高 美，陳 茜，王 穎(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710000；通訊作者，E-mail:mei870601@126.com)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer， EC)是婦科臨床工作中常見的一類惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增高[1]。由于子宮內(nèi)膜癌發(fā)生早期多伴有明顯癥狀(不規(guī)則陰道流血)，因此容易較早確診。病變早期時(shí)接受手術(shù)治療一般預(yù)后較好，而晚期則需要接受放化療或內(nèi)分泌治療，預(yù)后差[2]。具體方案的選擇需要根據(jù)病理分期來決定。目前子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病原因尚不清楚，其發(fā)生、發(fā)展(遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)、復(fù)發(fā)等過程受基因位點(diǎn)突變、雌激素、代謝水平等的影響，是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程。既往研究證實(shí)，microRNAs作為腫瘤促進(jìn)/抑制因子，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控某些關(guān)鍵基因的表達(dá)參與腫瘤的形成[3]。其中，miR-421具有促癌作用，在前列腺癌、肺癌、骨肉瘤等組織中其表達(dá)水平均增高[4-6]，然而它在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚不清楚。SFRP4可競爭性結(jié)合Wnt受體，阻斷Wnt信號(hào)通路，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。但是有關(guān)SFRP4在子宮內(nèi)膜癌中作用的報(bào)道較少。因此，本研究綜合利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，探索性地研究SFRP4表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、患者預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)而明確miR-421是否參與靶向調(diào)控SFRP4表達(dá)而影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力，為明確子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與數(shù)據(jù)庫

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A購自上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；miR-421和SFRP4的引物由上海生工合成；miR-421類似物(mimic)、miR-421抑制劑(inhibitor)、陰性對照miR-NC及過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-SFRP4)由上海吉瑪公司構(gòu)建；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；mRNA和microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑，以及實(shí)時(shí)定量PCR試劑(TB Green Premix)購自日本TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司。

在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中利用“endometrial cancer”這一關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，Series types選擇“expression profiling by array”，Organisms選擇“homo sapiens”，找到其中的一條記錄“GSE106191”(包含64個(gè)子宮內(nèi)膜癌樣本和33個(gè)子宮內(nèi)膜良性增生樣本信息)，其中良性增生界定為單純性增生和復(fù)雜性增生，不包含不典型性增生，以|logFC|≥1.5，adj.P<0.05為界，通過“Analyze with GEO2R”分析子宮內(nèi)膜癌組織與良性增生組織的差異表達(dá)基因。利用Targetscan在線軟件預(yù)測可能與SFRP4相結(jié)合的microRNA，Gene symbol輸入“SFRP4”，Species輸入“Human”，得到預(yù)測結(jié)果。

獲取UCSC Xena網(wǎng)站(https://xena.ucsc.edu/)上“GDC TCGA Endometrioid Cancer(UCEC)”數(shù)據(jù)集中原發(fā)腫瘤患者的臨床信息(總生存期及腫瘤臨床分期)和SFRP4基因表達(dá)數(shù)據(jù)，分析SFRP4表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌患者總生存期及腫瘤分級的臨床意義。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEC-1A細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃恒溫敷箱(其中CO2濃度為5%)中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增長至50%～70%時(shí)進(jìn)行傳代和其他處理。

1.2.2 細(xì)胞中SFRP4 mRNA和miR-421表達(dá)水平的測定 使用TRIzol試劑收集細(xì)胞并提取總RNA。具體方法為：溶解細(xì)胞的1 ml TRIzol中加入200 μl的三氯甲烷，混勻后靜置分層，12 500 r/min離心15 min后取上清，加入等量異丙醇，混勻后靜置15 min，再次離心(12 000 r/min)10 min后棄上清，留沉淀。加入800 μl的75%乙醇，再次離心得到的沉淀即為總RNA。加入20 μl的DEPC水溶解RNA，并在核酸蛋白檢測儀上測定其OD值，確保OD260/OD280的值在1.9～2.1之間。然后分別使用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑和microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑對提取得到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作遵循試劑說明書。cDNA中按比例加入適量引物、TB Green和ROX dye Ⅱ，并進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為: 95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。分別以Actb和U6為內(nèi)參，計(jì)算相應(yīng)mRNA和microRNA的表達(dá)變化情況(2-ΔΔCt法)。引物的具體序列見表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與細(xì)胞活力檢測 將HEC-1A細(xì)胞按照每孔1×104的密度種于96孔板(培養(yǎng)基)上生長。待密度達(dá)到60%～70%時(shí)，按Lipofectamine 2000的用法說明，分別轉(zhuǎn)染miR-421類似物(miR-421 mimics組)、miR-421抑制劑(miR-421 inhibitor組)和陰性對照試劑(miR-NC組)，轉(zhuǎn)染24，48，72 h后，加入10 μl的CCK-8溶液，于37 ℃繼續(xù)孵育4 h，然后利用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度以間接評估細(xì)胞活力。

類似地，將HEC-1A細(xì)胞分為4組，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染陰性對照試劑(miR-NC組)、miR-421類似物(miR-421 mimics組)、miR-421類似物和陰性對照質(zhì)粒(miR-421 mimics+vector組)、miR-421類似物和過表達(dá)質(zhì)粒(miR-421 mimics+pcDNA-SFRP4)，在轉(zhuǎn)染24，48，72 h后，加入10 μl的CCK-8溶液，于37 ℃繼續(xù)孵育4 h，然后利用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度以間接評估細(xì)胞活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中涉及的計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)滿足方差齊性的要求，因此兩組間的比較采用非配對Student’st檢驗(yàn)(two-tailed)，多組之間的比較采用單因素方差分析，并用Tukey’s多重比較做兩兩之間的差異分析。

計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。生存分析采用Log rank檢驗(yàn)、Kaplan-Meier生存曲線模型。使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFRP4基因在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)降低

通過microarray分析，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)差異表達(dá)基因，分別是：SFRP4、OGN、OSR2、PEG3和IGF1，其中SFRP4的差異表達(dá)變化倍數(shù)最大(見圖1和表2)。結(jié)果顯示，SFRP4的表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌中明顯降低(8.27±0.45vs5.87±0.31，P<0.000 1，見圖2)。

圖1 子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜良性增生樣本間的差異表達(dá)基因Figure 1 Differentially expressed genes between endometrial cancer and benign hyperplasia

與良性增生組織相比，****P<0.000 1圖2 SFRP4基因在子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜良性增生樣本中的表達(dá)Figure 2 The gene expression of SFRP4 in endometrial cancer and benign hyperplasia

表2 子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜良性增生樣本間的差異表達(dá)基因Table 2 The differentially expressed genes between endometrial cancer and benign hyperplasia

2.2 SFRP4基因表達(dá)影響子宮內(nèi)膜癌患者總生存期

以UCSC Xena數(shù)據(jù)庫中543例原發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者的臨床資料和測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SFRP4低表達(dá)(后1/3)組的總生存期較SFRP4高表達(dá)(前1/3)組顯著降低(P<0.01，見圖3)。而SFRP4的表達(dá)水平在腫瘤不同臨床分期中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，見表3)。

圖3 SFRP4表達(dá)對子宮內(nèi)膜癌患者總生存期的影響Figure 3 Effect of SFRP4 expression on overall survival of EC patients

表3 子宮內(nèi)膜癌組織中SFRP4表達(dá)與腫瘤臨床分期間的關(guān)系Table 3 Relationship between SFRP4 expression in EC tissues and clinical stages

2.3 miR-421靶向作用于SFRP4，降低其表達(dá)水平

使用Targetscan軟件預(yù)測可能作用于SFRP4的microRNAs，結(jié)果顯示，SFRP4 mRNA的3′-UTR中含有與miR-421相互補(bǔ)的核苷酸序列(見圖4)。HEC-1A細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-421類似物和miR-421抑制劑后，miR-421的表達(dá)水平分別明顯增高和降低(P<0.000 1，見圖5)。RT-PCR結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-421類似物組SFRP4 mRNA水平顯著降低(P<0.01)，相反地，miR-421抑制劑組SFRP4 mRNA水平明顯增高(P<0.001，見圖6)。

圖4 SFRP4和miR-421的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測Figure 4 Prediction of binding sites between SFRP4 and miR-421

與miR-NC組相比，****P<0.000 1圖5 miR-421類似物、抑制劑對HEC-1A細(xì)胞中miR-421表達(dá)水平的影響Figure 5 Effect of miR-421 mimics and inhibitor on miR-421 expression in HEC-1A cells

與miR-NC組相比，**P<0.01，***P<0.001圖6 miR-421類似物、抑制劑對HEC-1A細(xì)胞中SFRP4 mRNA表達(dá)水平的影響Figure 6 Effect of miR-421 mimics and inhibitor on SFRP4 mRNA expression in HEC-1A cells

2.4 miR-421促進(jìn)HEC-1A細(xì)胞的增殖

與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-421類似物后，HEC-1A細(xì)胞在24，48，72 h時(shí)的增殖能力明顯增強(qiáng)，相反地，轉(zhuǎn)染miR-421抑制劑后，HEC-1A細(xì)胞在上述檢測時(shí)間點(diǎn)的增殖能力顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖7)。

與同時(shí)點(diǎn)miR-NC組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖7 miR-421類似物、抑制劑對HEC-1A細(xì)胞增殖的影響Figure 7 Effect of miR-421 mimics and inhibitor on HEC-1A cell proliferation

2.5 SFRP4蛋白過表達(dá)可有效回轉(zhuǎn)miR-421對HEC-1A細(xì)胞的促增殖作用

盡管轉(zhuǎn)染miR-421類似物后，HEC-1A細(xì)胞在24，48，72 h時(shí)的增殖能力較miR-NC組明顯增強(qiáng)，然而，與miR-421+vector組相比，miR-421+pcDNA-SFRP4組HEC-1A細(xì)胞在24，48，72 h時(shí)的增殖能力顯著降低(P<0.05，見圖8)。

與同時(shí)點(diǎn)的miR-NC組相比，*P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)的miR-421 mimics+vector組相比，#P<0.05，##P<0.01圖8 過表達(dá)SFRP4蛋白對HEC-1A細(xì)胞增殖的影響Figure 8 Effect of SFRP4 overexpression on HEC-1A cell proliferation

3 討論

近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，然而其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)，研發(fā)新型化療藥物無疑是值得探索的一種思路。本研究利用生物信息學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)初步探索了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制，創(chuàng)新性地提出了miR-421和SFRP4兩個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，具有重要意義。

研究表明，microRNAs在各類型腫瘤中通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因，發(fā)揮抑癌或促癌作用，其表達(dá)水平變化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展(擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移)及結(jié)局密切相關(guān)。其中，miR-421在前列腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌等眾多癌癥中表達(dá)水平增高，對腫瘤細(xì)胞增殖性、侵襲性、化療藥物抗性能力起到關(guān)鍵調(diào)控作用[8-10]。盡管多項(xiàng)研究證實(shí)了miR-421是一種促癌因子，然而它在子宮內(nèi)膜癌中的作用卻鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，在離體培養(yǎng)的HEC-1A細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染miR-421類似物顯著促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖水平；相反地，轉(zhuǎn)染miR-421抑制劑則抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，提示miR-421在子宮內(nèi)膜癌中可能發(fā)揮促癌作用。

分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRPs)包含5種分泌型糖蛋白，分別為SFRP1，SFRP2，SFRP3，SFRP4和SFRP5，其結(jié)構(gòu)上包含1個(gè)富含半胱氨酸的卷曲相關(guān)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)netrin模塊[11]。研究表明，SFRPs通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮抑癌作用[12]。其中，SFRP4是Wnt的拮抗劑，能夠通過結(jié)合Wnt受體和frizzled受體，阻斷其信號(hào)通路。一項(xiàng)研究表明，SFRP4介導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞的凋亡，抑制癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。Wu等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的SFRP4表達(dá)水平較正常人明顯降低。在本研究中，通過對GEO數(shù)據(jù)庫中1例基因芯片結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織中SFRP4的表達(dá)水平較良性增生組織明顯降低，與上述研究結(jié)果一致。此外，差異基因分析結(jié)果提示OGN、OSR2、PEG3和IGF1的表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌中也明顯降低。趙萌等[15]發(fā)現(xiàn)PEG3蛋白在高、中、低分化子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)較正常子宮內(nèi)膜組織明顯降低，與芯片結(jié)果一致，側(cè)面印證了數(shù)據(jù)的可靠性。通過對SFRP4表達(dá)水平與患者腫瘤臨床分期及總生存期的分析發(fā)現(xiàn)，SFRP4表達(dá)水平低者總生存期顯著降低，而與腫瘤臨床分期無明確關(guān)系，因此SFRP4表達(dá)量可作為評價(jià)子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

microRNAs作為一類功能性非編碼RNA，通過靶向結(jié)合特定mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)，促進(jìn)其降解，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的生物學(xué)功能。在本研究中，利用Targetscan軟件預(yù)測到miR-421可靶向結(jié)合SFRP4 mRNA 3′-UTR處24～51位的部分堿基。進(jìn)一步通過在HEC-1A細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-421類似物和miR-421抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-421可以抑制SFRP4 mRNA的表達(dá)。為進(jìn)一步證實(shí)miR-421是通過靶向調(diào)節(jié)SFRP4表達(dá)來影響腫瘤細(xì)胞的增殖能力，我們在轉(zhuǎn)染miR-421類似物的細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和SFRP4過表達(dá)質(zhì)粒，再次觀察腫瘤細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染SFRP4過表達(dá)質(zhì)粒后，miR-421促腫瘤細(xì)胞增殖的作用明顯減弱，說明SFRP4可能是miR-421促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的重要分子機(jī)制。

盡管本研究在細(xì)胞層面進(jìn)行了初步驗(yàn)證，然而實(shí)驗(yàn)采用的方法比較簡單，證據(jù)相對單一，關(guān)于miR-421靶向抑制SFRP4，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的科學(xué)猜想尚需進(jìn)一步的功能學(xué)驗(yàn)證。下一步我們計(jì)劃開展劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步探究miR-421和SFRP4對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移能力的影響，隨后利用SFRP4敲除和高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型開展荷瘤實(shí)驗(yàn)，在動(dòng)物層面驗(yàn)證miR-421和SFRP4對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的影響。

綜上所述，miR-421靶向抑制SFRP4的表達(dá)，是其促子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖作用的重要分子基礎(chǔ)，本研究的結(jié)果將為以后子宮內(nèi)膜癌的診治及藥物研發(fā)提供新的思路和理論依據(jù)。