徐子杰，聶曉瑞，鄭 華(北京市朝陽區(qū)婦幼保健院婦科，北京 100025；通訊作者，E-mail:xuzij8508888@163.com)

宮頸癌是婦科惡性腫瘤中最為常見的一種疾病，在全球女性惡性腫瘤中排第二位，僅次于乳腺癌[1]。研究表明[2]，全球每年宮頸癌的新發(fā)病例超過50萬，每年的死亡人數(shù)大約為20萬，在婦科惡性腫瘤中，宮頸癌的死亡率穩(wěn)居首位。據(jù)報道，在轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性宮頸癌患者中，通過mTOR途徑上調(diào)的磷酸肌醇3激酶(PI3K)、AKT蛋白表達可引起宮頸癌細胞凋亡[3]。MicroRNA(miRNA)是內(nèi)源性的19-25聚體非編碼小RNA，通過與靶信使RNA(mRNA)的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)堿基配對來調(diào)節(jié)基因[4]。有研究指出，miR-126-3p可在肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、膀胱癌和前列腺癌等多種癌癥中，通過抑制癌基因發(fā)揮抑癌作用或通過抑制腫瘤抑制因子作為腫瘤促進劑[5-7]。既往研究表明，miR-126-3p在宮頸良性腫瘤中可通過靶向PI3K亞基p85β(PIK3R2)3′-UTR中的一個位點，調(diào)控AKT蛋白表達，影響患者病情發(fā)展[8]。然而，miR-126-3p在宮頸癌中的作用及其與PI3K/PDK1/AKT通路相關(guān)的分子機制尚未完全闡明。筆者就此進行研究，觀察miR-126-3p對宮頸癌細胞生物學(xué)行為的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

宮頸癌HeLa細胞株購自北京生物技術(shù)有限公司。miR-126-3p模擬物購自中國上海GenePharma公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自北京生物海洋生物技術(shù)有限公司；DAPI染色試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司等。細胞計數(shù)器(上海上碧實驗儀器有限公司)；DM 750型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Spectra Max M5型多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；XDS-3型倒置顯微鏡(青島愛普科生物工程有限公司)；Biotek Lionheart FX活細胞成像分析系統(tǒng)(北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司)等。

1.2 實驗方案

宮頸癌HeLa細胞在含有10% FBS和1%抗生素抗真菌溶液、兩性霉素B和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，環(huán)境溫度37 ℃，CO2濃度5%，48 h后接種至18份相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后其中9株作為對照，進行常規(guī)培養(yǎng)，其余9株為miR-126-3p過表達組，使用miR-126-3p模擬物構(gòu)建載體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染，24 h后進行指標(biāo)檢測。載體構(gòu)建方案見圖1。過表達組基因表達量為對照組2倍及以上判定為模型構(gòu)建成功，模型構(gòu)建完成后使用qPCR檢測細胞miR-126-3p基因表達量。

圖1 載體構(gòu)建方案圖Figure 1 Scheme of vector plasmid construction

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 MTT細胞增殖試驗檢測細胞存活率 將細胞接種至96孔板中。將MTT溶液(2 mg/ml)加入細胞培養(yǎng)物中，并在37 ℃下絕對黑暗中孵育4 h。

將甲臜或紫色沉淀溶解在DMSO(100 μl)中，輕輕搖動。完全溶解后，使用酶標(biāo)儀測定讀數(shù)器通過MTT測定法檢測細胞增殖，在490 nm處評估吸光度，細胞存活率=細胞存活量/對照組細胞存活量×100%。

1.3.2 DAPI染色檢測凋亡小體 轉(zhuǎn)染后，將多個細胞株在96孔中培養(yǎng)24 h。用多聚甲醛洗滌和固定細胞并孵育1 h。然后再次洗滌細胞并加入Triton X-100溶液并孵育10 min。用PBS重新洗滌后，將細胞與DAPI溶液一起溫育，倒置顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)變化，觀察細胞核凋亡小體表現(xiàn)。

1.3.3 Wright染色法檢測細胞遷移 細胞遷移通過在Boyden室中通過8 μm孔聚碳酸酯過濾器(孔隙率，8 μm；Costar，Appleton Woods，伯明翰，英國)定向遷移的細胞數(shù)量來量化。簡而言之，過濾器的下表面涂有10 mg明膠。HeLa細胞被血清饑餓過夜并重新懸浮在無血清培養(yǎng)基中，然后將200 μl細胞懸浮液以1×106/ml的終濃度替換到每個孔的上室中。將含有FBS(10%)的培養(yǎng)基添加到底部室中，讓細胞在37 ℃下遷移6 h。用棉簽去除上膜表面上未遷移的細胞。附著在下膜表面的遷移細胞用含4%多聚甲醛的PBS固定，并用Wright染色法染色。使用標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡以400倍的放大倍數(shù)計數(shù)細胞，并記錄5個隨機視野中的平均細胞數(shù)/視野。使用一式三份過濾器，實驗重復(fù)3次。

除濾膜上表面涂有25 μg Matrigel，將細胞濃度調(diào)整為2×105個/ml，時間延長至24 h外，侵襲試驗同上。

1.3.4 劃痕實驗檢測侵襲量和細胞侵襲率 以5×105個/ml的濃度接種宮頸癌細胞在添加5%FBS的2 ml Ham’s F12的6孔板培養(yǎng)基中。用無菌200 μl移液管尖端轉(zhuǎn)染融合單層培養(yǎng)細胞，制作劃痕，并使用與Axio-Observer顯微鏡(Carl Zeiss)耦合的數(shù)碼相機系統(tǒng)在0，24，48 h顯微鏡拍照。通過ImageJ 1.60軟件測量傷口閉合，并計算傷口閉合率(=遷移細胞表面積/總表面積×100%)。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 將HeLa細胞接種在6孔板(3×105)中并孵育過夜以使其黏附。然后將蘆丁處理的細胞用胰蛋白酶消化，500g離心(5 min，重懸于PBS溶液中，然后在4 ℃的70%乙醇中固定4 h。之后，細胞用PBS洗滌兩次，并在37 ℃下用0.1 mg/ml RNase A處理30 min。最后，將細胞用含有0.1% Triton X-100、0.025 mg/ml PI的DNA染色溶液在黑暗中染色30 min。使用流式細胞儀通過流式細胞術(shù)分析熒光細胞。

1.3.6 蛋白印跡檢測Bax、Bcl-2、Casepase-3蛋白表達 使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。細胞用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次，并使用含有1 mol/L PMSF、1 mol/L原釩酸鈉和等濃度完全蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液裂解。在冰上孵育30 min后，將細胞裂解物研磨并在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min。將澄清的上清液保存為全細胞裂解液。裂解液加載到10%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳上，電泳80 V 30 min和120 V 60 min，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h。然后，將膜與Bax、Bcl-2、Casepase-3抗體(稀釋度1 ∶100)4 ℃過夜，然后清洗膜并與適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。最后，使用增強型化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Clinx Science Instruments， U.S.A.)觀察蛋白質(zhì)條帶。測量β-catin表達水平作為內(nèi)源參考并用于標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)2-ΔΔCt方法計算蛋白的相對表達。

1.3.7 Q-PCR檢測miR-126-3p表達量 使用miRNeasy Mini Kit提取總RNA，并按照PrimeScript RT試劑盒的說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后，在ABI7500定量PCR儀器中，如SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒(RR820A；Takara)說明書中所述，將cDNA進行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。miR-126-3p引物由Takara設(shè)計合成(正向引物：5′-GGGGTCGTACCGTGAGT-3′，反向引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′)。使用相對定量方法(2-ΔΔCt)計算miR-126-3p相對于β-catin的mRNA表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-126-3p表達

轉(zhuǎn)染后，對照組miR-126-3p相對表達量為1.04±0.11，miR-126-3p過表達組miR-126-3p相對表達量為3.14±0.28，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=20.942，P=0.000)，提示模型構(gòu)建成功。

2.2 兩組細胞活力比較

miR-126-3p過表達組HeLa細胞存活率顯著低于對照組(78.27%±5.41%vs100.00%±0.00%，t=12.050，P<0.05)。DAPI染色結(jié)果顯示，miR-126-3p過表達處理的細胞顯示出凋亡小體(細胞核破碎和凝聚)，而對照組未顯示出明顯的細胞凋亡(見圖2)。

A.對照組 B. miR-126-3p過表達組圖2 兩組DAPI細胞活力檢測結(jié)果 (×200)Figure 2 Cell viability in two groups by DAPI (×200)

2.3 兩組細胞周期比較

miR-126-3p過表達組G0/G1周期細胞占比顯著高于對照組，S周期細胞占比顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 兩組細胞周期比較Table 1 Comparison of cell proportion between the two

2.4 兩組細胞遷移比較

miR-126-3p過表達組細胞遷移量和細胞遷移率顯著低于對照組(P<0.05，見表2)，細胞遷移結(jié)果見圖3。

表2 兩組細胞遷移比較Table 2 Comparison of cell proliferation and migration between the two

A.對照組 B. miR-126-3p過表達組圖3 Wright染色法檢測兩組細胞遷移結(jié)果Figure 3 Cell migration results in two groups by Wright staining

2.5 兩組劃痕實驗結(jié)果比較

與對照組相比，miR-126-3p過表達組細胞中侵襲的細胞數(shù)減少(見圖4)，轉(zhuǎn)染24 h和48 h，miR-126-3p過表達組平均細胞侵襲率顯著于低于對照組(22.03±7.10vs35.47±5.54；28.52±5.19vs57.83±10.78)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 兩組Bax、Bcl-2、Casepase-3蛋白相對表達量比較

miR-126-3p過表達組Bax和Casepase-3蛋白相對表達量顯著高于對照組，Bcl-2蛋白相對表達顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

與對照組比較，*P<0.05圖5 兩組Bax、Bcl-2、Casepase-3蛋白相對表達量比較Figure 5 Comparison of the relative expression levels of Bax， Bcl-2 and Casepase-3 between the two groups

2.7 兩組p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相對表達量比較

miR-126-3p過表達組p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相對表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖6)。

與對照組比較，*P<0.05圖6 兩組p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相對表達量比較Figure 6 Comparison of the relative expression levels of p85β， p-PDK1 and p-AKT between the two groups

3 討論

宮頸癌是腫瘤相關(guān)死亡率的第四大原因，是全球常見的婦科腫瘤，宮頸癌細胞在宮頸癌發(fā)生過程中會發(fā)生一系列變化，包括基因組不穩(wěn)定的誘導(dǎo)、細胞增殖的失調(diào)、細胞周期控制機制的破壞以及某些癌基因和腫瘤抑制基因的異常表達[9]。腫瘤病情發(fā)生發(fā)展與不受控制的細胞增殖及細胞周期等細胞生物行為學(xué)密切相關(guān)[10]。

細胞凋亡是維持細胞環(huán)境動態(tài)平衡的基本程序性細胞死亡過程，Caspase激活是細胞凋亡誘導(dǎo)相關(guān)的關(guān)鍵途徑之一。Caspase-3，一種效應(yīng)子或執(zhí)行型Caspase，識別并分離各種靶蛋白中的短氨基酸序列，誘導(dǎo)細胞凋亡[11]，可通過分離Bid蛋白從而進一步與Bax結(jié)合，促進細胞色素c釋放，引起細胞凋亡[12]。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax組成。Bcl-2是著名的具有代表性的凋亡抑制因子，而Bax可以與Bcl-2結(jié)合形成異源二聚體，拮抗Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用，促進細胞凋亡。另一方面，Bax還激活Caspase-3，促進Ca2+釋放，進而導(dǎo)致細胞凋亡。Caspase-3作為代表性的執(zhí)行者在細胞凋亡中起著舉足輕重的作用。因此，Bax、Bcl-2和Caspase-3水平被認為是評價細胞凋亡的指標(biāo)。本研究中，miR-126-3p過表達導(dǎo)致Caspase-3、Bax蛋白表達上調(diào)，Bcl-2蛋白表達降低，表明miR-126-3p過表達可以通過線粒體介導(dǎo)或外在途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，減少癌細胞增殖。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-126-3p過表達組細胞活力顯著低于對照組。此外，腫瘤病情發(fā)生發(fā)展與不受控制的細胞周期密切相關(guān)，細胞周期分析結(jié)果顯示，miR-126-3p過表達在G0/G1期阻止了宮頸癌細胞的細胞周期進程，誘導(dǎo)細胞周期停滯。同時，癌細胞轉(zhuǎn)移、侵襲是引起患者病情進展的重要因素，病灶內(nèi)的細胞外基質(zhì)及基底膜過度降解、細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程增強等情況，癌細胞向腹腔播散及遠處轉(zhuǎn)移，稱為腫瘤侵襲。在體外實驗中，細胞侵襲試驗及劃痕實驗是對癌細胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力最直觀表現(xiàn)，本研究可見，miR-126-3p過表達可降低HeLa細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

進一步對其作用機制分析，Akt是人類癌癥中最常見的過度活化激酶之一，在細胞遷移中起重要作用[13]。有研究指出[14]，磷酸化AKT可誘導(dǎo)磷酸化GSK3β(無活性形式)，去磷酸化GSK3β(活性形式)可抑制細胞周期蛋白D1，磷酸化GSK3β的非活性形式誘導(dǎo)細胞周期蛋白D1表達。因此，miR-126-3p下調(diào)的磷酸化AKT可能通過下調(diào)cyclin D1來抑制細胞更新。此外，抑制PI3K/Akt通路可導(dǎo)致宮頸癌細胞凋亡[15]。我們的研究結(jié)果表明，miR-126-3p對PI3K/Akt通路的抑制通過促進Caspase-3活性抑制宮頸癌細胞增殖。同時，活化的AKT和mTOR是宮頸癌預(yù)后不良的指標(biāo)[16]。在臨床試驗中，PI3K/AKT/mTOR抑制劑已被用作宮頸癌的分子靶向治療，并且發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT抑制劑LY294002可增加宮頸癌細胞系的放療敏感性[17，18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-126-3p過表達組p85β、p-PDK1、p-AKT蛋白相對表達量顯著低于對照組，證實miR-126-3p過表達能通過調(diào)控宮頸癌細胞PI3K/PDK1/AKT蛋白通路抑制其細胞活力、遷移和侵襲。

本研究還存在一些不足：受miR-126-3p和p85β的強制表達采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)而不穩(wěn)定影響，難度較高，因此本研究未對p85β是否可以逆轉(zhuǎn)miR-126-3p的作用進行分析。如果能夠證明miR-126-3p靶基因與PI3K/PDK1/Akt通路的抑制之間的直接聯(lián)系，情況將會更加清楚，但本研究創(chuàng)新點的優(yōu)勢在于證實了miR-126-3p過表達影響了細胞中與PI3K/AKT通路相關(guān)的蛋白及腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)因子表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-126-3p影響PI3K/PDK1/AKT信號通路級聯(lián)反應(yīng)。

綜上，miR-126-3p過表達能通過調(diào)控宮頸癌細胞PI3K/PDK1/AKT蛋白通路抑制其細胞活力、遷移和侵襲，誘導(dǎo)癌細胞細胞周期停滯，外源性miR-126-3p及其靶分子可能成為miRNA的宮頸癌治療新靶點。