胡麗花，宋成文，袁 明，彭鄂軍(中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 40000；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科；通訊作者，E-mail:774560805@qq.com)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指在懷孕期間首次診斷出的葡萄糖耐受不良。它是妊娠最常見的并發(fā)癥之一，更重要的是，在全球育齡女性中，病例數(shù)量正在增加，特別是隨著肥胖患病率的上升。GDM也是2型糖尿病最重要的危險(xiǎn)因素之一，近7%的孕婦會出現(xiàn)GDM并發(fā)癥[1]。GDM是由于妊娠期間胰島素抵抗增加導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙，并且對胰島素抵抗有直接和間接的影響。此外，由于GDM患者c-反應(yīng)蛋白水平升高，GDM增加了心肌梗死和冠心病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。然而，全球缺乏統(tǒng)一的GDM篩查和診斷策略。因此，有必要開發(fā)新的潛在分子靶點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)對GDM的早期診斷和治療。越來越多的研究表明，microRNAs(miRNAs)在GDM中具有重要的診斷和治療價值[3]。miRNA是一組小的非編碼RNA，可以通過與調(diào)控位點(diǎn)結(jié)合，通過翻譯抑制或降解來調(diào)控靶mRNA的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過調(diào)控基因在胰島β細(xì)胞功能受損和胰島素抵抗組織中具有重要作用，并參與糖尿病的進(jìn)展[4]。由于miR-219可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖能力，已被確定為先天性心臟病的預(yù)后靶點(diǎn)[5]。此外，有研究表明，miR-219可以作為糖尿病視網(wǎng)膜病檢測的潛在標(biāo)志物[6]。因此，本研究假設(shè)miR-219可能是GDM治療的有潛力的治療分子靶點(diǎn)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究擬探討miR-219在GDM發(fā)展中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 從中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心購買SPF級健康SD大鼠(體質(zhì)量200～250 g)。所有大鼠在溫度25 ℃，相對濕度58%～68%的動物房中適應(yīng)1周，可隨意獲得食物和水。

1.1.2 試劑和儀器 RIPA裂解緩沖液購自北京百奧萊博科技有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技公司；熒光定量檢測試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Caspase-3和Caspase-9抗體購自美國Abcam公司；NC inhibitor、miR-219 inhibitor、NC-siRNA、GSK-3β-siRNA質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；顯微鏡購自德國Leica公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 GDM大鼠模型構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)分組 通過腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)建立GDM大鼠模型[7]。實(shí)驗(yàn)前采集尾靜脈血檢測大鼠空腹血糖，血糖正常值設(shè)為2.8～5.8 mmol/L。隨機(jī)選取正常大鼠(雌性70只和雄性35只)并放在籠子里過夜。雌雄大鼠按2 ∶1的比例合籠，第2天清晨在光鏡下觀察陰道涂片中精子的存在情況，觀察到精子陽性定為妊娠第1天。妊娠第10天，選擇10只大鼠為對照組(normal組)，注射1 ml檸檬酸鹽緩沖液。選擇50只妊娠大鼠注射1 ml含有STZ的檸檬酸鹽緩沖液。72 h后，采集尾靜脈血(采血前禁食10 h)。檢測血清空腹血糖，若血糖高于16.7 mmol/L，則GDM大鼠模型構(gòu)建成功。將50只GDM大鼠隨機(jī)分為模型組(model組)、抑制物陰性對照組(NC inhibitor組)、miR-219抑制物組(miR-219 inhibitor組)、miR-219抑制物+陰性對照質(zhì)粒組(miR-219 inhibitor+NC-siRNA組)、miR-219抑制物+GSK-3β-siRNA質(zhì)粒組(miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA組)，NC inhibitor組、miR-219 inhibitor組、miR-219 inhibitor+NC-siRNA組、miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA組大鼠在構(gòu)建GDM模型后分別經(jīng)尾靜脈注射10 nmol/L的NC inhibitor、miR-219 inhibitor、miR-219 inhibitor+NC-siRNA、miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA治療，每3 d一次，共6次。normal組和model組大鼠每3 d給予相同體積的生理鹽水。在妊娠第20天實(shí)施安樂死，從大鼠尾靜脈采集空腹血并取出心肌組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測 大鼠妊娠第20天實(shí)施安樂死，從大鼠尾靜脈采集空腹血，通過血糖儀檢測大鼠血清空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)值。通過陰離子交換色譜法測定糖化血紅蛋白(glucosylated hemoglobin，HbAlc)水平。通過免疫比濁法測定超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitive C-reactive protein，hs-CRP)水平。用免疫熒光法測定心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponini，cTnI)水平，用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)水平。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測心肌組織病理學(xué)變化 大鼠妊娠第20天實(shí)施安樂死，解剖并取出大鼠的心肌組織，將心肌組織在4%多聚甲醛中固定24 h，隨后在梯度酒精中脫水，二甲苯中透明。將石蠟包埋的標(biāo)本切成4 μm的連續(xù)切片。切片分別用梯度酒精脫蠟和脫水5 min。最后，用蒸餾水沖洗切片并用蘇木精染色10 min。蒸餾水清洗后加入0.5%～1%鹽酸乙醇進(jìn)行分離。將切片在自來水下沖洗15 min，0.1%～0.5%伊紅染色1 min，自來水下沖洗1 min，梯度酒精脫水，中性樹膠封固。最后，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化并拍照。

1.2.4 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測normal組和model組大鼠心肌組織中miR-219、GSK-3β mRNA表達(dá) 使用Trizol試劑從心肌組織中提取總RNA。按照說明書使用M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后在7900HT Fast Real-Time PCR系統(tǒng)中使用SYBR-Green試劑盒進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性20 s，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。U6基因作為miR-219的內(nèi)部對照，而甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為GSK-3β mRNA的內(nèi)部對照。使用2-ΔΔCt法檢測目的基因的相對表達(dá)水平。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列：miR-219 F:5′-ACACTCCAGCTGGGTGATTGTCCAAAC-GCAAT-3′，R:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6 F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;GSK-3β F:5′-GACAGTGGTGTGGATCAGTTGGTG-3′，R:5′-GCGATTGCCTCTGGTGGAGTTC-3′;GAPDH F:5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，R:5′-AGCCCA-GGATGCCCTTTAGT-3′。

1.2.5 Western blotting檢測大鼠心肌組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá) 使用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液裂解心肌組織。將20 μg蛋白質(zhì)加樣至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中進(jìn)行電泳分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉，并與一抗在4 ℃下過夜孵育。然后，用PBST洗滌PVDF膜后，將膜與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h。用ECL發(fā)光試劑盒和凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白質(zhì)。使用Image J分析吸光度值。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測大鼠心肌組織中SOD、MDA、NO、NOS水平 將大鼠心肌組織在冰浴中勻漿，并在4 ℃下以4 000 r/min離心15 min。取上清液裝入EP管中，并在-20 ℃冰箱中保存。使用ELISA試劑盒根據(jù)其說明書測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的含量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-219與GSK-3β的靶向關(guān)系 合成GSK-3β的3'非翻譯區(qū)(UTR)的序列，以及相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)的突變序列。兩個序列均包含SpeⅠ和HindⅢ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。通過使用T4 DNA連接酶將序列插入到pMIR-REPORT載體中。接下來，將GSK-3β野生型(WT)和突變型(MUT)報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-219 mimic和海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞，離心3～5 min后取上清液。使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測熒光素酶的活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-219在GDM中的表達(dá)以及與GSK-3β的靶向關(guān)系

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與normal組比較，model組大鼠中miR-219水平顯著升高，GSK-3β mRNA水平顯著降低(P<0.05)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與NC inhibitor組比較，共轉(zhuǎn)染GSK-3β-WT的miR-219 inhibitor組熒光素酶活性顯著升高(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染GSK-3β-MUT的miR-219 inhibitor組的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖1)。

與normal組比較，*P<0.05；與NC inhibitor組比較，#P<0.05圖1 miR-219在GDM中的表達(dá)以及與GSK-3β的靶向關(guān)系Figure 1 Expression of miR-219 in GDM and its targeting relationship with GSK-3β

2.2 miR-219對GDM大鼠血清中FBG、HbAlc水平的影響

與normal組比較，model組和NC inhibitor組大鼠血清中FBG、HbAlc水平顯著升高(P<0.05)；與NC inhibitor組比較，miR-219 inhibitor組和miR-219 inhibitor+NC-siRNA組大鼠血清中FBG、HbAlc水平顯著降低(P<0.05)；與miR-219 inhibitor+NC-siRNA組比較，miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA組大鼠血清中FBG、HbAlc水平顯著升高(P<0.05，見表1)。

表1 miR-219對GDM大鼠血清中FBG、HbAlc水平的影響Table 1 Effects of miR-219 on serum FBG and HbAlc levels in GDM rats

2.3 miR-219對GDM大鼠血清生化指標(biāo)的影響

與normal組比較，model組和NC inhibitor組大鼠血清中hs-CRP、cTnI、CK-MB水平顯著升高(P<0.05)；與NC inhibitor組比較，miR-219 inhibitor組和miR-219 inhibitor+NC-siRNA組大鼠血清中hs-CRP、cTnI、CK-MB水平顯著降低(P<0.05)；與miR-219 inhibitor+NC-siRNA組比較，miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA組大鼠血清中hs-CRP、cTnI、CK-MB水平顯著升高(P<0.05，見表2)。

表2 miR-219對GDM大鼠血清中hs-CRP、cTnI、CK-MB水平的影響Table 2 Effects of miR-219 on serum levels of hs-CRP， cTnI and CK-MB in GDM rats

2.4 miR-219對GDM大鼠心肌組織病理改變的影響

normal組心肌細(xì)胞核清晰，細(xì)胞排列整齊，無明顯病理改變。model組和NC inhibitor組心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維水腫嚴(yán)重，心肌細(xì)胞空泡變性，部分肌原纖維斷裂，橫紋消失。與NC inhibitor組比較，miR-219 inhibitor組心肌病理變化明顯減輕，心肌細(xì)胞排列較整齊，僅有少量心肌纖維腫脹。與miR-219 inhibitor+NC-siRNA組比較，miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA組心肌損傷加重，心肌細(xì)胞排列較紊亂，大量肌原纖維結(jié)構(gòu)斷裂(見圖2)。

圖2 miR-219對GDM大鼠心肌組織病理改變的影響 (HE染色)Figure 2 Effect of miR-219 on pathological changes of myocardial tissue in GDM rats (HE staining)

2.5 miR-219對GDM大鼠凋亡蛋白水平的影響

與normal組比較，model組和NC inhibitor組大鼠心肌組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與NC inhibitor組比較，miR-219 inhibitor組和miR-219 inhibitor+NC-siRNA組大鼠心肌組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與miR-219 inhibitor+NC-siRNA組比較，miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA組大鼠心肌組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05，見圖3)。

與normal組比較，*P<0.05；與NC inhibitor組比較，#P<0.05；與miR-219 inhibitor+NC-siRNA組比較，&P<0.05圖3 miR-219對GDM大鼠凋亡蛋白水平的影響Figure 3 Effect of miR-219 on the level of apoptotic proteins in GDM rats

2.6 miR-219對GDM大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

與normal組比較，model組和NC inhibitor組大鼠心肌組織中SOD、NOS活性和NO含量降低，MDA含量升高(P<0.05)；與NC inhibitor組比較，miR-219 inhibitor組和miR-219 inhibitor+NC-siRNA組大鼠心肌組織中SOD、NOS活性和NO含量升高，MDA含量降低(P<0.05)；與miR-219 inhibitor+NC-siRNA組比較，miR-219 inhibitor+GSK-3β-siRNA組大鼠心肌組織中SOD、NOS活性和NO含量降低，MDA含量升高(P<0.05，見圖4)。

與normal組比較，*P<0.05；與NC inhibitor組比較，#P<0.05；與miR-219 inhibitor+NC-siRNA組比較，&P<0.05圖4 miR-219對GDM大鼠氧化應(yīng)激水平的影響Figure 4 Effect of miR-219 on oxidative stress level in GDM rats

3 討論

研究報(bào)道，miRNA涉及各種生物活性，包括內(nèi)分泌和代謝性疾病、癌癥等。例如，miR-219通過靶向HMGA2抑制卵巢癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[8]。miR-219通過調(diào)控NMDAR信號通路降低T2DM小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[9]。近期，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA可作為預(yù)測GDM的重要生物標(biāo)志物[10，11]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-219在GDM大鼠中的表達(dá)顯著升高，表明miR-219可能會有助于GDM的診斷。因此，為了進(jìn)一步探討miR-219的作用機(jī)制，本研究通過將miR-219 inhibitor注射至大鼠體內(nèi)進(jìn)行研究。

既往研究表明FBG和HbA1c水平升高是糖尿病的診斷指標(biāo)[12]。本研究結(jié)果顯示model組大鼠血清中FBG和HbA1c水平升高，這與之前的研究一致。下調(diào)miR-873可降低FBG、HbAlc水平，提示下調(diào)miR-873可能與GDM的改善有關(guān)。由于高葡萄糖環(huán)境，GDM患者所生嬰兒患心血管畸形的風(fēng)險(xiǎn)增高[13]。然而，對妊娠期糖尿病心臟病發(fā)病機(jī)制的分子基礎(chǔ)研究尚未明確揭示其發(fā)病機(jī)制。之前有研究報(bào)道心肌細(xì)胞減少和凋亡細(xì)胞增加導(dǎo)致高血糖狀態(tài)下的心臟缺陷[14]，但仍需要更多研究來闡明其機(jī)制。心肌損傷是2型糖尿病常見的并發(fā)癥，其中，hs-CRP、CK-MB和cTnI被認(rèn)為是心肌損傷的重要指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-219下調(diào)可通過降低cTnI、CK-MB和hs-CRP的表達(dá)來減輕心肌損傷。已知Caspase在細(xì)胞凋亡的終末執(zhí)行階段發(fā)揮重要的作用，并且Caspase-3被認(rèn)為是Caspase的執(zhí)行者，Caspase-9被認(rèn)為是Caspase的啟動者[16]。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-219過表達(dá)顯著促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-219下調(diào)降低凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的水平，表明下調(diào)miR-219可抑制心肌細(xì)胞凋亡。SOD和MDA是氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，氧化應(yīng)激在糖尿病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[18]。由于氧化應(yīng)激水平較高，由NOS的轉(zhuǎn)錄和翻譯后調(diào)節(jié)引起的NO生物利用度在GDM中降低[19]。先前的研究表明miRNA參與氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)[20]。本研究結(jié)果表明抑制miR-219可升高SOD和NOS活性以及NO含量，降低MDA含量，表明miR-219下調(diào)可以抑制GDM氧化應(yīng)激水平。

糖原合成酶激酶3(GSK3)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于從酵母到哺乳動物的生物體中。GSK3亞型由兩個不同的基因編碼：GSK-3α和GSK-3β。糖原生成主要通過與GSK-3β密切相關(guān)的酶來調(diào)節(jié)，這種酶可以抑制糖原合成并誘導(dǎo)胰島素抵抗[21]。研究已經(jīng)證實(shí)GSK-3β與2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)之間存在密切關(guān)聯(lián)[22]。此外，有文獻(xiàn)表明GSK-3β在缺血再灌注損傷期間可起到保護(hù)心臟的作用[23]。本研究探討了GSK-3β在母體糖尿病引起的心臟異常和心肌細(xì)胞凋亡中的作用，結(jié)果表明抑制miR-219可以通過靶向GSK-3β進(jìn)而抑制GDM大鼠心肌損傷。

總之，miR-219下調(diào)可能通過靶向GSK-3β來調(diào)節(jié)GDM中的心肌損傷。因此，miR-219在未來可能成為GDM的治療靶點(diǎn)。然而，在將來還需要進(jìn)一步的研究來充分了解miR-219對GDM中心肌損傷調(diào)控的具體機(jī)制。