曹寧寧，李市榮，王清果，王 偉，孫成宏，姚景春，張貴民，肖學鳳

基于網(wǎng)絡藥理學整合體內(nèi)實驗探究脈絡舒通丸抗血栓性淺靜脈炎的作用機制

曹寧寧1，李市榮2，王清果1，王 偉3，孫成宏2，姚景春2，張貴民2*，肖學鳳1*

1. 天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 301617 2. 魯南制藥集團股份有限公司 新藥藥理中心，山東 臨沂 276000 3. 魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276000

基于網(wǎng)絡藥理學整合體內(nèi)實驗方法探究脈絡舒通丸抗血栓性淺靜脈炎（superficial thrombophlebitis，STP）的作用機制。借助網(wǎng)絡藥理學方法，從藥物及疾病相關數(shù)據(jù)庫篩選脈絡舒通丸的成分作用靶點及STP疾病相關靶點，根據(jù)拓撲特征值篩選關鍵靶點后，進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。將日本大耳白兔隨機分為對照組、模型組、地奧司明（0.168 g/kg）組和脈絡舒通丸低、中、高劑量（0.56、1.68、5.04 g/kg）組。除對照組外，其余各組均采用耳緣iv 20%甘露醇建立STP兔模型。造模同時各給藥組連續(xù)ig給藥14 d。采用蘇木素-伊紅（HE）染色法檢測各組兔耳組織病理變化；ELISA檢測各組血清中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6水平；Western blotting檢測耳組織蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）和信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）蛋白表達及磷酸化水平。共篩選得到脈絡舒通丸活性成分作用靶點1112個，STP疾病相關靶點837個，二者共同靶點84個，根據(jù)拓撲特征值篩選出核心靶點31個，富集分析發(fā)現(xiàn)核心靶點主要與平滑肌細胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應的正調(diào)控、凋亡過程的調(diào)控等生物過程，以及JAK/STAT信號通路、PI3K/Akt信號通路有關。體內(nèi)動物實驗結果顯示，脈絡舒通丸組兔耳組織病理損傷顯著改善，血清中IL-1β、TNF-α和IL-6水平顯著降低（＜0.05、0.01），耳組織Akt、PI3K、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平均顯著下調(diào)（＜0.05、0.01）。脈絡舒通丸可能通過下調(diào)PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達，抑制炎癥和血栓的形成，從而發(fā)揮抗STP的作用。

脈絡舒通丸；血栓性淺靜脈炎；網(wǎng)絡藥理學；磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路；Janus激酶2/信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子信號3通路

血栓性淺靜脈炎（superficial thrombophlebitis，STP）是臨床常見的一種血栓性、炎癥病變的血管性疾病，主要表現(xiàn)為病變淺靜脈出現(xiàn)條索狀硬塊，形如蚯蚓，色赤，可出現(xiàn)局部紅腫疼痛[1]。由于其早期臨床癥狀相對較輕，患者未進行及時有效的治療，出現(xiàn)血栓脫落，可誘發(fā)深靜脈血栓、心、肺、腦血管栓塞等并發(fā)癥，對生命健康造成嚴重威脅。臨床上常用的治療藥物多為抗感染、抗凝、溶栓類藥物、非甾體抗炎藥、免疫抑制劑等，雖然能在一定程度上緩解患者的臨床癥狀，但其治愈率低，治療效果欠佳，治療成本較高且常導致多種不良反應[2]。中醫(yī)認為STP屬于“赤脈、青蛇毒、惡脈、脈痹”等范疇，濕熱濁瘀阻絡是基本病機，應采用清熱利濕、化瘀通絡、祛濕消腫的方式治療。

脈絡舒通丸源于國醫(yī)大師唐祖宣先生的經(jīng)驗方，全方由黃芪、金銀花、黃柏、蒼術、薏苡仁、玄參、當歸、白芍、水蛭、蜈蚣、全蝎和甘草共12味中藥組成，方中黃芪、金銀花為君藥；黃柏、蒼術、薏苡仁、當歸、白芍、玄參為臣藥；水蛭、全蝎、蜈蚣為佐藥；甘草為使藥，調(diào)和諸藥；共奏清熱解毒、化瘀通絡、祛濕消腫的功效，與STP濕熱濁瘀阻絡的病機相契合。現(xiàn)代藥理學研究顯示，黃芪和當歸及其活性成分均具有抗氧化、抑制炎癥介質(zhì)表達、抗血小板凝集和抗血栓形成的作用[3-4]；金銀花和玄參的提取物可顯著降低白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的產(chǎn)生，達到良好的抗炎作用[5-6]；水蛭、蜈蚣和全蝎均可抑制血小板聚集，增強纖溶活性，具有明顯的抗血栓形成的功效[7]，表明脈絡舒通丸可起到防止血栓形成和抑制炎癥作用。目前，脈絡舒通丸廣泛應用于臨床治療STP[8]，療效顯著，不良反應少，但關于脈絡舒通丸的研究主要集中在臨床療效方面，缺乏其具體作用機制方面的研究。

網(wǎng)絡藥理學是在系統(tǒng)生物學的基礎上結合現(xiàn)代的計算機技術構建“藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡，揭示藥物與治療疾病之間的分子關聯(lián)規(guī)律，從多維度探討中醫(yī)藥與疾病的關系，體現(xiàn)中醫(yī)藥治療疾病的整體性[9-11]。因此，本研究首先基于網(wǎng)絡藥理學探討脈絡舒通丸抗STP的潛在作用機制，篩選出關鍵信號通路，然后通過體內(nèi)動物實驗，采用20%甘露醇建立STP兔模型，運用Western blotting技術進一步探究脈絡舒通丸抗STP的作用機制，為其臨床治療STP奠定堅實的理論基礎和科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

36只健康日本大耳白兔，雌雄各半，2.50～2.75 kg，購自中國食品藥品檢定研究院［許可證號SCXK（京）2019-0006］，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心，適應性飼養(yǎng)7 d。飼養(yǎng)條件為12 h光照/12 h黑暗，單籠飼養(yǎng)，室溫（25±2）℃，自由飲水和進食。本實驗中所有操作均符合相關動物實驗倫理原則，并獲得天津中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號TCM-LAEC2021253）。

1.2 藥品與試劑

脈絡舒通丸（批號918200011）由魯南厚普制藥有限公司提供；20%甘露醇（批號201003A01）購自山東華魯制藥有限公司；0.9%氯化鈉注射液（批號2112221909）購自石家莊四藥有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（批號分別為JYM0003Rb、JYM0011Rb、JYM0006Rb）購自武漢基因美科技有限公司；ECL化學發(fā)光試劑盒（批號S7105010）、BCA蛋白定量試劑盒（批號20201ES76）購自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA組織/細胞裂解液（批號R0010）購自北京索萊寶科技有限公司；Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）兔單克隆抗體（批號AB32101）、信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）鼠單克隆抗體（批號AB68153）購自英國Abcam公司；磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）鼠單克隆抗體（批號BS4605）購自美國Bioworld公司；p-PI3K鼠單克隆抗體（批號4228）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）鼠單克隆抗體（批號2920）、p-Akt鼠單克隆抗體（批號5106）、p-JAK2兔單克隆抗體（批號3771）、p-STAT3兔單克隆抗體（批號9145）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）鼠單克隆抗體（批號97166）購自美國CST公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號S0001）、HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗（批號S0002）購自美國Affinity Biosciences公司。

1.3 儀器

Infinite M200 Pro型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；3K15型冷凍高速離心機（美國Sigma公司）；ASP200S型自動真空組織脫水機、EG1150H型自動生物組織包埋機、RM2255型切片機（德國Leica公司）；DYY-7C型、DYCZ-40D型電泳轉(zhuǎn)膜設備（北京六一生物科技有限公司）；Chemi Scope6200型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司）；Nikon Ci-L型顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡藥理學預測脈絡舒通丸抗STP的作用機制

2.1.1 脈絡舒通丸活性成分及其作用靶點獲取 運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索脈絡舒通丸活性成分，并根據(jù)藥物的吸收、分布、代謝、排泄（absorption, distribution, metabolism, excretion，ADME）參數(shù)，設定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件，得到脈絡舒通丸的潛在活性成分。由于TCMSP中未篩選到水蛭、蜈蚣、全蝎的活性成分，故通過CNKI數(shù)據(jù)庫中相關文獻補充水蛭、蜈蚣、全蝎的活性成分[12-17]，將補充成分整合到TCMSP數(shù)據(jù)庫的篩選結果中。并應用PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取活性成分的簡化分子線性輸入規(guī)范（simplified molecular input line entry system，SMILES）。

將脈絡舒通丸活性成分的SMILES導入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www. swisstargetprediction.ch/），限定物種為“Homo sapiens”，選擇“possibility”大于0的靶點作為脈絡舒通丸活性成分的成分作用靶點。

2.1.2 STP疾病作用靶點獲取 以“superficial thrombophlebitis”和“superficial vein thrombosis”關鍵詞進行檢索，在GeneCards（https://www. genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）和GisGeNET（https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫中進行檢索，并將3個數(shù)據(jù)庫獲得的靶點合并去重復項后，規(guī)范化后得到STP疾病作用靶點。

2.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建及分析 將脈絡舒通丸的潛在活性成分作用靶點與STP疾病作用靶點導入VENN（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線工具，取其交集，獲得共同靶點。通過STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）對共同靶點進行PPI網(wǎng)絡構建。

將PPI網(wǎng)絡導入Cytoscape 3.7.2平臺進行可視化分析，并使用Network Analyzer插件進行網(wǎng)絡節(jié)點的拓撲參數(shù)分析。以“度值＞中位數(shù)、介數(shù)中心性＞中位數(shù)、中心接近度＞中位數(shù)”作為篩選條件，獲取脈絡舒通丸抗STP的核心靶點。

2.1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 為進一步探索脈絡舒通丸治療STP的作用機制，將核心靶點導入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），使用“Functional Annotation”功能，將物種設置為“Homo sapiens”，進行GO功能和KEGG信號通路富集分析。根據(jù)值從小到大，篩選出脈絡舒通丸抗STP的主要生物過程及信號通路。

2.2 動物實驗

2.2.1 分組、造模及給藥 將36只兔隨機分為對照組、模型組、地奧司明（0.168 g/kg，相當于臨床等效劑量）組和脈絡舒通丸低、中、高劑量（0.56、1.68、5.04 g/kg，分別相當于臨床劑量的1/3、1、3倍）組，每組6只。除對照組外，其余各組采用雙側(cè)耳緣iv 20%甘露醇建立STP兔模型，采用兔固定器限制兔子活動，距耳尖2 cm處，用生理鹽水進行耳緣靜脈預穿刺，確保頭皮針在靜脈中同時藥液無滲漏，以1 mL/min緩慢推注20%甘露醇溶液（4.0 mL/kg），藥物注射結束后推注1 mL生理鹽水，每日2次注射，共注射14 d。造模期間每日觀察耳緣靜脈及其周圍組織皮膚顏色，若皮膚變紅并有硬結，表示STP兔模型構建成功。造模同時，對照組和模型組ig純水，各給藥組ig相應藥物，1次/d，連續(xù)14 d。實驗結束后，ip戊巴比妥鈉麻醉，靜脈取血，離心獲取血清；以靜脈穿刺點前方1.5 cm為中心，切取1 cm2耳廓組織，用于后續(xù)實驗。

2.2.2 兔耳組織蘇木素-伊紅（HE）染色 取兔耳組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后進行連續(xù)切片，進行常規(guī)HE染色步驟，在光學顯微鏡下觀察耳組織耳緣靜脈及周圍組織的病理學變化。

2.2.3 血清炎癥因子水平檢測 取各組兔血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

2.2.4 Western blotting檢測兔耳組織相關蛋白表達 取兔耳組織勻漿，RIPA裂解液進行充分裂解，離心提取兔耳總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液室溫封閉1 h，分別加入PI3K（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p-Akt（1∶1000）、JAK2（1∶1000）、p-JAK2（1∶1000）、STAT3（1∶1000）、p-STAT3（1∶1000）和GAPDH（1∶3000）抗體，4 ℃孵育過夜；加入相應二抗（1∶3000），室溫孵育1 h后洗膜，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照并進行灰度值分析。

2.3 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 網(wǎng)絡藥理學分析

3.1.1 脈絡舒通丸活性成分及其作用靶點獲取 根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫的檢索結果及文獻檢索，收集整理并去除重復成分后得到脈絡舒通丸145個活性成分，其中黃芪活性成分14個、金銀花活性成分15個、黃柏活性成分29個、蒼術活性成分2個、薏苡仁活性成分8個、玄參活性成分4個、當歸活性成分2個、白芍活性成分6個、甘草活性成分61個、水蛭活性成分11個、蜈蚣活性成分12個、全蝎活性成分6個。將各活性成分的SMILES導入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進行脈絡舒通丸活性成分的作用靶點預測，共獲取10 591個成分作用靶點，去除9479個重復靶點，得到脈絡舒通丸的1112個活性成分作用靶點。

3.1.2 STP疾病作用靶點獲取 以“superficial thrombophlebitis”和“superficial vein thrombosis”關鍵詞分別在GeneCards、OMIM和GisGeNET數(shù)據(jù)庫中進行檢索，分別得到272個、384個和5個STP疾病作用靶點，合并整理3個數(shù)據(jù)庫檢索結果共獲得856個疾病作用靶點，刪除19個重復項，獲得837個STP疾病作用靶點。

3.1.3 脈絡舒通丸活性成分與STP疾病的共同靶點PPI網(wǎng)絡構建及分析 將脈絡舒通丸的1112個活性成分作用靶點與837個STP疾病作用靶點導入Venn在線工具，取其交集，并繪制Venn圖，得到共同靶點84個，見圖1。將得到的84個共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中，隱藏孤立靶點，構建得到具有80個點，825條邊的共同靶點PPI網(wǎng)絡，見圖2，其中節(jié)點代表共同靶點；節(jié)點大小和顏色深淺代表度值大小，節(jié)點越大、顏色越深，代表度值越大，靶點越關鍵；節(jié)點間連接的直線表示2個共同靶點之間有相互作用。

圖1 脈絡舒通丸活性成分與STP疾病作用靶點的Venn圖

圖2 脈絡舒通丸活性成分與STP疾病共同靶點PPI網(wǎng)絡

將脈絡舒通丸活性成分與STP疾病的共同靶點PPI網(wǎng)絡導入Cytoscape 3.7.2平臺進行可視化分析，并使用NetworkAnalyzer插件進行網(wǎng)絡節(jié)點的拓撲參數(shù)分析。以度值＞中位數(shù)（19.00）、介數(shù)中心性＞中位數(shù)（14.99）、中心接近度＞中位數(shù)（0.54）作為篩選條件，得到31個脈絡舒通丸抗STP的核心靶點，其關鍵拓撲參數(shù)，見表1。

3.1.4 脈絡舒通丸抗STP的關鍵靶點的GO功能和KEGG通路富集分析 使用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對31個脈絡舒通丸抗STP的核心作用靶點進行GO功能富集分析（＜0.05），共得到150個條目，包括113個生物過程（biological processes，BP）、22種細胞組分（cellular components，CC）、15種分子功能（molecular functions，MF），根據(jù)值分別選取前10條進行可視化處理，見圖3。BP主要涉及平滑肌細胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應的正調(diào)控、凋亡過程的調(diào)控等，CC主要涉及細胞外區(qū)域、細胞外間隙、細胞膜等，MF主要涉及PI3K結合、蛋白磷酸酶結合、內(nèi)肽酶活性等，體現(xiàn)脈絡舒通丸抗STP是多重作用的結果。

表1 脈絡舒通丸抗STP核心靶點的拓撲參數(shù)信息

KEGG通路富集分析中共獲得118條相關信號通路（＜0.05），根據(jù)值由小到大順序制作排名前20的信號通路氣泡圖，見圖4，其中包括JAK/STAT、PI3K/Akt 2條主要炎癥相關信號通路，流體剪切應力和動脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）2條與血管性疾病相關信號通路，5條癌癥相關信號通路，7條病毒相關信號通路，4條其他信號通路。由于STP的發(fā)生發(fā)展與炎癥和血栓密切相關，因此，本研究對KEGG信號通路富集分析結果中2條炎癥相關信號通路和2條與血管性疾病相關信號通路進行文獻調(diào)研。

圖3 脈絡舒通丸抗STP的核心靶點的GO功能富集分析

圖4 脈絡舒通丸抗STP的核心靶點的KEGG通路富集分析

經(jīng)文獻檢索，流體剪切應力和動脈粥樣硬化、VEGF信號通路參與機體血管生成，促進血管內(nèi)皮細胞增生與凋亡[18-19]；JAK/STAT信號通路可通過維持血管內(nèi)皮細胞的穩(wěn)態(tài)、抑制血管內(nèi)的氧化應激及炎癥損傷，PI3K/Akt信號通路具有抑制炎癥和抗血栓形成的作用[20-21]。由此可知，流體剪切應力和動脈粥樣硬化、VEGF信號通路以影響血栓為主；而PI3K/Ak和JAK/STAT信號通路主要與炎癥反應和血栓形成密切相關，且這2條信號通路的相關研究較多，值排名較小。故本研究預測脈絡舒通丸可能是通過調(diào)控PI3K/Akt和JAK/STAT信號通路發(fā)揮抗STP作用。

3.2 脈絡舒通丸抗STP的體內(nèi)實驗作用機制研究

3.2.1 脈絡舒通丸對STP模型兔耳組織病理形態(tài)的影響 如圖5所示，對照組兔耳組織中靜脈內(nèi)皮細胞形態(tài)完整，呈梭形均勻有序的排列，內(nèi)膜光滑無脫落現(xiàn)象，且無任何血栓和炎性細胞的浸潤。與對照組比較，模型組兔耳組織血管管腔被破壞，靜脈內(nèi)膜無規(guī)則性嚴重脫落，管腔內(nèi)有明顯血栓產(chǎn)生，管壁及周圍組織可見大量炎性細胞的浸潤，表示STP兔模型建立成功。與模型組比較，各給藥組兔耳組織靜脈內(nèi)皮細胞形態(tài)完整性和內(nèi)膜脫落情況均有不同程度的改善，僅可見輕微血栓形成，少量炎性細胞局部浸潤于管腔和周圍組織，以脈絡舒通丸高劑量組病理改善最為明顯。

圖5 脈絡舒通丸對STP模型兔耳組織病理變化的影響(HE)

3.2.2 脈絡舒通丸對STP模型兔血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 如圖6所示，與對照組比較，模型組兔血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。提示脈絡舒通丸對STP模型兔血清炎癥水平具有顯著的抑制作用。

3.2.3 脈絡舒通丸對STP模型兔JAK/STAT、PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響 為了進一步研究脈絡舒通丸抗STP的分子機制，本研究測定網(wǎng)絡藥理學預測PI3K/AKT、JAK/STAT信號通路中關鍵蛋白的表達水平。如圖7所示，與對照組比較，模型組兔耳組織中Akt、PI3K、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平明顯上調(diào)（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組Akt、PI3K、JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平明顯下調(diào)（＜0.05、0.01）。表明脈絡舒通丸可通過抑制PI3K/Akt、JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮抗STP作用。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖7同

4 討論

STP為臨床常見的周圍血管疾病，臨床以軀干部或肢體處淺靜脈發(fā)生血栓性、炎癥病變，靜脈循行處出現(xiàn)結節(jié)或條索狀，伴有明顯觸痛等為主要表現(xiàn)特征。STP歸屬于中醫(yī)學“脈痹”“赤脈”“青蛇毒”等范疇。《醫(yī)宗金鑒?外科心法要訣》中闡述：青蛇毒，此證又名青蛇便，生于小腿肚下，形長二三寸，結腫，紫塊，僵硬[22]。其主要病機為熱毒、水濕和血瘀阻于脈絡。故中醫(yī)治療以清熱利濕、活血化瘀為主。脈絡舒通丸由黃芪、金銀花、黃柏、蒼術、薏苡仁、玄參、當歸、白芍、水蛭、蜈蚣、全蝎、甘草組成，具有清熱解毒、化瘀通絡、祛濕消腫之功效，切中STP濕熱濁瘀阻絡的基本病機[23]。然而，脈絡舒通丸抗STP的作用機制尚未完全明確。

圖7 脈絡舒通丸對STP模型兔耳組織PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達的影響(, n = 6)

本研究采用網(wǎng)絡藥理學整合體內(nèi)實驗的方式從多靶點、多角度、多途徑揭示脈絡舒通丸抗STP的作用機制，探討脈絡舒通丸抗STP的潛在靶點和分子機制。網(wǎng)絡藥理學結果顯示，共篩選出脈絡舒通丸145個活性成分及1112個成分作用靶點，837個STP疾病作用靶點，2者共同靶點共84個；將84個共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中，隱藏孤立靶點，進行PPI網(wǎng)絡分析，共篩選得到31個脈絡舒通丸抗STP的核心靶點，經(jīng)KEGG通路富集分析脈絡舒通丸抗STP主要涉及PI3K/Akt、JAK/STAT、VEGF、流體剪切應力和動脈粥樣硬化等介導的信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt和JAK/STAT信號通路是與炎癥反應和血栓形成密切相關的信號通路，且這2條信號通路的相關研究較多，值排名較小。因此，本研究基于PI3K/Akt和JAK/STAT 2條信號通路深入探討脈絡舒通抗STP的作用機制。

PI3K/Akt信號通路是重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，已被報道在結腸炎、關節(jié)炎、腦缺血再灌注損傷的炎癥反應中發(fā)揮重要作用[24]。PI3K是一種由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基P110構成的異源二聚體，調(diào)節(jié)亞基p85可通過SH2結構與磷酸化的酪氨酸殘基作用，激活PI3K，進而增加3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3）的產(chǎn)生，PIP3能夠使PI3K下游關鍵靶蛋白Akt的Thr308、Ser473殘基磷酸化并使其活化，活化的Akt可調(diào)控下游多種靶蛋白介導的生物過程，包括炎癥反應和內(nèi)皮損傷等[25-27]。研究發(fā)現(xiàn)，豨薟草水煎液可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路抑制NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，從而改善腦缺血再灌注損傷模型大鼠的炎癥反應[28]。此外，PI3K/Akt信號通路也可介導依賴凝血酶的血小板信號轉(zhuǎn)導，調(diào)控蛋白酶活化受體表達進而抑制血小板活化及黏附，延遲血栓的形成[29]。研究表明，水溶性番茄濃縮物通過抑制PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗血小板聚集和血栓形成的作用[30]。因此，本研究應用Western blotting技術檢測各組兔耳組織中PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt蛋白的表達水平，結果顯示脈絡舒通丸能明顯下調(diào)PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平，表明脈絡舒通丸可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路來發(fā)揮抗STP作用。

JAK/STAT信號通路主要通過多種細胞因子介導調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡及炎癥反應。JAK2/STAT3是在炎性疾病中研究較多的信號通路，且JAK2特異性激活STAT3[31]。當受到外界信號刺激時，干擾素等配體與細胞膜上多種細胞因子受體結合，以同源或異源二聚體的形式磷酸化JAK2，磷酸化的JAK2隨即募集細胞質(zhì)中的STAT3，磷酸化后的STAT3形成二聚體進入到細胞核，最終與目的基因啟動子相結合，調(diào)控血管內(nèi)皮細胞功能及炎癥反應等生物過程[32]。研究表明，白藜蘆醇可通過抑制JAK2/STAT3通路，下調(diào)TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，減輕ApoE?/?小鼠動脈血管內(nèi)的炎癥損傷[33]。AG490（一種JAK2/STAT3信號通路的專效抑制劑）可顯著抑制高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷，其作用機制是通過阻斷JAK2/STAT2信號通路，維持血管內(nèi)皮細胞的穩(wěn)態(tài)[34]。此外，AG490也可通過阻斷JAK2/STAT3信號通路，抑制月桂酸鈉溶液誘導的血栓閉塞性脈管炎大鼠的炎癥反應和血栓形成[35]。故本研究應用Western blotting技術檢測各組兔耳組織中JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達水平，結果顯示脈絡舒通丸可顯著下調(diào)JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平，表明脈絡舒通丸也可能通過調(diào)控JAK/STAT信號通路來發(fā)揮抗STP作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法預測了脈絡舒通丸抗STP的作用機制，并進一步通過體內(nèi)實驗探討其潛在的作用機制。結果表明，脈絡舒通丸可抑制STP模型兔血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，并顯著改善STP模型兔的病理損傷。其作用機制可能通過抑制PI3K/Akt和JAK2/STAT3 2條信號通路的激活，并下調(diào)多種炎癥因子表達水平來發(fā)揮抗STP作用，為臨床脈絡舒通丸治療STP提供堅實的理論基礎和實驗依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Mailuo Shutong Pills in treatment of superficial thrombophlebitis based on network pharmacology and experimental verification

CAO Ning-ning1, LI Shi-rong2, WANG Qing-guo1, WANG Wei3, SUN Cheng-hong2, YAO Jing-chun2, ZHANG Gui-min2, XIAO Xue-feng1

1. School of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. New Drug Pharmacology Center of Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276000, China 3. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276000, China

To explore the mechanism of Mailuo Shutong Pills (脈絡舒通丸, MLSTW) in treatment of superficial thrombophlebitis (STP) based on combination of network pharmacology and animal experimental validation.Drug targets of MLSTW and targets related to STP were screened from disease and drug related database, and key targets were screened according to topological eigenvalues. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were performed. The Japanese white rabbits were randomly divided into control group, model group, diosmin (0.168 g/kg) group and MLSTW low-, medium-, high-dose (0.56, 1.68, 5.04 g/kg) groups. Except for control group, the rabbit model of STP was established by injecting 20% mannitol into bilateral auricular vein in other groups. At the same time, the treated groups were ig drugs for 14 d. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of rabbit ear tissues; ELISA was used to detect the levels of interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and IL-6 in serum; Western blotting was used to detect the expressions of protein kinase B (Akt), phosphatidylin-ositol-3-kinase (PI3K), Janus kinase 2 (JAK2), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) proteins and phosphorylation levels in rabbit ear tissues.A total of 1112 compounds targets of MLSTP, 837 STP disease targets, 84 common targets and 31 key targets were obtained. Enrichment analysis showed that the key targets were mainly involved in biological processes such as positive regulation of smooth muscle cell proliferation, positive regulation of inflammatory response, positive regulation of apoptotic process, as well as PI3K/Akt signaling pathway, JAK/STAT signaling pathway.experiment results showed that pathological damage of rabbit ear tissues in MLSTW group was significantly improved, levels of IL-1β, TNF-α, IL-6 in serum of rabbits were significantly decreased (< 0.05, 0.01), phosphorylation levels of Akt, PI3K, JAK2 and STAT3 in rabbit ear tissues were significantly reduced (< 0.05, 0.01).MLSTP can play an anti-STP role by down-regulating the expressions of PI3K/Akt and JAK2/STAT3 signaling pathway related proteins, inhibiting inflammation and thrombosis.

Mailuo Shutong Pills; superficial thrombophlebitis; network pharmacology; phosphatidylin-ositol-3-kinase/protein kinase B signaling pathway; Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)06 - 1860 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.018

2022-11-22

國家自然科學基金資助項目（81973557）；天津市自然科學基金重點項目（20JCZDJC00010）；釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室（天津藥物研究院）開發(fā)課題資助（010162001）

曹寧寧，博士研究生，從事中藥質(zhì)量控制研究。E-mail: cnn01070980@163.com

張貴民，研究員，主要從事創(chuàng)新藥物研發(fā)。E-mail: lunanzhangguimin@yeah.net

肖學鳳，教授，主要從事新藥研發(fā)。E-mail: kai1219@163.com

[責任編輯 李亞楠]