李 肯，武云鵬，彭冬秀，張 偉，張若緯*

（1.天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所/蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點實驗室，天津 300381；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，天津 300381）

甜瓜（Cucumis melonL.）屬葫蘆科甜瓜屬一年生草本植物，是典型異花授粉的瓜類作物。甜瓜的花器官分為雌花、雄花和兩性完全花，通過不同基因型的調(diào)控，植株可分為雄花完全花株、雌雄異花同株、全雌系株，目前我國育種生產(chǎn)應(yīng)用的絕大多數(shù)材料都屬于雄花完全花株和雌雄異花同株。花器官作為植物遺傳史中最為重要的承載工具，在繁殖育種與種質(zhì)資源研究工作中起著不可或缺的作用[1]。在廣義生物學(xué)功能上，雌性卵細(xì)胞與雄性精細(xì)胞結(jié)合后方能繁衍，這一過程始于傳粉、受精，從而形成種子并加以傳播。因此，花粉的作用不可小覷，其直接影響雜交育種的效率與進程。在花器官的發(fā)育過程中，花粉的活性和萌發(fā)率也隨之變化。有研究表明，在自然開花條件下，甜瓜的雄花或完全花雄蕊散粉數(shù)小時后，花粉會逐漸失去活性，花粉萌發(fā)速度和萌發(fā)率也隨之降低[2]。黃玉源等利用TTC 染色對南瓜成熟花粉粒進行活性鑒定，發(fā)現(xiàn)6:00 時花粉活性達(dá)到最高，且授粉1 h 后花粉粒迅速萌發(fā)[3]。在對西瓜花粉特性的研究中發(fā)現(xiàn)，花藥在晴天6:00 時開始散粉，8:00—9:00 花粉活性達(dá)到最高，隨后逐漸降低，溫度越高降低速率越快[4]。因此，花粉活性可能與花藥組織的適應(yīng)環(huán)境相關(guān)，尤其對于溫度、濕度極為敏感。目前對花粉的研究大多圍繞已散粉的貯存條件展開，對未開放花藥組織受貯存條件的影響鮮見報道。

甜瓜具有明顯的雜交優(yōu)勢，且絕大多數(shù)材料雄花開放時間均早于雌花或完全花，因此甜瓜的雜交育種鮮見親本花期不遇的問題。在甜瓜制種時，由于工作量大，育種單位習(xí)慣性在開花前一天收集未開放雄花并置于貯存容器中，待第二天自然散粉時進行授粉。我們在收集雄花的過程中發(fā)現(xiàn)，不同的貯存條件對著果率和結(jié)籽量有明顯影響?？梢?，在雜交工作前開展花粉活性及萌發(fā)率測定尤為重要[5]。本研究通過測定核心雜交父本材料的雄花在自然開放條件下花粉活性和萌發(fā)率，以探究棚室環(huán)境對著果率和結(jié)籽量的影響。開花前一天收集雄花，通過不同的條件貯存未開放的雄花外植體，以探究溫度、濕度和光照對授粉效果的影響，為雜交育種前期工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

厚皮甜瓜自交系‘22S131’：雄花完全花株，核心雜交父本材料；厚皮甜瓜自交系‘22S146’：雄花完全花株，雜交母本材料；厚皮甜瓜自交系‘22S201’：雌雄異花同株，雜交母本材料。以上材料均由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所甜瓜研究室提供。

1.2 自然條件下的花粉特性分析

所有試驗均在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院武清創(chuàng)新基地進行。在‘22S131’盛花期的晴天，待植株的雄花自然散粉后，用鑷子摘除雄蕊，置于硫磺紙上，帶回實驗室后收集花粉并進行花粉活性和花粉萌發(fā)率測定。試驗設(shè)3 次重復(fù)，以5 棵‘22S131’植株為供試材料，每棵植株取發(fā)育正常的2 朵雄花，分別用于花粉活性和花粉萌發(fā)測定。自剛剛散粉起，每隔1 h 采集1 次，同期記錄采集時棚室溫度和濕度。

1.3 自然條件下的結(jié)實特性分析

以‘22S131’為父本，‘22S146’和‘22S201’為母本，分別做雜交處理。母本以5 棵植株為單位僅做1 次雜交，自剛剛散粉起，每隔1 h 授粉1 次。‘22S146’做去雄處理，每次授粉2 朵并去除剩余雌花，‘22S201’則省略去雄環(huán)節(jié)，其余均相同。授粉后按常規(guī)田間栽培方法進行管理，授粉15 d 后定瓜，50 d 后果實采收采種，記錄坐果與結(jié)籽情況，取5 棵植株平均值計算著果率與結(jié)籽量。

1.4 不同貯存條件下的花粉特性和結(jié)實分析

在開花前1 d 的16:00 采集‘22S131’的雄花，用硫磺紙進行包裹，帶回實驗室培養(yǎng)箱中貯存。試驗采用單一變量法，設(shè)3 次重復(fù)。為探究溫度的影響，采用定量長光照、80%濕度，設(shè)25、15、5 ℃三個溫度處理，自剛剛散粉起1 h 后，取花粉樣品，測定花粉活性和萌發(fā)率。濕度影響采用同樣方案，定量長光照、25 ℃，設(shè)干燥、40%、80%三個濕度處理，其中干燥處理先將雄花置于密封干燥罐再置于培養(yǎng)箱中，40%和80%濕度則省略干燥罐環(huán)節(jié)。光照影響采用定量25 ℃和80%濕度，設(shè)長光照和長黑暗兩個處理。著果率及結(jié)籽量測試采用“1.3”的方案，以各處理的‘22S131’花粉為父本，‘22S146’為母本做雜交處理，散粉飽和后僅授粉1 次，均授20 棵，取平均值計算著果率與結(jié)籽量。

1.5 花粉活性測定

采用TTC 染色法進行花粉活性測定。用鑷子取少量的花粉置于載玻片上，加入1 滴0.5%TTC 溶液，均勻攪拌使花粉粒完全擴散，蓋上蓋玻片，整體置于培養(yǎng)皿中，在陽光下照射15 min 后鏡檢，活性高的花粉粒會被染成紅色，隨著活性降低，顏色也會變淡，沒有活性的花粉粒無法著色。選取5 個視野，記錄花粉粒總數(shù)和完全染為紅色的花粉粒數(shù)，取平均值計算花粉活性。

1.6 花粉萌發(fā)率測定

采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉，利用顯微鏡檢測其萌發(fā)率。在雙凹孔載玻片中滴入培養(yǎng)液，用毛筆均勻剝落花粉，將載玻片置于底部覆有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基選用添加蔗糖+硼酸，蔗糖設(shè)0、50、100、150 g·L-1四個梯度處理，硼酸設(shè)0、50、100、150 mg·L-1四個梯度處理，培養(yǎng)時間設(shè)2、4、8 h 三個階段，通過不同的添加物濃度組合篩選出適于花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)時間。采用TTC 染色法對花粉進行鏡檢，當(dāng)花粉管長度超過花粉粒直徑時，視為花粉萌發(fā)成功。選取5 個視野，記錄萌發(fā)花粉數(shù)、總花粉粒數(shù)，取平均值計算花粉萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉萌發(fā)培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)時間篩選

培養(yǎng)基花粉萌發(fā)結(jié)果如表1 所示，培養(yǎng)基中不同濃度的蔗糖和硼酸及培養(yǎng)時間對花粉萌發(fā)有顯著影響。在無添加物的條件下，‘22S131’的花粉萌發(fā)率最低，最高值僅為59.1%，因此蔗糖和硼酸對花粉萌發(fā)有一定影響。相同蔗糖濃度的條件下，花粉萌發(fā)率隨著硼酸濃度增加而升高，而相同硼酸濃度條件下，隨著蔗糖濃度增加，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)先升高再降低趨勢，當(dāng)蔗糖濃度為100 g·L-1、硼酸濃度為150 mg·L-1時，花粉萌發(fā)率最高，可達(dá)到94.9%。在相同蔗糖與硼酸濃度條件下，隨著離體培養(yǎng)時間增加，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)先升高而后平穩(wěn)趨勢，從開始培養(yǎng)至培養(yǎng)4 h，花粉萌發(fā)率逐漸升高，而培養(yǎng)8 h 與培養(yǎng)4 h 無明顯差異。綜上所述，本試驗選擇100 g·L-1蔗糖與150 mg·L-1硼酸作為最優(yōu)培養(yǎng)基添加物，選擇4 h作為離體培養(yǎng)時長，從而探究其他處理對花粉萌發(fā)的影響。

表1 甜瓜花粉萌發(fā)試驗結(jié)果

2.2 自然開花條件下的花粉活性及萌發(fā)率變化

根據(jù)統(tǒng)計，測試當(dāng)天的‘22S131’平均每棵植株上同時開放3 朵雄花，隨著時間的推移，溫度、光照逐漸升高，濕度逐漸下降，花粉活性呈現(xiàn)上升、平穩(wěn)、急劇下降的變化過程。6:30 雄蕊逐漸開始散粉，7:30 達(dá)到完全開放，花粉呈現(xiàn)飽滿狀態(tài)，11:30雄花整體出現(xiàn)萎蔫，雄蕊底部出現(xiàn)組織液外滲，至13:30花粉被完全浸濕，呈現(xiàn)黏著狀態(tài)?；ǚ刍钚詼y定結(jié)果顯示，散粉初期為82.14%，完全開放時達(dá)到最高（94.66%），至10:30 無明顯差異，11:30 迅速降低至62.35%，隨后持續(xù)降低，至14:30達(dá)到4.12%（見圖1）。從溫濕度變化過程分析，上午棚室溫度呈平緩上升狀態(tài)，濕度呈下降狀態(tài)，而11:30 棚室溫度急劇升高，濕度急劇下降，因此高溫低濕可能是花粉活性急劇降低的主導(dǎo)因素。由圖1 可知，花粉萌發(fā)率變化趨勢與花粉活力大致相同，在7:30 達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，在6:30 剛剛散粉時，花粉活力和萌發(fā)率差異明顯。未達(dá)到飽和狀態(tài)的花粉不能完全發(fā)育。

圖1 甜瓜自然散粉后的花粉活性和萌發(fā)率變化

2.3 花粉特性對結(jié)實的影響

以‘22S131’為父本，‘22S146’和‘22S201’為母本，分別做雜交處理。采種調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，花粉活性和萌發(fā)率與果實著果率和結(jié)籽量存在一定相關(guān)性。如表2 結(jié)合圖1 所示，使用6:30 的花粉授粉，兩對雜交組合著果率雖達(dá)到100%，但結(jié)籽量明顯低于使用10:30的花粉授粉；7:30—10:30，花粉活性和花粉萌發(fā)率均大于90%，兩對組合全部成功坐果，且結(jié)籽量無明顯差異；11:30起，花粉活性和萌發(fā)率迅速降低，著果率受一定影響，結(jié)籽量也顯著減少，隨著授粉時間推遲，果實結(jié)籽量呈線性減少，至14:30 兩對組合均無一坐果。綜上所述，甜瓜的授粉效果可能與花粉的特性密切相關(guān)，萌發(fā)率高的花粉更容易使卵細(xì)胞受精發(fā)育，僅依靠花粉活力來預(yù)估授粉效果可能存在誤差，花粉萌發(fā)率或許是更為準(zhǔn)確的評價指標(biāo)。

表2 不同授粉時間下甜瓜著果率與結(jié)籽量

2.4 貯存溫度對花粉及授粉效果的影響

在相同的濕度和光照條件下比較不同溫度處理雄花外植體對其花粉活性的影響。據(jù)觀察，25 ℃和15 ℃處理的雄花均于4:00 左右開始散粉，且在散粉1 h 后達(dá)到飽和狀態(tài)。5 ℃處理延遲了1 h，5:00 左右開始散粉，在散粉3 h 后達(dá)到滿粉狀態(tài)，但是由于低溫導(dǎo)致了雄蕊萎蔫，花粉量明顯少于其余兩個處理?；ǚ厶匦詼y試結(jié)果（見圖2）顯示，15 ℃處理的雄花花粉活性、萌發(fā)率最高，分別為93.21%、94.64%，與自然開花條件下飽和狀態(tài)無明顯差異；其次是25 ℃處理，花粉活性、萌發(fā)率約為80%。5 ℃處理花粉活性、萌發(fā)率最低，散粉1 h 后分別為26.53%、21.69%，在滿粉狀態(tài)時略有提高。

圖2 貯存溫度對甜瓜花粉活性和萌發(fā)率的影響

2.5 貯存濕度對花粉及授粉效果的影響

在相同的溫度和光照條件下比較不同濕度處理雄花外植體對其花粉活性的影響。據(jù)觀察，80%濕度處理的雄花于4:00 左右開始散粉，1 h 后達(dá)到飽和狀態(tài)。40%濕度和干燥處理的雄花同期散粉，但花粉分別在2 h 和3.5 h 后達(dá)到飽和狀態(tài)。三種處理的花粉量無差異，低濕環(huán)境并未造成雄蕊損傷現(xiàn)象?；ǚ厶匦詼y試結(jié)果（見圖3）顯示，80%濕度處理的雄花花粉活性、萌發(fā)率分別為81.87%、78.44%，其次是40%濕度處理的雄花，滿粉狀態(tài)時分別達(dá)到75.35%、66.87%。干燥處理的雄花散粉1 h 后花粉活性、萌發(fā)率最低，分別為26.28%、9.98%，滿粉狀態(tài)時略有提高。80%濕度處理能提高散粉速度，使花粉盡快達(dá)到飽和狀態(tài)，而干燥處理后的顯著差異可能是由于雄蕊處于逆境環(huán)境而造成的反應(yīng)。

圖3 貯存濕度對甜瓜花粉活性和萌發(fā)率的影響

2.6 光照對花粉及授粉效果的影響

在相同的溫度和濕度條件下比較不同光照時長處理雄花外植體對其花粉活性的影響。據(jù)觀察，長光照處理的雄花于4:00 左右開始散粉，1 h 后達(dá)到飽和狀態(tài)。長黑暗處理的雄花延遲4 h，在8:00 左右開始散粉，1 h 后達(dá)到飽和狀態(tài)，兩種處理的花粉量無差異?；ǚ厶匦詼y試結(jié)果（見圖4）顯示，長光照處理的雄花花粉活性、萌發(fā)率最高，分別為81.87%、78.44%，長黑暗處理散粉1 h 后萌發(fā)率最低。飽和狀態(tài)時兩種處理之間無明顯差異，但是長光照處理能夠促進提前散粉，增加授粉時長。兩種處理的散粉時間差異顯著，因此推測光照可能是促進雄蕊散粉的關(guān)鍵因素。

圖4 光照處理對甜瓜花粉活性和萌發(fā)率的影響

2.7 不同處理對授粉效果的影響

不同處理的果實著果率和結(jié)籽量如表3 所示，其中5 ℃和0 濕度處理的著果率和結(jié)籽量明顯低于其余處理，此結(jié)果與花粉活性和萌發(fā)率有相關(guān)性，低溫低濕的逆境環(huán)境可能對花器官雄蕊造成一定損傷，導(dǎo)致花粉活性及萌發(fā)能力降低，從而降低雌雄配子的結(jié)合概率，最終影響了坐果的成功率和果實結(jié)籽量。其余處理均全部坐果，果實結(jié)籽量與花粉萌發(fā)率變化趨勢相同，萌發(fā)率越高，其結(jié)籽量越多。根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計，未開放雄花外植體置于15 ℃、80%濕度、長光照條件下貯存，不僅能保證花粉活性與萌發(fā)率與自然開放時無差異，而且能夠極大限度提前散粉時間，增加授粉時長，提高育種效率。

表3 甜瓜雄花外植體不同貯存方式下著果率和結(jié)籽量

3 討論與結(jié)論

在花器官的生長發(fā)育過程中，花粉的育性也隨之變化，而育性與花粉特性息息相關(guān)。有研究表明，花粉活性和萌發(fā)率對于著果率和結(jié)籽率有著重要影響。陳源閩對茄子不同花齡的花粉進行探究，發(fā)現(xiàn)花粉活性越高，結(jié)籽率越高[6]；王少先等[7]和付超等[8]關(guān)于辣椒和白菜花粉的試驗也證實了同樣的結(jié)論。因此，花粉作為花器官中最為重要的物質(zhì)，其活性對于育種工作有著重要的意義。自1982年利用TTC 染色法對小麥花粉活性測定以來，目前該方法已經(jīng)應(yīng)用在擬南芥、煙草等模式植物及大量蔬菜作物的花粉研究中[9]。本試驗選擇TTC 染色法對甜瓜花粉活性進行測定，在甜瓜育種方面有一定的輔助作用，然而我們在試驗過程中發(fā)現(xiàn)染色測定的花粉活性與花粉萌發(fā)率有偏差，尤其是在雄花受到逆境脅迫后的散粉初期，對結(jié)籽量的差異規(guī)律進行分析，發(fā)現(xiàn)其與花粉萌發(fā)率有相關(guān)性，因此花粉萌發(fā)率有可能是鑒別雜交父本材料授粉效果的最佳指標(biāo)，這一結(jié)果在其他作物的花粉特性分析中也有類似的驗證[10-11]。對于不同的父本材料，其最佳離體培養(yǎng)時間與培養(yǎng)基類型均不同，因此需要根據(jù)試驗情況而定。

花粉特性研究是順利開展甜瓜人工輔助授粉的先前條件，而特性研究的前提是花粉的采集。在本研究中，我們測試了雄花自然開花條件下的花粉活性變化，發(fā)現(xiàn)花粉飽和時期，其活性最高可達(dá)94.9%，對雄花外植體離體散粉后的活性測試發(fā)現(xiàn)，最高可達(dá)93.32%，兩者無明顯差異。因此對于甜瓜，在開花前一天采集雄花貯存，待第二天散粉后進行授粉的方法可行，在雜交育種量大的情況下，該方法能夠大大提高工作效率。此外，在授粉過程中，可以使用冰袋、濕布等工具包裹花粉容器，盡量模擬活性最高時的環(huán)境條件，以保持花粉活性，延長授粉時間。植物的花器官對外界環(huán)境存在一定的耐受范圍，有研究顯示，番茄、辣椒、黃瓜等植物在生殖生長階段對外界環(huán)境十分敏感，在極高溫和極低溫環(huán)境脅迫下絨氈層降解，影響多糖代謝，從而導(dǎo)致花粉壁發(fā)育異常，最終表現(xiàn)為花粉失去活性[12]。在本試驗中，我們探究甜瓜雄花外植體貯存的最佳溫度、濕度、光照條件，結(jié)果顯示不同環(huán)境下，其花粉活性和散粉時間均有差異。這一結(jié)果可能是由于環(huán)境脅迫導(dǎo)致花粉出現(xiàn)了內(nèi)源物質(zhì)或多糖代謝速度變化等生理生化活動，從而造成花粉發(fā)育和萌發(fā)的差異。本試驗中，開花前一天的雄花外植體，置于溫度15 ℃、濕度80%、長光照條件下，可以促進雄蕊提前散粉，加快散粉速度，且花粉飽和時活性達(dá)到最高。對于甜瓜而言，不同材料對環(huán)境的反應(yīng)存在差異，花粉特性也與材料自身的遺傳特性相關(guān)，因此需進一步探究。