杜加亮，武 剛，梅玉婷，于傳飛，王 蘭(中國食品藥品檢定研究院單克隆抗體產(chǎn)品室，衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定及標準化重點實驗室，國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評價重點實驗室，北京 102629；共同第一作者；通訊作者，E-mail:wanglan@nifdc.org.cn)

采用高蛋白濃度(≥100 mg/ml)配制的治療性抗體藥物約占美國食品藥品管理局(FDA)批準的全部治療性抗體藥物的三分之一(34/103)，而且2015年以后批準的數(shù)量占76%(26/34)，最高濃度為200 mg/ml，主要為皮下給藥途徑[1]?？贵w藥物的高濃度制劑將是治療性抗體制劑發(fā)展的未來趨勢[2]。但是，高濃度抗體藥物的開發(fā)也面臨著許多挑戰(zhàn)，其中輔料配方可以影響藥物的穩(wěn)定性(聚體、氧化等)[3]。研究表明，使用包含聚山梨醇酯、組氨酸和蔗糖的平臺制劑以加速抗體藥物的高濃度制劑開發(fā)可能是合理的[1]。在FDA批準的34種治療性抗體高濃度制劑的輔料中，聚山梨酯(94%)、組氨酸(82%)、蔗糖(48%)是使用頻率排名前三的輔料[1，4]。因此，在高濃度抗體藥物放行時，要對輔料進行相應的質(zhì)量控制。

聚山梨酯是最常用的表面活性劑，而組氨酸有助于聚山梨酯顆粒的穩(wěn)定性以及維持治療性蛋白制品的pH值[5-7]。組氨酸因不含生色基團，無法采用常規(guī)的紫外檢測器直接檢測，所以需要通過衍生劑將氨基酸轉(zhuǎn)化為具有較強紫外或熒光吸收的衍生物[8]才能被檢測到。本研究擬采用柱前衍生反相高效液相色譜法(reverse-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)建立組氨酸含量測定方法并進行全面的方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

單抗藥物樣品mAb-1(蛋白濃度為4.5 mg/ml)為含有已知濃度L-組氨酸(理論濃度為3.10 mg/ml)、蔗糖和吐溫-20為輔料的單抗樣品，由本實驗室保存。L-組氨酸購自美國Sigma公司，符合英國藥典、歐洲藥典、美國藥典/國家處方集和日本藥典標準，批號為H6034。蔗糖購自德國Millipore公司(貨號：100892)，吐溫-20購自德國Fluka公司(貨號：44112)。色譜級乙腈購自美國Sigma公司(貨號：34851)。AccQTag洗脫劑A(貨號：WAT052890)和AccQ Fluor試劑盒(貨號：WAT052880)購自美國waters公司。

1.2 高效液相色譜系統(tǒng)及參數(shù)

使用配有紫外檢測器和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的Waters HPLC系統(tǒng)Alliance e2695和氨基酸色譜柱(AccQ Tag，粒徑4 μm，3.9 mm×150 mm)。色譜條件如下：流動相A為用水1 ∶10(V/V)稀釋的AccQTag洗脫劑A，流動相B為含60%乙腈的水溶液。紫外檢測器檢測波長為254 nm，進樣體積為5 μl，柱溫為25 ℃，樣品室溫度5 ℃，流速為1.0 ml/min，洗脫時間為35 min，洗脫方式為梯度洗脫(0～26 min，4%→7%流動相B；26～26.01 min，7%→100%流動相B；26.01～30 min，100%→4%流動相B；30～35 min，4%流動相B)。

1.3 樣品制備

用超純水配制兩份單獨的濃度為0.03 mg/ml的組氨酸溶液，作為組氨酸標準溶液1和2(His_STD-1和His_STD-2)，其中His_STD_1用于樣品中組氨酸濃度計算和系統(tǒng)適應性計算，His_STD_2用做質(zhì)控樣品。空白樣品為超純水。專屬性樣品為配方緩沖液1(含5%蔗糖、0.01%吐溫20、20 mmol/L組氨酸，pH 6.0)和不含組氨酸的配方緩沖液(含5%蔗糖、0.01%吐溫20，pH 6.0)。使用不含組氨酸的配方緩沖液(也用作加標緩沖液1)和含組氨酸的配方緩沖液2(含15.5 mg/ml組氨酸、5%蔗糖、0.01%吐溫20，pH 6.0)分別按照9 ∶1，8 ∶2，7 ∶3和6 ∶4的體積比例配制組氨酸理論濃度分別為1.55，3.10，4.65，6.21 mg/ml的加標緩沖液2～5，然后分別混合1 400 μl mAb-1抗體溶液和600 μl加標緩沖液1～5，配制成組氨酸理論濃度分別為2.170，2.635，3.100，3.565，4.033 mg/ml的70%，85%，100%，115%和130%的加標溶液1～5(見表1)，用于準確性、線性和檢測范圍的驗證。

表1 加標溶液的制備Table 1 Preparation of the spiking solutions

1.4 樣品進樣與數(shù)據(jù)分析

首先用超純水平衡系統(tǒng)，然后再依次按以下順序進樣：組氨酸標準品1(6次)、組氨酸標準品2(2次)、樣品(2次)、組氨酸標準品1(1次)。組氨酸標準品的括號進樣(序列前6次和序列后1次)用于評價系統(tǒng)適應性，且進樣次數(shù)足夠用于統(tǒng)計學分析。樣品重復進樣2次取平均值用于計算樣品中組氨酸濃度。選取色譜圖中的組氨酸做積分運算，使用組氨酸標準品1的濃度與峰面積繪制經(jīng)過原點的直線方程：組氨酸標準品1平均峰面積=b(斜率)×組氨酸標準品1濃度，則樣品中組氨酸的濃度(mg/ml)=樣品峰面積×100÷b=樣品峰面積×組氨酸標準品1濃度×100÷組氨酸標準品1平均峰面積(其中100為樣品的稀釋倍數(shù))。

1.5 驗證方案

1.5.1 專屬性 使用mAb-1和不含組氨酸的配方緩沖液進行專屬性驗證，分別進樣3次，可接受標準為在組氨酸的保留時間范圍內(nèi)必須無配方緩沖液組分和分析溶劑的干擾，且mAb-1和組氨酸標準品溶液中組氨酸保留時間的偏差必須≤5%。

1.5.2 準確度 使用加標溶液70%，100%和130%進行準確度驗證，可接受標準為各水平的平均回收率為90%～110%，且各水平下3次獨立測定的濃度變異系數(shù)必須≤5%。

1.5.3 重復性 使用mAb-1進行重復性驗證，可接受標準為6次獨立測定的濃度變異系數(shù)必須≤5%。

1.5.4 中間精密度 由兩位實驗人員分別在3個工作日對mAb-1進行3次獨立的組氨酸含量測定用于評估中間精密度，可接受標準為18次獨立測定的濃度變異系數(shù)必須≤10%。

1.5.5 線性關(guān)系 使用加標溶液1～5進行線性驗證。以組氨酸含量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制回歸方程?？山邮軜藴蕿闆Q定系數(shù)R2≥0.98，y軸截距的置信區(qū)間必須包含原點，各濃度水平的回收率應在90%～110%范圍內(nèi)，變異系數(shù)應≤5%。

1.5.6 檢測范圍 用檢測范圍下限(70%加標)和上限(130%加標)的6次測定驗證檢測范圍，可接受標準為各水平的平均回收率必須在90%～110%范圍內(nèi)，各水平的變異系數(shù)必須≤5%。

1.5.7 耐用性 樣品和對照品于自動進樣器中貯存0 h和24 h后，在同一個系統(tǒng)上分析樣品，評價各自的穩(wěn)定性，可接受標準為樣品溶液、標準溶液和對照品溶液的各時間點的平均回收率與0 h相比必須在90%～110%范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的專屬性驗證

結(jié)果表明所有配方緩沖液組分均不干擾組氨酸峰(見圖1)，mAb-1樣品和組氨酸標準品1中組氨酸的保留時間(分別為17.789，17.870 min)偏差為0.45%(見圖2)，符合驗收標準，表明該方法具有良好的專屬性。

圖1 基質(zhì)緩沖液和不含組氨酸的基質(zhì)緩沖液的重疊色譜圖Figure 1 Overlaid chromatograms of matrix buffer and matrix buffer without histidine

圖2 組氨酸標準品、mAb-1和對照品的重疊色譜圖Figure 2 Overlaid chromatograms of histidine standard， mAb-1 and blank samples

2.2 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的準確度驗證

結(jié)果表明3個加標溶液70%，100%，130%的平均回收率在96.1%～101.9%范圍內(nèi)，變異系數(shù)在0.5%～1.1%范圍內(nèi)(見表2)，符合驗收標準，表明該方法的準確度符合要求。

表2 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的準確度實驗結(jié)果Table 2 Results on the accuracy of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

2.3 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的重復性(精密度)驗證

重復性驗證使用的mAb-1(蛋白濃度為4.5 mg/ml)為含有已知濃度L-組氨酸(理論濃度為3.100 mg/ml)的單抗溶液。6次獨立測定結(jié)果顯示，組氨酸的實測濃度均值為(3.151±0.038)mg/ml，變異系數(shù)為1.2%，95%置信區(qū)間為3.110～3.191 mg/ml(見表3)，符合驗收標準，表明該方法具有很好的重復性。

表3 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的重復性實驗結(jié)果Table 3 Results on the repeatability of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

2.4 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的中間精密度驗證

中間精密度驗證使用的樣品同重復性驗證。兩位實驗人員分別在3個工作日進行的18次獨立測定結(jié)果顯示，組氨酸平均濃度為(3.273±0.101)mg/ml，變異系數(shù)為3.1%，95%置信區(qū)間為3.167～3.379 mg/ml(見表4)，符合驗收標準，表明該方法通過了中間精密度驗證的要求。

表4 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的中間精密度實驗結(jié)果Table 4 Results on the intermediate precision of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

2.5 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的線性驗證

線性驗證使用的是5個不同水平的加標溶液，每個濃度點進行3次獨立測試，以組氨酸計算濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制散點圖和趨勢線。結(jié)果顯示，組氨酸濃度和峰面積形成y=109 274x-6 925.8的線性關(guān)系，其決定系數(shù)R2=0.995 0(見圖3)。y軸截距的95%置信區(qū)間(-3 328.6～9 262.3)包含原點。各水平下的回收率和變異系數(shù)均在驗收標準范圍內(nèi)(見表5)，表明在分析范圍內(nèi)(2.170～4.033 mg/ml，即10.85～20.15 μg)組氨酸濃度與檢測響應信號呈線性關(guān)系。

表5 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的線性實驗結(jié)果Table 5 Results on the linearity of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

圖3 組氨酸濃度與檢測信號的線性關(guān)系Figure 3 Linear correlation of histidine concentration and detection signals

2.6 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的檢測范圍驗證

本部分再次對組成線性的上限和下限2個濃度點分別進行了6次獨立的測試。結(jié)果證明，檢測范圍的下限(平均回收率：94.2%/CV=1.1%)和上限(平均回收率：95.1%/CV=1.1%)均具有良好的精密性和準確度(見表6)，符合驗收標準。

表6 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的檢測范圍實驗結(jié)果Table 6 Results on the detection range of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

2.7 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的耐用性驗證

該方法中，對結(jié)果影響較大的因素為衍生后樣品的穩(wěn)定性，因此耐用性主要考察該影響因素。結(jié)果表明，相對于0 h，衍生后mAb-1樣品在(5±3)℃密封瓶條件下在自動進樣器中暫存24 h后的回收率為100.3%，而衍生對照品在(5±3)℃密封瓶條件下在自動進樣器中暫存26 h后的回收率為100.2%(見表7)，均符合驗收標準。

表7 RP-HPLC法測定單抗藥物中組氨酸含量的耐用性實驗結(jié)果Table 7 Results on the robustness of RP-HPLC method for determining histidine content in monoclonal antibody drugs

3 討論

由于多數(shù)氨基酸沒有顯色基團，無法用簡單的方法檢測，而且所有的氨基酸極性都很大，無法反相分離。因此需要進行衍生處理，增加顯色基團(紫外或熒光)，提高檢測靈敏度，同時改變樣品的極性，變離子型化合物為非離子型，改變分離模式，用反相方法分離[9]。本研究利用6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate，AQC)衍生試劑建立的柱前衍生RP-HPLC紫外檢測單抗藥物中組氨酸含量的方法在2.17～4.03 mg/ml(即10.85～20.15 μg)范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。同時，本研究嚴格按照《中國藥典》2020年版三部中分析方法驗證指導原則[10]和ICH協(xié)調(diào)三方指導原則(ICH Harmonised Tripartite Guideline)Q2[11]進行方法學驗證。

理論上，方法驗證中應使用除了不含待測物質(zhì)外，其他成分與待測樣本完全一致的溶液來評價其專屬性[7，12，13]。但是，在單抗的生產(chǎn)工藝中，為了保證原液的穩(wěn)定性，在原液制備時就加入了配方緩沖液。在此之前的中間產(chǎn)物雖然不含配方緩沖液，但是不易獲取和保存。首先通過使用不含組氨酸的配方緩沖液和完整配方緩沖液的比較，排除其他輔料對組氨酸檢測結(jié)果的影響。在此基礎上，通過使用含完整配方的抗體溶液和組氨酸標準品保留時間的比較，檢查抗體蛋白對組氨酸的保留時間是否有影響。

準確度驗證使用了高(4.033 mg/ml)、中(3.100 mg/ml)、低(2.170 mg/ml)3個濃度的組氨酸加標溶液。如上所述，由于無法獲得不含組氨酸的抗體溶液，本研究中使用的加標溶液(也包括文中線性和工作范圍驗證中使用到的加標溶液)是使用含完整配方的抗體溶液和含不同濃度組氨酸的配方緩沖液按一定比例配制而成，以其理論濃度作為真實值，比較檢測結(jié)果與真實值的偏差。

在線性驗證中，組氨酸濃度和峰面積可以形成一條經(jīng)過原點的直線方程。因此，在方法的實際應用時，為了簡化試驗操作和計算過程，使用單個點的組氨酸標準品濃度與峰面積繪制經(jīng)過原點的直線方程，得到峰面積相對于濃度的斜率，再通過樣品的峰面積和斜率計算樣品中組氨酸的濃度。

綜上所述，該方法具有良好的專屬性、準確度、重復性、中間精密度、線性和耐用性，可作為單克隆抗體制品的組氨酸質(zhì)量控制方法。