侯曼婷，楊慧捷，李 強(qiáng)，湛小燕，柏兆方，肖小河*

淫羊藿醇提物調(diào)節(jié)M2樣巨噬細(xì)胞極化減少乳腺癌細(xì)胞遷移和集落形成的研究

侯曼婷1, 2, 3，楊慧捷2, 3，李 強(qiáng)2, 3，湛小燕2, 3，柏兆方2, 3，肖小河1, 2, 3*

1. 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515 2. 中國人民解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心 肝病醫(yī)學(xué)部，北京 100039 3. 中國人民解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心 全軍中醫(yī)藥研究所，北京 100039

探討淫羊藿醇提物對體外巨噬細(xì)胞極化調(diào)控機(jī)制及對M2樣巨噬細(xì)胞促進(jìn)4T1細(xì)胞遷移和集落形成的影響。采用CCK-8法檢測不同濃度淫羊藿醇提物對骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow derived macrophages，BMDM）活力的影響，確定淫羊藿醇提物的安全作用濃度；采用Western blotting和qRT-PCR檢測淫羊藿醇提物對M2樣巨噬細(xì)胞標(biāo)志物精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）和CD163表達(dá)的影響；采用qRT-PCR檢測淫羊藿醇提物對M2-腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）相關(guān)基因炎癥區(qū)域1（found in inflammatory zone 1，）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，、幾丁質(zhì)酶3樣分子3（chitinase 3-like 3，）、趨化因子24（C-C motif chemokine ligand 24，）、巨噬細(xì)胞半乳糖型C型凝集素2（macrophage galactose-type C-type lectin 2，）和干擾素調(diào)節(jié)因子4（interferon regulatory factor 4，）mRNA表達(dá)的影響；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測淫羊藿醇提物對M2-TAMs促4T1細(xì)胞遷移的影響；集落實(shí)驗(yàn)檢測淫羊藿醇提物對M2-TAMs促4T1細(xì)胞生長的影響。淫羊藿醇提物在0.015 625～2.000 000 mg/mL對BMDM細(xì)胞無毒副作用；淫羊藿醇提物顯著抑制M2-TAMs相關(guān)基因、、、、、、和表達(dá)（＜0.05、0.01、0.001），抑制M2-TAMs促4T1細(xì)胞的遷移和集落形成能力（＜0.05、0.001）。淫羊藿醇提物減弱M2樣巨噬細(xì)胞對4T1細(xì)胞遷移和集落形成的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制可能與抑制巨噬細(xì)胞M2型極化有關(guān)。

淫羊藿；巨噬細(xì)胞；M2型極化；乳腺癌；遷移；集落形成；安息香酸；松柏醛；大黃素；香草酸

乳腺癌是危害婦女健康主要的惡性腫瘤，也是世界上癌癥的第2大死亡原因[1-2]。乳腺癌后期多有肺和肝的轉(zhuǎn)移，當(dāng)發(fā)生器官轉(zhuǎn)移時，患者生存率和生活質(zhì)量將大大降低[3]。乳腺癌的一線治療主要依賴于蒽環(huán)類、紫杉醇等細(xì)胞毒性藥物的化療，但在治療過程中經(jīng)常發(fā)生耐藥性。因此，探索乳腺癌的病理機(jī)制和尋找有效的治療方法至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞對各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要[4-5]，巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物可作為預(yù)后指標(biāo)。巨噬細(xì)胞浸潤率高與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中最典型的類型，從乳腺癌早期癌變到進(jìn)展，尤其是轉(zhuǎn)移，它們都發(fā)揮著重要作用[6]。TAMs參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移、血管生成、基質(zhì)重塑、侵襲和免疫抑制。

中藥在乳腺癌的整個治療療程中起著重要作用。中藥具有多組分、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，能夠降低腫瘤患者的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，改善生活質(zhì)量，延長腫瘤患者的生存時間。淫羊藿Maxim.為毛茛目小檗科植物，味辛甘，性溫，走肝腎二經(jīng)，具有堅(jiān)筋骨、補(bǔ)腎陽等功效，還具有保護(hù)心血管[7]、促進(jìn)骨質(zhì)形成[8]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力[9]、抑制癌癥[10]等作用。研究表明，淫羊藿醇提取物有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用[11]，但關(guān)于淫羊藿醇提取物如何影響乳腺癌腫瘤免疫微環(huán)境的研究尚未報(bào)道。故本研究擬探討淫羊藿醇提物對M2樣巨噬細(xì)胞的影響及其調(diào)控M2樣巨噬細(xì)胞對4T1乳腺癌細(xì)胞遷移和集落形成的影響，以期為后續(xù)淫羊藿的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料

1.1 動物和細(xì)胞

SPF級雌性C57BL/6小鼠，8周齡，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物合格證號110324210105240115。小鼠飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動物實(shí)驗(yàn)中心，在整個實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由進(jìn)食飲水，并給予12 h光照/12 h黑暗的周期。動物實(shí)驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南進(jìn)行，并經(jīng)解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心批準(zhǔn)，動物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號IACUC-2021-0007。

4T1細(xì)胞購自上海富衡生物科技有限公司。

1.2 藥物

淫羊藿經(jīng)肖小河研究員鑒定為小檗科植物淫羊藿Maxim.的干燥葉。取淫羊藿葉片，粉碎過4號篩，精密稱定，加入稀乙醇，超聲處理（功率400 W、頻率50 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，冷凍干燥即得淫羊藿提取物。

1.3 藥品與試劑

精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）抗體（批號93668）購自美國CST公司；β-actin抗體（批號20536-1-AP）購自Proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號J111-035-003）購自Jackson Immuno Research公司；Trizol試劑（批號BSC51M1）購自Bioflux公司；CCK-8試劑（批號KTA1020-1000T）購自Abbkine公司；白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）因子（批號96-214-14-20）購自Peprotech公司。

1.4 儀器

QB-9002型震板儀（海門其林貝爾公司）；Epoch酶標(biāo)儀、P100+型核酸濃度測定儀（美國Bio-Tek公司）；Quantstudio 6 Flex熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；MINI6K型手掌離心機(jī)（杭州奧盛公司）；Vortex-Genie 2型震蕩器（美國Scientific Industries公司）。

2 方法

2.1 淫羊藿醇提取物成分分析

2.1.1 樣品制備 取淫羊藿醇提取物加入甲醇，制備成5 mg/mL混懸液，超聲提取40 min，取1 mL于12 000 r/min離心10 min，離心后取上清液，過0.22 μm濾膜，取樣品進(jìn)UPLC-MS/MS。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）收集淫羊藿成分，MS結(jié)果采用Progenesis QI數(shù)據(jù)平臺分析（基于NPATLAS和GNPS數(shù)據(jù)庫），將所得結(jié)果與淫羊藿成分檢索比對，進(jìn)行非靶向成分分析。

2.1.2 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為雙蒸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，5% B；3～35 min，5%～95% B；35～42 min，95%～5% B。體積流量為0.3 mL/min；進(jìn)樣體積為5 μL；柱溫箱溫度為40 ℃。

2.1.3質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），在正離子模式下進(jìn)行檢測，毛細(xì)管溫度275 ℃；鞘氣體積流量20 Arb；輔助氣體體積流量5 Arb；離子源電壓5 kV。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從8周齡雌性C57BL/6小鼠的股骨骨髓中分離骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow derived macrophages，BMDM），用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基和小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子M-CSF（50 ng/mL）進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。用0.25%胰蛋白酶-EDTA（2∶1）消化細(xì)胞，以1.2×106/mL密度接種于孔板中過夜。第2天，加入淫羊藿醇提取物1 h后，用IL-4（20 ng/mL）刺激細(xì)胞24 h。

2.3 CCK-8法檢測淫羊藿醇提取物對BMDM的細(xì)胞毒性

將BMDM細(xì)胞以1.2×106/mL密度接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中過夜，用不同質(zhì)量濃度（0、0.015 625、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）淫羊藿醇提取物處理細(xì)胞24 h。棄去培養(yǎng)基，加入CCK-8-培養(yǎng)基（1∶10）溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度（），檢測淫羊藿醇提取物對細(xì)胞的毒性。

2.4 Western blotting檢測BMDM細(xì)胞Arg-1蛋白表達(dá)

設(shè)置對照組、模型組和不同質(zhì)量濃度（0.062 5、0.125、0.25 mg/mL）淫羊藿醇提取物組，按“2.2”項(xiàng)下方法給藥，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取蛋白。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于含5%脫脂牛奶的TBST中封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后，加入二抗孵育，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測試劑顯影。

2.5 qRT-PCR法檢測BMDM細(xì)胞趨化因子24（C-C motif chemokine ligand 24，CCL24）、炎癥區(qū)域1（found in inflammatory zone 1，F(xiàn)izz1）、幾丁質(zhì)酶3樣分子3（chitinase 3-like 3，Ym1）、巨噬細(xì)胞半乳糖型C型凝集素2（macrophage galactose-type C-type lectin 2，MGL2）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、干擾素調(diào)節(jié)因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）、Arg-1和CD163 mRNA表達(dá)

設(shè)置對照組、模型組和不同質(zhì)量濃度（0.062 5、0.125、0.25 mg/mL）淫羊藿醇提取物組，按“2.2”項(xiàng)下方法給藥，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 條件培養(yǎng)基的制備

參考文獻(xiàn)方法[12]，按“2.2”項(xiàng)下方法培養(yǎng)BMDM，細(xì)胞種板貼壁后加入含淫羊藿醇提取物（0.25 mg/mL）的無血清培養(yǎng)基，1 h后加入IL-4（20 ng/mL）。24 h后，收集上清液作為條件培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基2000 r/min離心以沉淀碎片，吸上清并在?80 ℃下保存，用于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

按“2.2”項(xiàng)下方法培養(yǎng)BMDM，細(xì)胞種板貼壁后加入含淫羊藿醇提取物（0.25 mg/mL）的DMEM培養(yǎng)基，1 h后加入IL-4（20 ng/mL）。24 h后，收集上清液作為條件培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基2000 r/min離心以沉淀碎片，吸上清并在?80 ℃下保存，用于細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)。

2.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將傷口愈合的4孔插件放置于12孔板中，4T1細(xì)胞以3.6×105/mL接種。細(xì)胞過夜貼壁后，取出插件，用PBS洗去飄浮死細(xì)胞。加入含50%條件培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。0、24 h時，用倒置顯微鏡拍照，使用Image J分析圖片，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

細(xì)胞遷移率＝(0 h創(chuàng)面面積－24 h創(chuàng)面面積)/0 h創(chuàng)面面積

2.8 細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)

6孔板中每孔接種1000個4T1細(xì)胞，并用含50%條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基孵育8 d。用2%多聚甲醛固定，用1%結(jié)晶紫染色，拍照，使用Image J分析圖片。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿醇提取物的成分分析

如圖1和表2所示，淫羊藿醇提取物中含安息香酸、松柏醛、大黃素、香草酸、hyaladione、epirodin A。

1-安息香酸 2-松柏醛 3-大黃素 4-香草酸 5-hyaladione 6-epirodin A

表2 淫羊藿醇提取物成分分析

3.2 淫羊藿醇提取物對BMDM的細(xì)胞毒性

不同質(zhì)量濃度的淫羊藿醇提取物處理BMDMs細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示0.015 625～2 mg/mL淫羊藿醇提取物對BMDMs細(xì)胞無毒性作用（圖2）。

與對照組（0 mg·mL?1）比較：***P＜0.001

3.3 淫羊藿醇提取物在體外抑制巨噬細(xì)胞M2極化

在BMDM M0型巨噬細(xì)胞中，M2樣巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物Arg-1和CD163低表達(dá)，經(jīng)IL-4誘導(dǎo)后表達(dá)顯著上升，表明BMDM成功極化成M2樣巨噬細(xì)胞。利用Western blotting和qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證淫羊藿醇提取物呈劑量相關(guān)性地下調(diào)IL-4誘導(dǎo)的Arg-1和CD163表達(dá)（圖3），表明淫羊藿醇提取物可以直接抑制巨噬細(xì)胞的M2樣極化。

為了進(jìn)一步探討淫羊藿醇提取物對巨噬細(xì)胞M2極化的影響，采用qRT-PCR技術(shù)研究M2樣巨噬細(xì)胞相關(guān)基因、、、、和的轉(zhuǎn)錄水平，如圖4所示，與模型組比較，淫羊藿醇提取物（0.062 5、0.125、0.25 mg/mL）組、、和的mRNA表達(dá)水平均顯著下降（＜0.05、0.01、0.001），淫羊藿醇提取物（0.125、0.25 mg/mL）組mRNA表達(dá)水平顯著下降（＜0.01、0.001），淫羊藿醇提取物（0.25 mg/mL）組mRNA表達(dá)水平顯著下降（＜0.001）。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

圖4 淫羊藿醇提取物對PPARγ、Fizz1、CCL24、Ym1、MGL2和IRF4mRNA的影響(, n = 3)

3.4 淫羊藿醇提取物減弱M2樣巨噬細(xì)胞對4T1細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用

采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察淫羊藿醇提取物作用巨噬細(xì)胞后上清對乳腺癌細(xì)胞的遷移能力的影響。BMDM在含IL-4和淫羊藿醇提取物的無血清培養(yǎng)基中孵育24 h，收集上清液作為條件培養(yǎng)基。用含50%條件培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4T1，如圖5所示，IL-4單獨(dú)處理的BMDM收集的條件培養(yǎng)基顯著促進(jìn)4T1細(xì)胞的遷移（＜0.05），而淫羊藿醇提取物處理后的BMDM的條件培養(yǎng)基顯著抑制4T1細(xì)胞遷移（＜0.05）。

3.5 淫羊藿醇提取物減弱M2樣巨噬細(xì)胞對4T1細(xì)胞集落形成的促進(jìn)作用

使用集落形成實(shí)驗(yàn)來評估淫羊藿醇提取物對M2樣巨噬細(xì)胞促進(jìn)4T1細(xì)胞集落形成的影響。如圖6所示，IL-4處理的條件培養(yǎng)基顯著促進(jìn)4T1細(xì)胞的集落形成（＜0.05），而淫羊藿醇提取物處理后的條件培養(yǎng)基顯著抑制細(xì)胞的集落形成（＜0.001）。

圖5 淫羊藿醇提取物對M2-TAMs促4T1細(xì)胞遷移的影響(, n = 3)

圖6 淫羊藿醇提取物對M2-TAMs促4T1細(xì)胞集落形成的影響(, n = 3)

4 討論

目前，乳腺癌仍然是全球性的公共衛(wèi)生問題。乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長和年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅女性健康[13]。中醫(yī)認(rèn)為腫瘤初期因機(jī)體陽虛不能氣化，陰氣隨之不足，不能正常聚精成形，而異常聚積為痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物，致使化毒成瘤[14]。淫羊藿作為補(bǔ)陽之要藥，具有益精氣、補(bǔ)腎陽之功效，能夠調(diào)節(jié)免疫，是臨床上常用的補(bǔ)腎中藥，現(xiàn)常用于治療乳腺癌，常以復(fù)方形式高頻率入藥。

癌癥的一個特征是免疫功能障礙，本應(yīng)對抗腫瘤的免疫細(xì)胞受到腫瘤周圍組織、腫瘤微環(huán)境的特異性抑制，從而導(dǎo)致腫瘤不受控制地生長和擴(kuò)散[15]。越來越多的證據(jù)表明，當(dāng)存在于腫瘤微環(huán)境中時，先天免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、先天淋巴樣細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞和NK細(xì)胞）以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞（T細(xì)胞和B細(xì)胞）有助于腫瘤進(jìn)展[16]。巨噬細(xì)胞是組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)不可或缺的介質(zhì)，其向替代激活型巨噬細(xì)胞（M2型）極化能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移。因此，調(diào)節(jié)TAMs并維持其穩(wěn)態(tài)已成為腫瘤治療的重點(diǎn)[17]。TAMs參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移、血管生成、基質(zhì)重塑、侵襲、免疫抑制。TAMs主要分為2種不同的表型，它們是經(jīng)典激活的M1樣巨噬細(xì)胞和替代激活的M2樣巨噬細(xì)胞[18]。在良性或非功能性腫瘤中，大多數(shù)TAM是經(jīng)典激活的M1樣巨噬細(xì)胞，被γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活，從而促進(jìn)TAMs產(chǎn)生促炎因子和吞噬腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。而M2樣巨噬細(xì)胞可被Th2細(xì)胞因子如IL-4激活，產(chǎn)生大量抗炎因子，這些因子直接促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展[19]。因此，逆轉(zhuǎn)或抑制M2樣巨噬細(xì)胞的極化是乳腺癌免疫治療的策略。Arg-1是M2樣巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，Arg-1的過表達(dá)與癌癥患者預(yù)后不良有關(guān)[20]。CD163是M2樣巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[21]，CD163與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，CD163＋TAM誘導(dǎo)上皮介質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[22]。本研究結(jié)果表明，淫羊藿提取物在一定程度上發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫的作用，抑制M2樣巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物Arg-1和CD163表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞M2型極化。PPARγ是代謝傳感器，通過多種脂肪酸和脂肪酸衍生物（如棕櫚酸）激活來調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[23]。PPARγ與巨噬細(xì)胞M2極化有關(guān)，PPARγ已成為巨噬細(xì)胞M2極化的主要調(diào)節(jié)劑[24]，PPARγ配體已被證明對體內(nèi)腫瘤生長具有強(qiáng)大的抑制作用[25]。、均為M2樣巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因，和參與組織修復(fù)過程中的纖維化[26]。M2樣巨噬細(xì)胞在體外產(chǎn)生大量的CCL24[27]，CCL24表達(dá)增加能夠促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和侵襲[28]。IRF4是IRF家族的一員，它參與巨噬細(xì)胞M2極化過程，并通過與MyD88銜接分子結(jié)合作為Toll樣受體信號的負(fù)調(diào)節(jié)因子[29]。MGL2是巨噬細(xì)胞半乳糖型C型凝集素家族的成員，也在替代激活條件下刺激的巨噬細(xì)胞中表達(dá)[30]。本研究結(jié)果表明，淫羊藿提取物通過抑制M2樣巨噬細(xì)胞相關(guān)基因、、、、、的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞M2型極化，表明淫羊藿可作為M2樣巨噬細(xì)胞的有效抑制劑。

越來越多的證據(jù)表明，M2樣巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移和生長的能力[31]。來自M2樣巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以模擬腫瘤微環(huán)境并誘導(dǎo)腫瘤遷移和生長，其特征類似于從惡性腫瘤中分離的巨噬細(xì)胞[12]。IL-4能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，可促進(jìn)腫瘤增殖和血管生成[18]。本研究證明了巨噬細(xì)胞極化和淫羊藿抗腫瘤作用的相關(guān)性。來自IL-4活化巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基促進(jìn)了4T1細(xì)胞的遷移和生長，而與淫羊藿共同干預(yù)后，逆轉(zhuǎn)了這種M2激活的腫瘤促進(jìn)作用，表明IL-4激活的M2極化被淫羊藿消除。

本研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿提取物通過體外調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化來抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和集落形成，表明淫羊藿治療乳腺癌可能與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境有關(guān)，淫羊藿可能通過影響巨噬細(xì)胞來充當(dāng)轉(zhuǎn)移部位腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)劑，這為淫羊藿的抗腫瘤功能提供新的機(jī)制見解，揭示了淫羊藿癌癥治療作用的新潛在機(jī)制，可能有助于降低癌癥發(fā)病率和癌癥相關(guān)死亡率。今后，本課題組將進(jìn)一步在體內(nèi)探討淫羊藿抑制巨噬細(xì)胞M2型極化后對乳腺癌生長及轉(zhuǎn)移的影響，以期更深層次地說明淫羊藿抗腫瘤機(jī)制，為淫羊藿臨床應(yīng)用于治療腫瘤疾病提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] GBD 2019 Cancer Risk Factors Collaborators. The global burden of cancer attributable to risk factors, 2010-19: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019 [J]., 2022, 400(10352): 563-591.

[2] Yin L, Duan J J, Bian X W,. Triple-negative breast cancer molecular subtyping and treatment progress [J]., 2020, 22(1): 61.

[3] Medeiros B, Allan A L. Molecular mechanisms of breast cancer metastasis to the lung: Clinical and experimental perspectives [J]., 2019, 20(9): 2272.

[4] Pathria P, Louis T L, Varner J A. Targeting tumor-associated macrophages in cancer [J]., 2019, 40(4): 310-327.

[5] Shen M J, Chen Y B, Xu L J,. Increased infiltration of macrophages to radioresistant lung cancer cells contributes to the development of the additional resistance of tumor cells to the cytotoxic effects of NK cells [J]., 2018, 53(1): 317-328.

[6] Tariq M, Zhang J Q, Liang G K,. Macrophage polarization: Anti-cancer strategies to target tumor-associated macrophage in breast cancer [J]., 2017, 118(9): 2484-2501.

[7] 馬立. 淫羊藿苷對急性大腦中動脈梗死大鼠基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 (SDF-1) 及其受體CXCR-4的影響 [D]. 南京: 南京中醫(yī)藥大學(xué), 2014.

[8] 郝福良. 淫羊藿苷促進(jìn)兔顱骨缺損修復(fù)愈合的影響和機(jī)制的探討 [D]. 石家莊: 河北醫(yī)科大學(xué), 2013.

[9] He J, Zang S L, Liu N,.polysaccharides attenuates hematotoxicity by reducing oxidative stress and enhancing immune function in mice model of benzene-induced bone marrow failure [J]., 2020, 125: 109908.

[10] 華辭怡, 史有陽, 謝穎, 等. 淫羊藿有效成分治療乳腺癌作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2022, 53(20): 6593-6600.

[11] 陳曉蕾, 湯立建, 李慶林. 淫羊藿、秦皮醇提取物體外抗乳腺癌細(xì)胞增殖的研究 [J]. 中國藥房, 2007, 18(15): 1124-1127.

[12] Xu F, Cui W Q, Wei Y,. Astragaloside IV inhibits lung cancer progression and metastasis by modulating macrophage polarization through AMPK signaling [J]., 2018, 37(1): 207.

[13] Britt K L, Cuzick J, Phillips K A. Key steps for effective breast cancer prevention [J]., 2020, 20(8): 417-436.

[14] 郝菲菲, 田思勝. 基于氣化理論的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移之“陽主陰從”探討 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2021, 32(1): 164-166.

[15] Denk D, Petrocelli V, Conche C,. Expansion of T memory stem cells with superior anti-tumor immunity by urolithin A-induced mitophagy [J]., 2022, 55(11): 2059-2073.

[16] Hinshaw D C, Shevde L A. The tumor microenvironment innately modulates cancer progression [J]., 2019, 79(18): 4557-4566.

[17] DeNardo D G, Ruffell B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy [J]., 2019, 19(6): 369-382.

[18] Dong R, Gong Y L, Meng W,. The involvement of M2 macrophage polarization inhibition in fenretinide- mediated chemopreventive effects on colon cancer [J]., 2017, 388: 43-53.

[19] Jiménez-Garcia L, Herránz S, Luque A,. Critical role of p38 MAPK in IL-4-induced alternative activation of peritoneal macrophages [J]., 2015, 45(1): 273-286.

[20] Ma Z G, Lian J, Yang M,. Overexpression of Arginase-1 is an indicator of poor prognosis in patients with colorectal cancer [J]., 2019, 215(6): 152383.

[21] Tao S F, Chen Q, Lin C,. Linc00514 promotes breast cancer metastasis and M2 polarization of tumor-associated macrophages via Jagged1-mediated Notch signaling pathway [J]., 2020, 39(1): 191.

[22] Wei C, Yang C G, Wang S Y,. Crosstalk between cancer cells and tumor associated macrophages is required for mesenchymal circulating tumor cell-mediated colorectal cancer metastasis [J]., 2019, 18(1): 64.

[23] Francque S, Szabo G, Abdelmalek M F,. Nonalcoholic steatohepatitis: The role of peroxisome proliferator-activated receptors [J]., 2021, 18(1): 24-39.

[24] Tian Y, Yang C M, Yao Q Y,. Procyanidin B2 activates PPARγ to induce M2 polarization in mouse macrophages [J]., 2019, 10: 1895.

[25] Takada I, Makishima M. Peroxisome proliferator-activated receptor agonists and antagonists: A patent review (2014-present) [J]., 2020, 30(1): 1-13.

[26] Okuzumi S, Miyata J, Kabata H,. TLR7 agonist suppresses group 2 innate lymphoid cell-mediated inflammation via IL-27-producing interstitial macrophages [J]., 2021, 65(3): 309-318.

[27] Makita N, Hizukuri Y, Yamashiro K,. IL-10 enhances the phenotype of M2 macrophages induced by IL-4 and confers the ability to increase eosinophil migration [J]., 2015, 27(3): 131-141.

[28] Jin L, Liu W R, Tian M X,. CCL24 contributes to HCC malignancy via RhoB-VEGFA-VEGFR2 angiogenesis pathway and indicates poor prognosis [J]., 2017, 8(3): 5135-5148.

[29] Satoh T, Takeuchi O, Vandenbon A,. The Jmjd3-Irf4 axis regulates M2 macrophage polarization and host responses against helminth infection [J]., 2010, 11(10): 936-944.

[30] Raes G, Brys L, Dahal B K,. Macrophage galactose- type C-type lectins as novel markers for alternatively activated macrophages elicited by parasitic infections and allergic airway inflammation [J]., 2005, 77(3): 321-327.

[31] Mantovani A, Allavena P, Sica A,. Cancer-related inflammation [J]., 2008, 454(7203): 436-444.

Alcohol extract ofreduces migration and colony formation of breast cancer cells by regulating polarization of M2 macrophages

HOU Man-ting1, 2, 3, YANG Hui-jie2, 3, LI Qiang2, 3, ZHAN Xiao-yan2, 3, BAI Zhao-fang2, 3, XIAO Xiao-he1, 2, 3

1. School of Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China 2. Department of Hepatology, the Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100039, China 3. China Military Institute of Chinese Materia, the Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100039, China

To investigate the effect and regulatory mechanism of alcohol extract ofon macrophage polarization and M2 macrophages in promoting the migration and colony formation of 4T1 cells.CCK-8 assay was used to detect the effect of different concentrations of alcohol extract ofon activity of bone marrow derived macrophages (BMDM), and determine the safe concentration of alcohol extract of. Western blotting and qRT-PCR were used to detect the expressions of arginase-1 () and. qRT-PCR was used to detect the effect of alcohol extract ofon mRNA expressions of M2-tumor-associated macrophages (TAMs) related genes such as found in inflammatory zone 1 (), peroxisome proliferator-activated receptor γ (), chitinase 3-like 3 (), C-C motif chemokine ligand 24 (), macrophage galactose-type C-type lectin 2 () and interferon regulatory factor 4 (). The effect of alcohol extract ofon M2-TAMs promoting the migration of 4T1 cells was detected by wound healing assay. Colony formation experiment was conducted to detect the effect of alcohol extract ofon the growth of 4T1 cells promoted by M2-TAMs.Alcohol extract ofhad no adverse effects on BMDM cells at 0.015 625—2.000 000 mg/mL. Alcohol extract ofsignificantly inhibited the expression of M2-TAMS related genes,,,,,,and(< 0.05, 0.01, 0.001), and reduced the ability of M2-TAMS promoting the migration and colony formation of 4T1 cells (< 0.05, 0.001).Alcohol extract ofattenuates the promoting effects of M2 macrophages on migration and colony formation of 4T1 cells, and the mechanism may be related to the inhibition of M2 polarization of macrophages.

Maxim.; macrophages; M2 polarization; breast cancer; migration; colony formation; benzoic acid; coniferyl aldehyde; emodin; 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2023)06 - 1842 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.016

2022-11-17

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（ZYYCXTD-C-202005）；國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新群體項(xiàng)目（81721002）

侯曼婷，碩士研究生，主要從事中藥藥理研究。E-mail: hmtby98@163.com

肖小河，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事臨床中藥學(xué)研究。E-mail: pharmacy_302@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]