可同時準(zhǔn)確地檢測血漿中甘草酸及甘草次酸含量的UPLC-MS/MS方法，線性范圍廣，靈敏度高，檢測時間短。該分析方法可為甘草酸苷制劑人體生物等效性研究、甘草酸與甘草次酸的血藥濃度檢測提供參考。