張雅倫，李永波，張 濤，陳 晨，張 捷，周 巍*，張 巖*

（河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（特殊食品監(jiān)督管理技術(shù)），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北 石家莊 050071）

發(fā)酵乳是以乳及乳制品為原材料，經(jīng)過(guò)滅菌處理，接種特定的微生物發(fā)酵而生成的酸性凝乳狀制品，通常為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵，因其獨(dú)特的口感和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值備受人們喜愛(ài)，已成為當(dāng)今乳制品研究的主要方向之一[1-5]。為更好提升發(fā)酵乳風(fēng)味和保健功效，研究人員接種時(shí)還添加其他益生菌，如植物乳桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌等[6-7]。植物乳桿菌在酸乳發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生雙乙酰、乙酸及其他代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物一方面加快酸乳生化反應(yīng)進(jìn)程，縮短成熟時(shí)間，豐富風(fēng)味，改善質(zhì)地[8]，另一方面還具有有效降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老等多種對(duì)人體有益的保健功效[9]。雖然植物乳桿菌的益處較多，但是企業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵乳因植物乳桿菌污染帶來(lái)的口味改變、質(zhì)量下降的情況還是屢見(jiàn)不鮮，也成為了影響品牌的關(guān)鍵因素之一[10-11]。

目前食品微生物檢驗(yàn)方面針對(duì)食品中植物乳桿菌的快速檢測(cè)方法較少，國(guó)標(biāo)為乳桿菌屬檢測(cè)，分子生物學(xué)檢驗(yàn)為較為常見(jiàn)的檢驗(yàn)方法[12-13]。國(guó)標(biāo)檢驗(yàn)植物乳桿菌需進(jìn)行后續(xù)碳水反應(yīng)鑒定，且國(guó)標(biāo)的微生物方法需進(jìn)行培養(yǎng)、純化、鑒定等步驟，時(shí)間較長(zhǎng)，易受主觀因素影響，無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需求[14]。分子生物學(xué)方法主要為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)，但受非特異性擴(kuò)增、儀器價(jià)格昂貴等因素影響，在基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)不能得到廣泛推廣使用[15]。依賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增（helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）檢測(cè)方法是以PCR為基礎(chǔ)的新型恒溫基因擴(kuò)增方法，主要是利用解旋酶在恒溫下解開(kāi)DNA雙鏈，同時(shí)DNA單鏈結(jié)合蛋白，再由DNA聚合酶催化合成互補(bǔ)鏈，不斷進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)增長(zhǎng)[16]。和其他擴(kuò)增方法相比，HDA法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、更加便捷有效等特點(diǎn)[17-20]。

本研究通過(guò)HDA法建立一種快速檢測(cè)發(fā)酵乳中植物乳桿菌的方法，通過(guò)多種菌株擴(kuò)增驗(yàn)證方法特異性，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳和序列比對(duì)分析驗(yàn)證方法穩(wěn)定性，且本方法不需要昂貴儀器就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，便于基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)企業(yè)推廣使用，滿足發(fā)酵乳制品快速、高效檢驗(yàn)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳樣品購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?，共?jì)20 個(gè)批次，實(shí)驗(yàn)用菌株信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株Table 1 Strains used in the study

脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs）、Tris-HAc、腺嘌呤核苷三磷酸（adenine nucleoside triphosphate，ATP）、DNA Marker、正向（反向）引物、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Ezup柱式） 生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二硫蘇糖醇、海藻糖 美國(guó)Sigma公司；T4 gp32蛋白、UvrD解旋酶、Bst聚合酶 美國(guó)New England Biolabs公司；Reagent D德國(guó)Biotecon Diagnostics公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、乳桿菌培養(yǎng)基、脫脂乳粉培養(yǎng)基、牛肉膏微量元素培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-1恒溫水浴鍋 東方電工儀器廠；BHC-300IIA/B3生物安全檢驗(yàn)柜 蘇州凈化儀器設(shè)備有限公司；MS3振蕩混勻器 美國(guó)IKA公司；HVE-50滅菌器日本Hirayama公司；FiveEasy Plus? pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；NanoDrop 1000核酸測(cè)定儀、MIR-25恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；3K15冷凍離心機(jī)德國(guó)Sigma公司；Gel Doc（MP）凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

吸取100 μL增菌液和400 μL Reagent D至2 mL無(wú)菌離心管中，在室溫條件下避光靜置5 min；在500 W的鹵素?zé)粝路?5～20 cm處放置離心管，曝光5 min后，8 000 r/min離心5 min，去除上清液；加入100 μL無(wú)菌水充分混勻，用細(xì)菌提取試劑盒提取DNA，將提取后DNA放置于-20 ℃保存。

1.3.2 植物乳桿菌特異性引物設(shè)計(jì)

通過(guò)分析植物乳桿菌的基因序列，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取保守性強(qiáng)且特異性強(qiáng)的基因序列，最終選定植物乳桿菌scrB基因?yàn)榘袠?biāo)序列，通過(guò)Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物序列，并通過(guò)Oligo 7.37軟件進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)實(shí)驗(yàn)后獲得植物乳桿菌特異性檢測(cè)引物，如表2所示。

表2 引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小Table 2 Sequences of the primers used and size of the PCR products

1.3.3 HDA反應(yīng)體系優(yōu)化和建立

為了達(dá)到快速、便捷要求，采用HDA一步法反應(yīng)體系：5 μL 10×Buffer（1 mg/mL BSA、350 mmol/L Tris-HAc、100 mmol/L MgSO4、100 mmol/L二硫蘇糖醇）、0.16 μmol/L ATP、10 U Bst聚合酶、0.1 μg UvrD解旋酶、5.0 μg T4 gp32、0.04 μmol/L dNTPs、2 μL模板DNA、25 μmol/L海藻糖，體系引物終濃度為20 pmol/L，使用ddH2O將體系補(bǔ)至50 μL[21]。因UvrD解旋酶、T4 gp32蛋白含量對(duì)反應(yīng)影響較大，對(duì)二者含量進(jìn)行梯度篩選。體系反應(yīng)條件：在65 ℃金屬浴中，恒溫條件下反應(yīng)2 h。

UvrD解旋酶含量的梯度篩選：分別在UvrD解旋酶含量為0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05 μg不同梯度條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他條件一致，通過(guò)電泳結(jié)果確定反應(yīng)體系中UvrD解旋酶最優(yōu)含量。

T4 gp32蛋白含量的梯度篩選：分別在T4 gp32蛋白含量為6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 μg不同梯度條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他條件一致，通過(guò)電泳結(jié)果確定反應(yīng)體系中T4 gp32蛋白最優(yōu)含量。

HDA結(jié)果檢測(cè)：瓊脂糖凝膠含量為2%，電泳條件為恒壓100 V、時(shí)間45 min，電泳結(jié)果通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3.4 HDA法檢測(cè)植物乳桿菌的特異性

為驗(yàn)證植物乳桿菌HDA法檢測(cè)特異性，將表1與植物乳桿菌同源性較高、易造成檢測(cè)相互影響的菌株經(jīng)活化培養(yǎng)后，按照1.3.1節(jié)方法提取相應(yīng)菌株的DNA，并通過(guò)優(yōu)化后的HDA反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 HDA法檢測(cè)植物乳桿菌的序列比對(duì)分析

將植物乳桿菌通過(guò)1.3.3節(jié)所建立的HDA法擴(kuò)增后，通過(guò)瓊脂糖凝膠純化并收集目的片段，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列分析，將得到的序列信息通過(guò)NCBI官網(wǎng)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果驗(yàn)證方法穩(wěn)定性。

1.3.6 HDA法檢測(cè)植物乳桿菌的檢出限

將市售發(fā)酵乳樣品進(jìn)行高壓滅菌，按照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》方法進(jìn)行計(jì)數(shù)和鑒定，驗(yàn)證該批次發(fā)酵乳中不含植物乳桿菌，再分別將植物乳桿菌按照不同濃度梯度人工添加到發(fā)酵乳中，使其含量維持在2.8×100～2.8×107CFU/g，并通過(guò)上述方法進(jìn)行基因組DNA提取和HDA法檢測(cè)，得出該方法的檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 HDA法反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

由圖1～2可知，當(dāng)UvrD解旋酶含量為0.15 μg、T4 gp32蛋白含量為5.0 μg時(shí)，電泳條帶清晰、明亮且無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象，表明此時(shí)植物乳桿菌HDA法檢測(cè)效果最好。

圖1 不同UvrD解旋酶含量下HDA法測(cè)定植物乳桿菌瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products from genomic DNA of Lactobacillus plantarum with HDA method at different UvrD helicase concentrations

圖2 不同T4 gp32蛋白含量下HDA法測(cè)定植物乳桿菌瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products from genomic DNA of Lactobacillus plantarum by the HDA method at different T4 gp32 concentrations

2.2 植物乳桿菌HDA法檢測(cè)特異性

由圖3可知，僅植物乳桿菌有單一的擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，大小約為273 bp，與目的片段一致，且其他相近的11 株菌均無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象。由此可以說(shuō)明，本研究所建立的植物乳桿菌HDA法的特異性良好。

圖3 植物乳桿菌HDA法檢測(cè)特異性瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Electrophoretogram showing the specificity of the HDA method for Lactobacillus plantarum

2.3 HDA法檢測(cè)植物乳桿菌的序列分析結(jié)果

由表3可知，所比對(duì)序列與目標(biāo)序列的同源性均為100%，證明HDA法檢測(cè)植物乳桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物和目的片段的序列一致，穩(wěn)定性良好，可以作為快速檢驗(yàn)方法。

表3 HDA法檢測(cè)產(chǎn)物比對(duì)結(jié)果Table 3 Results of sequence alignment (BLAST) of HDA products

2.4 HDA法檢測(cè)植物乳桿菌的檢出限

由圖4可知，發(fā)酵乳中植物乳桿菌HDA法檢測(cè)的檢出限為2.8×101CFU/g，該檢出限可以滿足日常檢驗(yàn)需要，為開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和方法應(yīng)用推廣提供了參考。

圖4 HDA法檢測(cè)植物乳桿菌靈敏度的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Electrophoretogram showing the sensitivity of the HDA method for Lactobacillus plantarum

3 討 論

目前食品檢驗(yàn)研究多集中在致病菌方面，針對(duì)植物乳桿菌的快速檢測(cè)方法較少，本研究為植物乳桿檢驗(yàn)提供了一種新方式。HDA法比常用的國(guó)標(biāo)方法縮短了檢驗(yàn)時(shí)間、減少了檢驗(yàn)員主觀因素影響，能夠達(dá)到快速、精準(zhǔn)的檢驗(yàn)；相比其他擴(kuò)增技術(shù)，HDA檢驗(yàn)不需要專用設(shè)備，反應(yīng)條件不需太苛刻，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室均能滿足，同時(shí)還保留了基因擴(kuò)增的高效和準(zhǔn)確性，因采用的聚合酶獨(dú)特性，不易引起非特異性擴(kuò)增，具有較高靈敏度[22]。這都保證了HDA技術(shù)能夠在基層監(jiān)管部門和生產(chǎn)企業(yè)推廣使用，符合我國(guó)檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展趨勢(shì)，現(xiàn)因HDA技術(shù)的獨(dú)特性已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域[23-24]，在病毒鑒定[25-27]和微生物鑒定方面多有研究[28-29]，應(yīng)用前景廣闊[30]。

本研究通過(guò)HDA法，建立了一種快速、高效、應(yīng)用前景廣闊的植物乳桿菌檢驗(yàn)方法。以植物乳桿菌scrB基因?yàn)榘袠?biāo)序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選最佳反應(yīng)體系，最終確定50 μL反應(yīng)體系中UvrD解旋酶的添加量為0.15 μg、T4 gp32蛋白添加量為5.0 μg。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本方法特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，經(jīng)測(cè)序比對(duì)，植物乳桿菌的同源性為100%，檢出限低，為2.8×101CFU/g，檢測(cè)所需時(shí)間短，這為解決生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品因植物乳桿菌污染帶來(lái)的口味改變、質(zhì)量下降等問(wèn)題提供了快速檢驗(yàn)渠道，為企業(yè)高速發(fā)展保駕護(hù)航。