劉昕彤，王 希

（1黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院/中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所，哈爾濱 150080；2黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江省甜菜工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150080；3國家糖料改良中心/中國農(nóng)業(yè)科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)研究人員在系統(tǒng)紅斑狼瘡患者的血清中發(fā)現(xiàn)的，早期被認定為自身免疫蛋白，后來發(fā)現(xiàn)PCNA只在正常的增殖細胞核中存在，所以被命名為增殖細胞核抗原[1]。PCNA僅在分裂的細胞中活躍，并且是以較高的濃度存在。PCNA 是一種分子量為36 kDa 的蛋白[2]。作為DNA 聚合酶δ 輔助蛋白的PCNA，合成在細胞核中，并且在細胞核中獨立存在。PCNA 通過調(diào)節(jié)聚合酶與模板鏈的結(jié)合狀態(tài)從而影響DNA 的合成。此外，它還參與細胞周期控制、錯配修復、岡崎片段成熟、核苷酸切除修復、切除修復、核苷酸切除修復、姐妹染色單體重組、染色質(zhì)組裝、染色質(zhì)重塑、跨損傷合成等[3]。

在過去的40年中，研究者對PCNA的研究從未停止，PCNA 的功能也越來越明確。PCNA 是一種無所不在的核蛋白，在DNA 的復制和修復中起重要作用。PCNA 是一種進化保守的環(huán)狀核同型三聚體蛋白，屬于DNA 滑動鉗家族[4]。研究者們在植物、動物和微生物中均發(fā)現(xiàn)了PCNA 的存在，其中在對哺乳動物的PCNA的研究中發(fā)現(xiàn)，PCNA可以促進損傷旁路修復；在對植物的研究中發(fā)現(xiàn)，PCNA 參與DNA 的復制，可以提高相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性、并且可以促進相關(guān)的招募和動態(tài)交換。但是，有關(guān)PCNA 的研究還是以醫(yī)學研究為主，研究對象也多為哺乳動物，植物PCNA的研究報道很少且研究較為落后。本研究將對PCNA的表達調(diào)控、PCNA 參與DNA 的復制、PCNA 參與DNA 的修復以及PCNA參與細胞周期調(diào)控這4個方面的功能研究現(xiàn)狀進行歸納總結(jié)，希望為今后繼續(xù)對PCNA 進行植物相關(guān)深入研究提供相關(guān)資料。

1 PCNA的結(jié)構(gòu)

在生理狀態(tài)下，PCNA 的存在形式是同源三聚體[5]，每個PCNA 單體均含有兩個結(jié)構(gòu)域，這2 個結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)都是一致的，并且每個結(jié)構(gòu)域的中心存在2 個α 螺旋，因此，每一個獨立的PCNA 分子是由3個首尾相互連接的同源單體共同組成的一個形狀特殊的閉合的六角形，所以可以推出一個PCNA 分子是由6 個一模一樣的結(jié)構(gòu)域和12 個α 螺旋組成。在PCNA參與DNA復制過程中，正因為這些α螺旋的存在才可以讓PCNA附著在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)上，同時又可以在DNA 鏈上自由移動。除此之外，PCNA 還含有9 個反向平行的β折疊，這些β折疊作用在多種蛋白上，同時可以促進疏水作用。有研究發(fā)現(xiàn)PCNA 具有保守性，因此即使是進化水平存在差異的物種，它們的PCNA二級結(jié)構(gòu)都是相同的，并且他們都有極為近似的三級結(jié)構(gòu)[6]。同時經(jīng)過研究可以發(fā)現(xiàn)PCNA 的復制模式以及它獨特的三級結(jié)構(gòu)滿足DNA復制過程的需要，正因如此才使得它沒有被淘汰。

PCNA是保守的滑動鉗(sliding clamp)家族的成員之一，在古細菌和真核生物的基因組中均發(fā)現(xiàn)了PCNA 的存在[7]。研究發(fā)現(xiàn)每個擬南芥中均含有兩個PCNA分子，這兩個PCNA分子中的9個氨基酸各有不同，其氨基酸序列的一致性達到97%[8]。PCNA三聚體分子表面是由反向平行的β-折疊組成，分子中心是α-螺旋富含疏水殘基，主要依靠氫鍵、離子鍵和β折疊而相互作用，這就意味著在表面存在著具有雙重功能電子對，它不僅穩(wěn)定了三聚體的分子結(jié)構(gòu)，也解決了蛋白肽鏈之間首尾相接的結(jié)構(gòu)。在PCNA三聚體分子的內(nèi)表面含有帶正電的賴氨酸和精氨酸殘基，這些氨基酸殘基被假設(shè)通過水的介導與DNA 鏈上的磷酸分子相互作用并在DNA單鏈上滑動[9-10]。環(huán)狀的PCNA三聚體有同源和異源兩種形式，且所有的復合物有著明顯相似的結(jié)構(gòu)。在擬南芥雙分子熒光互補和生化試驗表明，PCNA 蛋白單體可以結(jié)合形成4 種環(huán)狀結(jié)構(gòu)：1/1/1、1/1/2、1/2/2 和2/2/2[11]與PCNA 相互作用的蛋白質(zhì)。目前在對PCNA分子層面的研究中其基因序列也在不同的物種中出現(xiàn)有關(guān)報道，其中在絕大部分高等植物中至少有兩個PCNA 蛋白質(zhì)，即PCNA1和PCNA2，目前，已在水稻、大豆、玉米、擬南芥、煙草等植物中發(fā)現(xiàn)了PCNA。大豆、水稻等植物的基因組至少編1 個PCNA，而玉米、擬南芥、煙草等的基因組編碼至少2個PCNA。

2 PCNA的功能

2.1 PCNA參與DNA復制與修復

DNA復制是最基本的細胞過程之一，它確保生物體的遺傳信息準確復制，并在細胞分裂期間傳遞給子細胞。在重要的生物學過程中，DNA復制是對參與該過程的蛋白質(zhì)數(shù)量要求最高的過程。Replisome 是由200 多種多肽組成的復雜而動態(tài)的細胞機制[12]。PCNA在實現(xiàn)復制聚合酶復合物的過程性中起著不可或缺的作用，對細胞的生存至關(guān)重要[13]。PCNA 作為真核細胞DNA聚合酶的輔助蛋白，與不同的復制相關(guān)蛋白結(jié)合，協(xié)調(diào)DNA復制的過程[14]。近些年來在酵母和人類中，DNA聚合酶Polδ與PCNA的物理和功能相互作用已被廣泛研究[15-16]。ScPolδ 由Pol3、Pol31 和Pol32亞基組成，而哺乳動物的Pol由p125作為催化亞基，p50、p68和p12作為結(jié)構(gòu)亞基[17]組成。而在2000年左右就有學者發(fā)現(xiàn)了植物PCNA與Fen1的互作現(xiàn)象，并且在對其進行進一步探索后發(fā)現(xiàn)植物不僅可以與PCNA相結(jié)合，還可以增強Fen1的活性[18-20]。因此，目前在總結(jié)相關(guān)結(jié)論后研究人員發(fā)現(xiàn)，PCNA參與DNA復制，并且在復制過程中，可以提高復制中相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性，促進招募以及推進相關(guān)動態(tài)交換。由于PCNA 和復制因子C(replication Factor C，RFC)都是與DNA 復制和修復過程相關(guān)的蛋白[21]，在RFC 的幫助下，PCNA 不僅能在雙鏈DNA 上自發(fā)滑動[22]，還能環(huán)繞雙鏈DNA。一旦與DNA 結(jié)合，該復合物就成為一個結(jié)合平臺，用于招募和協(xié)調(diào)與DNA代謝途徑相關(guān)的多種調(diào)控DNA 復制和DNA 修復蛋白[23-24]。在植物體中，擬南芥RFC2/3/4/5 和水稻RFC1/2 的c 端是與PCNA 結(jié)合所必需的，而水稻RFC3/4/5 介導PCNA 相互作用的區(qū)域同時分布在N-和C端[25]。

Translesion DNA synthesis(TLS)通過對模板DNA的損傷修飾實現(xiàn)DNA 復制，并需要Rad6/Rad18 復合物對增殖細胞核抗原(PCNA)滑動鉗進行單倍化。這種翻譯后修飾對暴露于DNA 損傷劑后的細胞存活至關(guān)重要，并受到嚴格調(diào)控，以限制TLS 對受損DNA 的影響[26]。復制蛋白A(Replication protein A,RPA)是主要的單鏈DNA(ssDNA)結(jié)合蛋白復合物，在暴露于TLS 位點的ssDNA 上形成細絲，并在調(diào)控PCNA 單泛素化中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[27-28]。PCNA 參與TLS 的調(diào)節(jié)途徑，它通過募集特殊的聚合酶來調(diào)控聚合酶與polε 和polδ 之間的相互作用，并且作為調(diào)節(jié)因子，PCNA提高了損傷旁路活性。而在擬南芥中目前只能得知其含有PCNA1 和PCNA2 兩種不同的PCNA 亞型，同時通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)與TLS相關(guān)的polη不能與PCNA1結(jié)合，只能與PCNA2結(jié)合[29]，但是卻在后續(xù)沒能發(fā)現(xiàn)PCNA是否可以提高擬南芥損傷旁路活性的相關(guān)報道。

植物體細胞中的DNA 分子在其生長發(fā)育過程中會受到來自外界的諸多因素的影響，例如物理因素和化學因素等，這些因素是造成DNA結(jié)構(gòu)受損的主要原因之一，嚴重影響植物細胞的正常生長發(fā)育。在對DNA 進行修復時，發(fā)現(xiàn)了PCNA 的存在，并且PCNA還在該過程發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[30]，它能夠及時識別受損部位并對患處進行切除，再與修復蛋白相結(jié)合，并將其引到患處，從而修復受損傷的DNA。

DNA 損傷修復主要包括堿基剪切修復(Base Excision Repair，BER)、核苷酸剪切修復(Nucleotide Excision Repair，NER)、錯配修復(Mismatch Repair，MMR)、同源重組(Homologous Recombination，HR)和非同源末端連接(Non-homologous End Joining，NHEJ)[31-32]。其中具體修復過程如下。

BER：堿基剪切修復，它是在DNA 序列的單個堿基出現(xiàn)錯誤時采用的修復方法。它的整個修復過程是通過DNA糖基化酶創(chuàng)造出AP位點，再由該AP位點的核酸內(nèi)切酶切除磷酸骨架，之后利用PCNA 介導的DNA 聚合酶δ/ε 修復通路最后修復切口，完成整個修復過程。PCNA在這個過程中與AP內(nèi)切酶APn、尿嘧啶DNA 糖基酶等均有結(jié)合并發(fā)揮著一定的作用，在BER修復中PCNA參與剪切與再合成這兩個重要的步驟[33]。以上PCNA參與BER過程未能在植物體中找到相關(guān)報道。

NER：核苷酸剪切修復，它是在DNA 出現(xiàn)極為嚴重的損傷時采用的修復方式。它的修復過程分為全基因組修復和轉(zhuǎn)錄耦合修復兩種，這兩種修復通路最本質(zhì)的差別在于二者的識別機制存在差異。最初人們主要在酵母和哺乳動物的DNA中研究切除修復機制，但隨著近些年來對該研究的不斷深入，切除修復機制在大部分相關(guān)酶類和植物體中也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并得到相關(guān)驗證，其中在參與核苷酸切除修復的多種相關(guān)蛋白中發(fā)現(xiàn)真核生物的切除修復是十分類似的，并且也發(fā)現(xiàn)了PCNA參與了植物體內(nèi)的切除修復并在該修復中發(fā)揮著一定的作用。

很遺憾的是在查閱相關(guān)文獻后發(fā)現(xiàn)在植物中對MMR 相關(guān)記載非常少，但目前已知的是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了錯配修復的存在，并且克隆出了錯配修復所必需的MSH2、MSH3、MSH6、MSH7等基因，這一發(fā)現(xiàn)證實了植物體內(nèi)的錯配修復過程與在哺乳動物和酵母體內(nèi)的修復過程是十分相似的，并且確定了PCNA 在錯配修復中的重要地位。這些年有關(guān)PCNA 參與DNA復制及修復的相關(guān)報道多集中在醫(yī)學上對癌癥、腫瘤及免疫系統(tǒng)相關(guān)的研究中，目前只能知道在植物體中，PCNA 的確可以通過參與DNA 復制及修復來提高相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性，并且相關(guān)研究多集中在擬南芥中，但未查到后續(xù)報道。

2.2 PCNA的表達調(diào)控

PCNA 幾乎存在于植物的所有組織中,并且可以肯定的是PCNA 也在這些植物中均有表達，同時有趣的是，在一些細胞增殖發(fā)達的組織中PCNA 的表達量要比在成熟組織和一些非分化細胞的表達量高一些，例如PCNA 在玉米的根尖、芽中的表達量要比在成熟的葉、穗中的表達量高一些；水稻根尖PCNA的表達量要高于成熟水稻葉片中的表達量；在紅花菜豆的萌芽期中PCNA的表達量比較高，而過了萌芽期后，它的表達量就會明顯下降[34,18]。

影響PCNA表達調(diào)控的因素已有若干報道。水稻PCNA 啟動子含有蛋白結(jié)合位點11a 和11b，這兩個位點是利用操控PCF1 和PCF2 兩種蛋白，進而影響著PCNA組織特異性的表達[35]，同時E2F也影響著PCNA的表達；在煙草中，煙草PCNA啟動子上的E2F同樣參與并調(diào)控PCNA 啟動子區(qū)兩個不同的結(jié)合位點，通過調(diào)節(jié)這兩個不同的位點，使PCNA 在成熟組織和幼嫩組織中的表達出現(xiàn)差異，并且二者的表達量也不相同[36]。在經(jīng)過一系列研究后發(fā)現(xiàn)，PCNA 的啟動子上存在著兩種順式調(diào)節(jié)元件，即：site II motif 和telobox，正因為這兩種不同的調(diào)節(jié)元件，使得PCNA 在不同階段的表達量出現(xiàn)差異，這也說明細胞周期是影響PCNA基因表達的重要因素之一[37]。探究者在研究擬南芥時發(fā)現(xiàn)，擬南芥種子在萌發(fā)階段所產(chǎn)生的脫落酸(ABA)也是調(diào)控PCNA 表達的因素之一，ABA 參與PCNA1 基因的表達，并且通過抑制著PCNA1 的表達量，進而影響著擬南芥種子的萌發(fā)[38]。崔看[39]選取擬南芥，通過RNAi 干涉和超表達試驗篩選獲得了PCNA1、PCNA2-OE純合子植株及RFC4-OE植株，并以這些為材料，研究了基因突變對植株生長發(fā)育及其抵抗不同濃度DNA 復制毒性物質(zhì)甲基磺酸甲酯(MMS)的影響，探究了RFC4基因及其互作因子PCNA對擬南芥生長發(fā)育的調(diào)控作用，解析了RFC4基因及其互作因子PCNA 對擬南芥生長發(fā)育的調(diào)控作用，這一研究對進一步揭示RFC 與PCNA 在植物中的互作關(guān)系及豐富植物基因組學有重要意義。PCNA在植物體內(nèi)的表達受生長發(fā)育的調(diào)控這一觀點現(xiàn)已被證實多年，但很遺憾的是，目前有關(guān)這方面的記載最近也只能追溯到2015年，未能找到后續(xù)相關(guān)報道。

除表達調(diào)控外，有報道稱PCNA 在翻譯水平上也受到調(diào)控。這些報道大多集中在酵母細胞和哺乳動物的PCNA 中，報道稱PCNA 泛素化和SUMO 化參與調(diào)節(jié)PCNA，并且可以調(diào)控蛋白的相關(guān)功能[7,40-43]。PCNA泛素化包括PCNA單泛素化和PCNA多泛素化。其中PCNA 單泛素化通過影響跨損傷合成，從而修復損傷旁路；而PCNA 多泛素化則是利用未受損姐妹單體作為模板參與并調(diào)控損傷回避通路，從而影響著PCNA蛋白的相關(guān)功能。除此之外，酵母細胞中的PCNA 蛋白利用在Lys164 位點的SUMO 化推進PCNA 的招募以及影響Srs2 解旋酶的活性，同時還抑制了RadI5-ssDNA 的形成，一定程度上避免錯誤的同源重組。Lysl27位點SUMO化可以抑制PCNA結(jié)合特定蛋白如Ecol，從而抑制姐妹染色單體的凝聚。以上相關(guān)研究未能在植物體中找到相關(guān)報道，但在已有的擬南芥相關(guān)文獻中發(fā)現(xiàn)，植物細胞和大腸桿菌中均發(fā)現(xiàn)了擬南芥兩種PCNA（PCNA1和PCNA2）的存在，且均發(fā)現(xiàn)了SUMO 化的存在[44]；與此同時發(fā)現(xiàn)，UBC 可以修飾被泛素化的擬南芥PCNA[45]。但是目前SUMO化和泛素化修飾對植物PCNA 的生物學功能尚不明確，有待進一步研究。根據(jù)研究顯示，人類滑動鉗增殖細胞核抗原(hPCNA)，通過一個保守的結(jié)合基序PIP-box與超過200 個蛋白質(zhì)相互作用，以協(xié)調(diào)DNA 復制和修復[46]。根據(jù)相關(guān)結(jié)論發(fā)現(xiàn)，PCNA 可以在細胞信號傳導中起到支撐作用并且PCNA可以獨立存在于染色質(zhì)中。而細胞溶質(zhì)PCNA 則通過結(jié)合procaspase 從而調(diào)節(jié)抑制中性粒細胞的活性，進而阻止細胞凋亡[47]。在神經(jīng)母細胞瘤中，由于一氧化氮造成的應激反映，導致PCNA出現(xiàn)S-亞硝基化，進一步使caspase-9與PCNA的相互作用減少[48]。癌細胞表面的PCNA可以抑制自然殺傷細胞的細胞毒性功能，這一發(fā)現(xiàn)也被稱作是癌細胞逃避抗腫瘤免疫的機制[49]。而參與信號轉(zhuǎn)導的蛋白質(zhì)在PCNA 復合物中被鑒定[50]。但未能找到有關(guān)植物PCNA相關(guān)免疫機制的報道。

2.3 PCNA參與細胞周期調(diào)控

對人體細胞中的PCNA 研究發(fā)現(xiàn)，PCNA 蛋白會隨著細胞周期變化而改變，在不同細胞周期中，PCNA的含量差距較大，PCNA 通過與幾種真核細胞周期蛋白（如CDK 復合體）相互作用而參與細胞周期調(diào)控。細胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21CIP1/WAF1（此處簡稱p21）是已知的最高親和力的hPCNA 相互作用蛋白(PIP)，一旦與hPCNA 結(jié)合，就會關(guān)閉復制。因此，這就阻礙了細胞周期的進展，為健康的增殖提供了必要的檢查點。p21需要hPCNA的高親和力來完成這個角色，并在與hPCNA 的相互作用和復制叉的競爭中擊敗其他蛋白質(zhì)[24]。在對動物細胞中的PCNA 進行研究后發(fā)現(xiàn)，動物細胞中PCNA可以將CDK2與其基質(zhì)相連接，繼而影響并提高CDK2 對RFC 等復制相關(guān)酶類的磷酸化。PCNA可以通過催化polα來加快酶復合體磷酸化的進程。p21 是一種細胞周期抑制因子，在一些基因組受損的細胞或衰老細胞中，p21的N-末端與CDKs相結(jié)合，C-末端與PCNA相結(jié)合，使相關(guān)酶類的活性降低，從而抑制細胞周期的表達[51]。有關(guān)植物p21 同源基因的相關(guān)文獻不是很多，但目前的研究已經(jīng)證實植物中的PCNA 蛋白能夠結(jié)合到人體中的p21 蛋白上，擬南芥PCNA 可以與p21 蛋白合成的多肽結(jié)合，但植物中沒有p21 蛋白[52]，這也表明了PCNA 蛋白是具有一定保守性的。此外，目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，PCNA1 和PCNA2 參與細胞周期調(diào)控，并且與細胞周期蛋白D 互作[53]。劉飛峰等[54]通過PCR 技術(shù)、熒光抗體標記等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)小麥PCNA 在UV-B 脅迫條件下其蛋白質(zhì)含量和表達水平均會有所變化、并且找到了在不同分裂時期下PCNA與染色體的關(guān)系。從而對進一步研究小麥“分束分裂”奠定了相關(guān)理論基礎(chǔ)。但很遺憾的是，近幾年有關(guān)PCNA 在植物上參與細胞周期調(diào)控方面未見后續(xù)報道。

3 展望

（1）根據(jù)迄今為止的報道，PCNA的結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本可以確定，即，一個完整的PCNA分子是由3個首尾相連的同源PCNA單體共同構(gòu)成的一個特殊的六邊形封閉三級結(jié)構(gòu)。PCNA不僅存在于動物、微生物中，在植物和病毒中也具有PCNA類似因子，例如在玉米、擬南芥、水稻和小麥等植物上均發(fā)現(xiàn)了PCNA的存在，并且其每個基因組都包含至少2個PCNA蛋白。

（2）PCNA與DNA聚合酶δ的相互作用確保DNA聚合酶δ 在復制過程中不會從DNA 鏈上滑落。每一次DNA鏈與聚合酶結(jié)合后合成的核苷數(shù)量越多，說明PCNA 的蛋白活性越高。崔看等[7]在對擬南芥的研究中已經(jīng)證實了PCNA參與調(diào)控植物的生長發(fā)育。此外筆者還發(fā)現(xiàn)相較于成熟的植物組織（例如成熟的葉片），一些發(fā)育中的組織（例如根尖、芽）中的PCNA 表達量要更高一些，這也說明了PCNA的細胞增殖特性。

（3）關(guān)于PCNA 的研究一直以來是研究學者探討的熱點，PCNA 在細胞增殖過程中扮演著不可缺少的角色，在眾多的調(diào)控通路中PCNA都起著重要的作用，調(diào)控通路不同，其調(diào)控的蛋白功能不同，此外PCNA還參與了染色體重組、細胞周期轉(zhuǎn)化以及細胞衰亡等多種細胞生命活動過程。

（4）根據(jù)目前已有的文獻基本可以證實，PCNA通過與聚合酶中不同的亞基相互作用，參與DNA復制體的形成，從而調(diào)控著DNA 的復制過程；PCNA 通過與多種修復相關(guān)蛋白相互作用，將蛋白引到受損部位，利用切除等方法對DNA受損部位進行修復，以確保植物體可以正常生長發(fā)育。

近些年來學者對植物中的PCNA 研究不斷深入，并且已取得了非常不錯的成果，但是不可否認的是，對PCNA的研究是從哺乳動物中開始的，并且，相較于植物中PCNA，在動物和酵母中對PCNA 的研究更深入一些。（1）PCNA的泛素化就是從哺乳動物和酵母細胞中的PCNA 中發(fā)現(xiàn)的，并且PCNA 的泛素化可以調(diào)控相關(guān)蛋白的功能，而在植物體中還無法確定泛素化對植物PCNA功能的影響。未來在研究植物PCNA功能時，可以考慮泛素化對其的影響；（2）DNA修復中的錯配修復(MMR)也在植物中研究不足，現(xiàn)有的研究也只能說明在植物體中MMR的修復過程與在酵母細胞和哺乳動物中的修復過程極度相似，卻也沒有更深入的研究記載。希望在之后可以對植物體的MMR進行更深入的研究；（3）盡管近幾年學者從未停止對PCNA的研究，但是卻都集中在醫(yī)學和動物體上，研究植物中的PCNA 也還停留在2015 年左右。因此，對PCNA 在植物中的研究還需不斷深入，以彌補相關(guān)資料不足的遺憾。