于思雨，榮光宏

1 青海大學研究生院，西寧 810000；2 廣東醫(yī)科大學附屬東莞第一醫(yī)院消化內(nèi)科

據(jù)2020年世界癌癥統(tǒng)計指出，在36種常見癌癥中，結(jié)直腸癌（CRC）新發(fā)病例超過190 萬，死亡人數(shù)93.5 萬，約占癌癥病例和死亡人數(shù)的1/10，其發(fā)病率和死亡率排名分別為第3、4 位［1］。CRC 早期臨床癥狀隱匿，很多患者在首次接診時已進展為中晚期，早期診斷率極低。此外，CRC 預后較差，大大降低了患者的5 年生存率。CRC 的患病年齡趨于年輕化，其死亡原因與腫瘤侵襲和遠處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。因此，尋找高特異性和高敏感性的腫瘤標志物，可以為CRC 的早期診斷和治療提供新的思路。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞（CSC）是惡性腫瘤中具有自我更新和多向分化潛能的細胞群，與腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥等密切相關(guān)［2］。富含亮氨酸重復單位的G 蛋白耦聯(lián)受體5（Lgr5）是腫瘤干細胞表面標志物，其參與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移、復發(fā)和治療抵抗［3-4］。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子GATA 結(jié)合蛋白6（GATA6）能增強尿激酶型纖溶酶原激活物的活化性，提高癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，也可以通過抑制15-脂氧合酶-1 的表達調(diào)節(jié)CRC 細胞增殖［5-6］。本研究探討Lgr5 和GATA6 在結(jié)直腸癌組織中的表達變化及臨床意義，為CRC 的早診斷、早治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2021年12月就診于青海省人民醫(yī)院的CRC患者41例，均行手術(shù)切除 治療，男24 例、女17 例，年 齡30～89（60.61 ± 13.23）歲；分化程度為低分化8 例、中高分化33 例；TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期22 例，Ⅲ、Ⅳ期19 例；浸潤深度未及漿膜10 例，侵及漿膜及漿膜外31 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24 例。納入標準：術(shù)后病理檢查確診為CRC；術(shù)前未行放化療；未合并其他惡性腫瘤及重大基礎(chǔ)疾病。排除標準：合并其他良性或惡性腫瘤；合并心、腦、肝、肺、腎等臟器功能衰竭；合并癌癥相關(guān)炎癥性腸病和家族性腺瘤性息肉??；妊娠期、哺乳期；正在參與其他醫(yī)學研究；臨床病理資料不完整。本研究經(jīng)青海省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 標本采集 術(shù)中取41例CRC患者的癌組織及配對的癌旁正常組織（距離癌組織邊緣＞5 cm），用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，使用石蠟切片機進行切片，厚度為4 μm。

1.3 Lgr5、GATA6 蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取上述兩種組織切片，依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中各浸泡10 min，隨后依次放入100%、100%、95%、70%、50%、30%乙醇及蒸餾水中各浸泡5 min。取出置于PBS 液中，于搖床上洗滌3 次，每次3 min。每張切片滴加3%過氧化氫去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫下避光孵育10 min。取出后置于PBS 液中，于搖床上洗滌3 次，每次3 min。將檸檬酸鹽抗原修復液于微波爐高火加熱5 min，沸騰后放入組織切片，加蓋，然后低火加熱20 min。取出后置于PBS 液中，于搖床上洗滌3 次，每次3 min。用10%正常山羊血清封閉非特異性抗原，室溫下封閉40 min。甩去多余液體，根據(jù)組織大小，滴加稀釋的一抗兔抗人Lgr5多克隆抗體、兔抗人GATA6多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）稀釋比例分別為1∶300、1∶100），置于濕盒中4 ℃冰箱孵育過夜。次日取出濕盒，將組織切片置于PBS液中，于搖床上搖動洗滌3 次，每次5 min。吸水紙擦干切片，滴加適量二抗（Polyperoxidase-anti-Rabbit-IgG 即用型），需完全覆蓋組織，室溫下孵育2 h。然后置于PBS 液中，于搖床上搖動洗滌3 次，每次5 min。擦干組織周圍液體，每張切片滴加50 μL現(xiàn)配的DAB工作液，顯微鏡（×400）下觀察顯色情況，然后自來水洗滌終止顯色。蘇木素復染細胞核2 min，用自來水清洗，返藍。將切片置于無水乙醇3 min、二甲苯3 min 脫水透明。晾干后用中性樹膠封片，顯微鏡（×400）下拍照。結(jié)果判定：Lgr5陽性染色主要定位于細胞質(zhì)，GATA6 陽性染色主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)，均呈棕黃色顆粒。顯微鏡下每張切片隨機計數(shù)10 個高倍視野（×400），觀察細胞染色情況，對染色強度、陽性細胞百分比進行評分。染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分：陽性細胞百分比≤5%計0 分；5%＜陽性細胞百分比≤25%計1 分；25%＜陽性細胞百分比≤50%計2 分；50%＜陽性細胞百分比≤75%計3分；陽性細胞數(shù)＞75%計4分。以上兩項評分相乘≥3為高表達，＜3為低表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 組織及癌旁正常組織中Lgr5、GATA6 蛋白表達比較 CRC 組織及癌旁正常組織中Lgr5 蛋白高表達率分別為60.98%（25/41）、12.20%（5/41），比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CRC 組織及癌旁正常組織中GATA6 蛋白高表達率分別為63.41%（26/41）、21.95%（9/41），比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 Lgr5、GATA6 蛋白高表達與CRC 患者臨床病理特征的關(guān)系 Lgr5 蛋白高表達率與CRC 的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度和浸潤深度無關(guān)（P均＞0.05）。GATA6 蛋白高表達率與CRC 的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度和腫瘤分期無關(guān)（P均＞0.05）。見表1。

2.3 CRC 組織中Lgr5、GATA6 蛋白表達的相關(guān)性 Spernman 秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，CRC 組織中Lgr5、GATA6蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.327，P＜0.05）。

3 討論

臨床上大多數(shù)CRC 患者在確診時已是中晚期，錯過最佳手術(shù)時機，大大降低了CRC 患者的生存率。目前，腫瘤相關(guān)標志物檢測已廣泛應用于臨床，作為一種常規(guī)的腫瘤篩查方法以輔助腫瘤的診斷和評估預后。了解CRC 的發(fā)生機制并進行早期干預，對提高CRC的療效和延長患者生存期有重要意義。

研究表明，腫瘤干細胞雖然數(shù)目極少，但在腫瘤干細胞內(nèi)與早期胚胎發(fā)育相關(guān)的多種信號通路被異常激活，從而呈現(xiàn)出強致瘤能力及細胞分化能力，信號通路的激活可通過相關(guān)生物標志物進行監(jiān)測［7-8］。因此，通過檢測腫瘤干細胞標志物在腫瘤組織中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系，可以為腫瘤的早期診斷及治療提供重要依據(jù)。Lgr5 是一種7 次跨膜的G 蛋白，具有17 個富含亮氨酸重復序列，在食管腺癌、肝細胞癌、卵巢癌、基底細胞癌及CRC 中呈現(xiàn)高表達，并且在這些惡性腫瘤的病情進展中發(fā)揮重要作用。研究表明，Lgr5是Wnt信號傳導的靶基因，可參與細胞外基質(zhì)蛋白、膠原蛋白及纖黏蛋白的表達，也可參與調(diào)控CRC 細胞中Wnt/β-catenin 信號通路的激活，從而促進腫瘤細胞的增殖及侵襲等生物學行為［9］。GATA6 屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子GATA 家族，具有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)，參與細胞的多種生物學行為，其異常表達與肺癌、卵巢癌、口腔癌、消化道腫瘤等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］。研究發(fā)現(xiàn)，GATA6 在CRC 患者中表達增加，參與腸上皮細胞分化，通過激活Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮促癌作用［11-12］。此外，Lgr5、GATA6 與腫瘤的直徑、浸潤深度、分化程度、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學特征有關(guān)［13-16］。腫瘤TNM 分期是由腫瘤原發(fā)灶情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移共同決定。TNM 分期越高，腫瘤惡性程度就越高。研究發(fā)現(xiàn)，在CRC 組織中GATA6表達陽性率高于癌旁組織，且TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期及低分化、浸潤深度深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，GATA6陽性率高，提示GATA6表達與CRC發(fā)生和進展密切相關(guān)［15-16］。本研究結(jié)果顯示，Lgr5、GATA6 在CRC 組織、癌旁正常組織中均有表達，但CRC 組織中Lgr5、GATA6 的高表達率明顯高于癌旁正常組織，提示兩者與CRC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。同時，在TNM 分期為Ⅲ、Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC 患者中，Lgr5 的高表達率高；在腫瘤的浸潤深度達漿膜及漿膜外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC 患者中，GATA6的高表達率高。提示Lgr5、GATA6 的表達與CRC 的惡性生物學行為有關(guān)，可作為評價腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移傾向的指標之一。

此外，有研究指出GATA6 可以通過結(jié)合至Lgr5的啟動子區(qū)調(diào)控Lgr5 的表達，進而影響結(jié)直腸腫瘤細胞系的成瘤能力，抑制CRC 細胞系GATA6 的表達，可下調(diào)Lgr5 的表達并進而降低其致瘤能力［17-19］。GATA6 長非編碼RNA（lncGATA6）在Lgr5 陽性表達的人腸干細胞（ISC）中高表達，如果敲除或條件性敲除ISC 中的lncGATA6，則會損害ISC 的干性和上皮再生，從而說明lncGATA6 維持腸道干細胞的干性并促進腫瘤的發(fā)生；其發(fā)生機制可能為lncGATA6將NURF 復合物募集到Ehf 啟動子上，以誘導其轉(zhuǎn)錄，促進LGR4/5 的表達，以促進Wnt 信號通路的激活，進而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，這表明長非編碼RNA可通過調(diào)控Lgr5 或影響Lgr5 陽性CRC 干細胞的生物學特性，從而促進CRC 的發(fā)展［20-21］。本研究結(jié)果顯示，Lgr5和GATA6在CRC組織中的表達表現(xiàn)為正相關(guān)，兩者共同促進CRC 的發(fā)展。這提示Lgr5 和GATA6都可作為CRC 治療的靶點，聯(lián)合靶向治療可能會提高CRC的療效。

綜上所述，Lgr5 和GATA6 在CRC 組 織中高表達，與CRC 的惡性生物學行為有關(guān)，且二者共同參與CRC 的發(fā)生發(fā)展，因此檢測Lgr5 和GATA6 有助于CRC 患者的診斷及預后評估。但本研究樣本量相對較少，且未對Lgr5、GATA6 的作用機制進行研究。因此，未來仍需開展大樣本、多中心的臨床研究進一步論證本研究結(jié)果，尋找診斷效能更高的標志物或聯(lián)合診斷標志物。