金文琪，郭修田，朱 影，李 鵬，李小嘉(上海市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，上海 200071;通訊作者，E-mail:guoxiutian@126.com)

肛門括約肌損傷會造成機體對液體、固體及氣體的控制能力降低或喪失，導(dǎo)致排便能力失調(diào)[1]。大便失禁的原因與神經(jīng)元損傷及肌源性損傷相關(guān)，其中肛門括約肌損傷是導(dǎo)致其形成的最主要的原因，給患者帶來較大痛苦，顯著降低患者生活質(zhì)量[2]。肛門括約肌損傷的形成與多種因素存在相關(guān)性，其中Wnt信號通路表達異常是其中之一，Wnt在動物胚胎形成、器官形成及組織再生中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。在先天性肛門直腸畸形中存在Wnt5a功能喪失，可影響生殖結(jié)節(jié)的形成，原因可能與β-catenin表達降低相關(guān)[3]。Wnt3a作為Wnt/β-catenin信號通路中經(jīng)典調(diào)控途徑的代表，在直腸畸形大鼠中表達顯著低于健康大鼠，提示W(wǎng)nt3a表達缺失可能加快疾病發(fā)生發(fā)展[4]。目前，對于大便失禁的治療方法多集中在飲食、藥物、盆底神經(jīng)刺激及手術(shù)治療等，但是復(fù)發(fā)率仍然較高，因此探尋一種新的治療方法對于提高臨床療效具有重要意義。

溫和灸是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)理療手段，是通過將點燃的藥物放置到人體肌肉表層，熱量輸入引起機體自我調(diào)節(jié)，達到疏通臟腑，平衡陰陽的作用。溫和灸可提高大鼠肛瘺術(shù)后感染性創(chuàng)面局部微循環(huán)，可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達而加快創(chuàng)面愈合[5]。目前，間充質(zhì)干細(xì)胞對肛門括約肌的修復(fù)引起了肛腸學(xué)者的重視。動物模型證實，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone manrrow mesenchymal stem cells，BMSCs)注射可以促進損傷大鼠肛門括約肌修復(fù)，改善括約肌收縮功能[6]。已有研究表明，溫和灸聯(lián)合BMSCs可以改善肛門括約肌損傷，可為臨床肌源性大便失禁的治療提供參考方向[7]。但是能否通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路而發(fā)揮抑制肛門括約肌損傷的作用目前尚無定論，本文觀察溫和灸聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠肛門括約肌損傷修復(fù)及Wnt信號通路的影響，旨在為相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠

54只6～8周齡雌性及2只雄性SD大鼠，SPF級，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2019-003l，體質(zhì)量200～250 g，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度22 ℃，相對濕度50%～65%，自由飲水及攝食，適應(yīng)周圍環(huán)境7 d后進行后續(xù)實驗。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)(2021-0020)。

1.2 主要儀器與試劑

IX83倒置顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司)；RM2235石蠟切片機(德國Leica公司)；FA1204B電子分析天平(上海天美天平儀器有限公司)；李時珍蘄艾條(1.8 cm×20 cm，佛山市艾傳醫(yī)療器械有限公司)；-80 ℃低溫冰箱(上海賽弗生物科技有限公司)。Wnt3a、Wnt5a抗體(上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司)；β-連環(huán)蛋白(β-catenin)單抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；蘇木素-伊紅試劑盒(南京生航生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 分組及處理

參考Zusthi模型[8]建立大鼠肛門括約肌損傷模型，對于大鼠均腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，在解剖顯微鏡下逐層分離大鼠腹腔，縱向切開大鼠括約肌，每只大鼠切除部位一致，術(shù)后壓迫止血，0.5 mg/kg的布比卡因鎮(zhèn)痛。建模成功標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[8]，大便排便次數(shù)增多，質(zhì)稀不成形，甚至大便失禁，證實造模成功。

50只大鼠被隨機分為假手術(shù)組、模型組、溫和灸組、BMSCs組、溫和灸+BMSCs組，每組10只。溫和灸組：將點燃的蘄艾條放置于距大鼠肛門約2 cm處，溫和灸大鼠肛門局部創(chuàng)面，治療15 min，從造模后第1日開始，每日1次，連續(xù)7 d。BMSC組：在大鼠括約肌損傷處及缺損兩側(cè)斷端邊緣直接注射約含1×107個BMSCs，共0.3 ml，每個部位0.1 ml。溫和灸+BMSC組：在大鼠括約肌損傷處基底部及兩側(cè)斷端各注射0.1 ml PBS(共0.3 ml PBS，含107個BMSCs)，然后將點燃的艾條直對干細(xì)胞注射處(即括約肌損傷處)進行治療，時間15 min，每日1次，連續(xù)7 d。模型組注射部位同BMSC組，注射等體積的生理鹽水；假手術(shù)組不做處理。

1.4 大鼠BMSCs的分離及培養(yǎng)

4只雌性大鼠及2只雄性大鼠，按照2 ∶1的比例合籠后，妊娠成功，飼養(yǎng)小鼠體質(zhì)量50 g時，提取雄性小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞。將雄性小鼠處死后取股骨，采用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗干凈，PBS再次沖洗2次，采用細(xì)胞濾膜過濾細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶1 ml消化，采用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，加入1 ml DMEM高糖完全培養(yǎng)基(含10% FBS)中吹打細(xì)胞20次。細(xì)胞按照1 ∶2傳代，采用200g離心細(xì)胞懸液，細(xì)胞沉淀物采用0.01 mol/L PBS重懸，采用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞。

1.5 大鼠肛門括約肌功能檢測

分別于治療結(jié)束后7，14，21 d進行靜息壓、收縮壓與肌電振幅、肌電頻率檢測。采用多道信息采集處理系統(tǒng)的不同檢測模塊，記錄并分析不同時間節(jié)點各組的功能指標(biāo)。在大鼠腹腔注射麻醉后，將1個特制的球囊潤滑后完全放入大鼠肛內(nèi)以進行括約肌壓力檢測，球囊插入深度為球囊淹沒后0.5 cm，球囊連接注射器與采集處理系統(tǒng)，每次注水0.8 ml擴張球囊以檢測肛壓。選取壓力通道，設(shè)置參數(shù)后每只大鼠檢測時間為波形穩(wěn)定后15 min。保存所有文件，分別選取穩(wěn)定波峰及基線值記錄為收縮壓與靜息壓。檢測肌電，將兩只30號US53153型同軸電針分別插在大鼠肛門3、9點位，深度約0.4 cm，電極夾連接采集系統(tǒng)，選取生物肌電模式進行檢測。設(shè)置參數(shù)后每只大鼠檢測時間為波形穩(wěn)定后15 min。保存所有采集文件，為了定量尿道括約肌肌電圖(arethral sphincter electromyography，US-EMG)動作電位的振幅和頻率，在每個節(jié)點的檢測波形中隨機計算平均值，5 s一次，連續(xù)5次，并設(shè)定一個高于噪音但低于動作電位的臨界值以定量動作電位的頻率。統(tǒng)計波形穿過此閾值的動作電位的振幅和頻率。

1.6 組織分離及蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色

腹腔麻醉頸部脫臼處死，消毒肛周后迅速剝離肛門括約肌(距離肛緣0.5～1 cm)，浸泡于4%聚四氟乙烯中，4 ℃過夜固定，脫鈣劑浸泡1周左右，10%的甲醛溶液中，固定過夜，自來水沖洗，浸泡于14%的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA)溶液中脫鈣，逐級脫水后石蠟包埋，4 μm切片。組織切片放入37 ℃復(fù)溫15 min，二苯甲脫蠟后按照100%→95%→85%及75%乙醇進行逐級脫水，蘇木精染色10 min，1%鹽酸處理，伊紅復(fù)染，100%→95%→85%及75%乙醇脫水，封片。光鏡觀察組織形態(tài)。

1.7 免疫組化檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)陽性細(xì)胞數(shù)

肛門括約肌組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水后，采用PBS沖洗3次，間隔5 min，37 ℃用羊血清封閉60 min，加入α-SMA(1 ∶500)一抗，4 ℃孵育24 h，加入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)，孵育30 min，沖洗后加入50 μl的鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，二氨基聯(lián)苯胺顯色，沖洗，終止顯色，透明、封片，選擇選取5個非重疊視野，計算陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。

1.8 免疫印跡檢測Wnt3a、Wnt5a、β-catenin蛋白水平

肛門括約肌組織采用PBS沖洗后切碎，采用細(xì)胞裂解液，按照10 000g離心10 min，4，4’-二羧-2，2’-二喹啉(bicinchoninc acid procedure，BCA)法檢測蛋白水平，加入20 μg蛋白樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印緩沖液低溫預(yù)冷，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入脫脂奶粉，封閉60 min。加入一抗Wnt3a(1 ∶1 000)、Wnt5a(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶500)及GAPDH(1 ∶2 500)，磷酸鹽溶液沖洗，加入抗兔IgG二抗(1 ∶2 500)，增強型化學(xué)發(fā)光(Enhanced ChemiLuminescence，ECL)系統(tǒng)JY-Clear分析蛋白值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肛管收縮壓和靜息壓比較

與假手術(shù)組相比，模型組治療7，14，21 d時肛管收縮壓和靜息壓均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，溫和灸組治療7，14，21 d時肛管收縮壓與靜息壓升高(P<0.05)；溫和灸與BMSCs組治療7，14，21 d時肛管收縮壓和靜息壓比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與BMSCs組相比，溫和灸+BMSCs組治療7，14，21 d時的肛管收縮壓和靜息壓均升高(P<0.05，見表1)。肛管收縮壓及肛管靜息壓不同時間點組間與時間存在交互作用(P<0.05，見表1)。

表1 各組大鼠不同時間點鼠肛管收縮壓和靜息壓比較 (mmHg)Table 1 Comparison of anal systolic pressure and resting pressure of rats at different time points between groups (mmHg)

2.2 大鼠肌電振幅及肌電頻率

與假手術(shù)組相比，模型組治療7，14，21 d時肌電振幅及肌電頻率均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，溫和灸組治療7，14，21 d時肌電振幅及肌電頻率升高(P<0.05)；溫和灸與BMSCs組治療7，14，21 d時的肌電振幅及肌電頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與BMSCs組相比，溫和灸+BMSCs組治療7，14，21 d時肌電振幅及肌電頻率均升高(P>0.05，見表2)。肌電振幅及肌電頻率不同時間點組間與時間存在交互作用(P<0.05，見表2)。

表2 各組大鼠不同時間點肌電振幅及肌電頻率的比較Table 2 Comparison of EMG amplitude and EMG frequency at different time points between groups

2.3 HE染色觀察肛門括約肌病理形態(tài)

假手術(shù)組大鼠肛門括約肌肌纖維組織排列整齊，無炎癥浸潤；模型組大鼠肌纖維組織結(jié)構(gòu)紊亂，間隙增大，炎癥浸潤顯著且括約肌出現(xiàn)一定程度萎縮；與模型組相比，溫和灸組及BMSCs組大鼠肛門括約肌肌纖維紊亂改善，間隙減小；溫和灸+BMSCs組肌肉纖維結(jié)構(gòu)與假手術(shù)組相似(見圖1)。

圖1 HE染色觀察大鼠肛門括約肌病理形態(tài) (×200)Figure 1 Pathological morphology of anal sphincter in rats by HE staining (×200)

2.4 免疫組化檢測肛門括約肌組織中α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)

假手術(shù)組、模型組、溫和灸組、BMSCs組及溫和灸+BMSCs組的α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)分別為(70.25±8.20)個、(24.23±1.33)個、(46.33±3.61)個、(47.20±3.55)個及(62.56±5.56)個，α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。與假手術(shù)組相比，模型組α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)降低(t=13.570，P<0.05)；與模型組相比，溫和灸組α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)升高(t=14.070，P<0.05)；溫和灸與BMSCs組α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.905，P=0.387)；與BMSCs組相比，溫和灸+BMSCs組在α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)升高(t=5.332，P=0.003)。

圖2 溫和灸及BMSCs處理對大鼠肛門括約肌組織中α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)的影響 (×200)Figure 2 Effect of mild moxibustion and BMSCs on α-SMA positive cells in anal sphincter tissue in rats (×200)

2.5 免疫印跡檢測各組大鼠肛門括約肌組織Wnt3a、Wnt5a、β-catenin蛋白水平比較

與假手術(shù)組相比，模型組Wnt3a、Wnt5a、β-catenin表達降低(t分別為7.177，15.280，18.130，均P<0.05)；與模型組相比，溫和灸組Wnt3a、Wnt5a、β-catenin表達升高(t分別為7.449，11.550，6.111，均P<0.05)；溫和灸與BMSCs組Wnt3a、Wnt5a、β-catenin表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為0.597，0.453，0.294，均P>0.05)；與BMSCs組相比，溫和灸+BMSCs組Wnt3a、Wnt5a、β-catenin表達升高(t分別為5.400，.289，3.408，P<0.05，見表3、圖3)。

表3 各組大鼠肛門括約肌組織Wnt3a、Wnt5a、β-catenin蛋白水平Table 3 Protein levels of Wnt3a， Wnt5a and β-catenin in anal sphincter tissues of rats in each group

圖3 溫和灸及BMSCs處理因素對大鼠肛門括約肌組織中Wnt3a、Wnt5a、β-catenin蛋白表達的影響Figure 3 Effects of mild moxibustion and BMSCs on Wnt3a， Wnt5a β-Catenin protein expression

3 討論

肛門括約肌主要受植物神經(jīng)支配，可維持肛管靜息壓，當(dāng)靜息壓大于腸道內(nèi)壓力時可控制腸內(nèi)容物的排除，達到維持肛門自制的作用[9]。肛門括約肌損傷時靜息壓及收縮壓均顯著降低，部分患者括約肌長度縮短可導(dǎo)致直腸肛管抑制反射消失，導(dǎo)致大便失禁。括約肌肌電活性(包括振幅和頻率)可作為反映腸道動力的客觀指標(biāo)，大便失禁大鼠肌電振幅及肌電頻率均降低，表明大鼠腸道存在節(jié)律紊亂，產(chǎn)生原因可能在于腸道靜息壓及收縮壓降低，導(dǎo)致腸道推進行收縮頻率改變，影響腸道收縮能力，降低肌肉收縮，腸道損傷加重，導(dǎo)致大便失禁進展[10]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，溫和灸組、BMSCs組及溫和灸+BMSCs組大鼠肛門括約肌收縮壓、靜息壓、肌電振幅及肌電頻率均提高，以溫和灸+BMSCs組效果最佳，說明溫和灸聯(lián)合BMSCs治療可提高括約肌功能而對大便失禁發(fā)揮治療作用。中醫(yī)學(xué)將大便失禁歸屬為“滑泄”或“大便滑脫”或“遺矢”范疇，發(fā)病機制多數(shù)與“脾腎虧虛”“氣虛下陷”，故應(yīng)該采用扶正祛邪、溫通氣血的溫和灸可補虛化瘀、改善局部血液循環(huán)達到疾病治療作用[11]。溫和灸衍生于灸法，主要是通過溫?zé)崛岷偷拇碳ち堪l(fā)揮散寒通痹，補中益氣，溫陽固脫，升陽舉陷的作用。臨床研究表明，溫和灸可以通過盆神經(jīng)興奮相關(guān)神經(jīng)，促進腰骶部低級中樞與大腦皮層高級中樞建立良好的神經(jīng)反饋通路，調(diào)節(jié)盆底肌的運動和肌力，可用于括約肌損傷的大便失禁患者臨床治療中，臨床療效較好[12]。近些年再生醫(yī)學(xué)快速發(fā)展，生物學(xué)及工程學(xué)促使功能丟失的組織或器官重新獲得功能，其中BMSCs是再生醫(yī)學(xué)主要種子細(xì)胞，它具有多向分化潛能、自我更新能力、來源豐富、免疫原性低等特征，在衰老及組織損傷修復(fù)方面的應(yīng)用十分廣泛[13]。研究表明，在女性壓力性尿失禁患者中采用BMSCs移植可修復(fù)受損的括約肌，增加括約肌肌張力從而提高尿控能力[14]。但經(jīng)靜脈注射移植的干細(xì)胞可能因外周血不能達到受損部位，故如何誘導(dǎo)其向特定部位遷移成為研究重點。本研究通過于括約肌損傷部分采用BMSCs注射后采用溫和灸干預(yù)可加快BMSCs在損傷處的定植，而發(fā)揮改善損傷的作用。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，溫和灸組、BMSCs組及溫和灸+BMSCs組大鼠α-SMA陽性表達升高，以溫和灸+BMSCs組效果最佳，說明聯(lián)合治療可以顯著提高α-SMA表達進而改善括約肌損傷進而改善大便失禁。α-SMA是肌動蛋白之一，主要發(fā)揮肌肉收縮的作用，是肛門括約肌收縮成分肌絲的重要組成，其表達升高或降低可影響括約肌收縮及順應(yīng)性[15]。在括約肌損傷大鼠中α-SMA表達降低，可導(dǎo)致括約肌系統(tǒng)功能異常，發(fā)生盆底肌群紊亂，功能不良，從而造成大便失禁。以往的研究過程中認(rèn)為BMSCs可以誘導(dǎo)分化為成纖維及肌成纖維細(xì)胞，而α-SMA則是肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物，證實BMSCs可以通過上調(diào)α-SMA表達而預(yù)防纖維萎縮[16]。在壓力性尿失禁相關(guān)研究中，上調(diào)BMSCs后可以顯著升高平滑肌標(biāo)志性蛋白α-SMA水平，證實了BMSCs可以向膀胱平滑肌細(xì)胞分化，這與組蛋白乙酰化相關(guān)[17]。溫和灸通過將熱量沿著經(jīng)絡(luò)傳到損傷部分，可提高肌纖維的表達，α-SMA升高，增加大鼠環(huán)形肛門括約肌組織的愈合。在BMSCs注射后溫和灸以其溫?zé)崛岷偷拇碳ち扛纳茡p傷，提高BMSCs細(xì)胞定植率，加之溫和灸自身的溫經(jīng)散寒，化瘀散結(jié)的效果，共同發(fā)揮損傷創(chuàng)面的修復(fù)作用。

Wnt是一種進化保守的信號通路，信號通路包含Wnt3a、Wnt5a、β-catenin等組成。在損傷的腸上皮中認(rèn)為激活Wnt/β-catenin信號通路可以提高輻射損傷后小鼠腸道肝細(xì)胞的存活，說明Wnt/β-catenin與腸道疾病存在關(guān)聯(lián)。在先天性肛門直腸畸形患兒Wnt5a活性喪失會影響生殖結(jié)節(jié)的形成，導(dǎo)致其衍生物發(fā)育不全[18]。在正常大鼠直腸末端發(fā)現(xiàn)Wnt3a成強陽性表達，但是在肛門直腸畸形大鼠中表達降低，其缺失會抑制直腸神經(jīng)肌肉及盆底發(fā)育，導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展[19]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，溫和灸組、BMSCs組及溫和灸+BMSCs組大鼠Wnt3a、Wnt5a、β-catenin表達升高，以溫和灸+BMSCs組效果最佳，說明聯(lián)合治療可以顯著提高Wnt3a、Wnt5a、β-catenin進而修復(fù)腸道損傷。但是目前在肛門括約肌損傷中關(guān)于溫和灸、BMSCs對Wnt信號通路研究暫無文獻，但是在其他疾病中已有證實。例如在脊髓損傷大鼠中溫針灸頭部腧穴可明顯上調(diào)大鼠脊髓和端腦中Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵蛋白Wnt3a、β-catenin的表達，可以顯著改善脊髓損傷[20]。在成骨細(xì)胞研究中認(rèn)為辛伐他汀可以加快BMSCs細(xì)胞分化而增加成骨細(xì)胞活性，與激活Wnt3a表達相關(guān)[21]。本文研究認(rèn)為溫和灸可以加快BMSCs活性而改善肛門括約肌損傷，機制與上調(diào)Wnt表達相關(guān)，但是具體研究機制還需要進一步探討。

本研究存在一定不足，時間及經(jīng)費受限未進行更多的實驗研究，可能對結(jié)果存在一定影響，今后應(yīng)增加樣本量，充實實驗內(nèi)容，為大便失禁的相關(guān)研究提供實驗依據(jù)。

綜上所述，溫和灸聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以修復(fù)肛門括約肌損傷，通過增加肛管收縮壓、靜息壓、肌電振幅及肌電頻率而提高括約肌功能，增加α-SMA表達，預(yù)防纖維萎縮，其機制可能與激活Wnt信號通路相關(guān)。