李 詠，劉 立(武漢市第四醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430033；通訊作者，E-mail:914057996@qq.com)

腦血管病是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，其致殘率和致死率均較高，其中缺血性腦血管病的發(fā)病率約占腦血管病的75%[1]。腦缺血后再灌注可進(jìn)一步促進(jìn)氧化應(yīng)激和炎癥所致的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元繼發(fā)性損傷，再灌注所引發(fā)的腦損傷即為腦缺血再灌注(ischemic stroke/reperfusion，I/R)損傷，其所致的腦損傷不可忽視，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。自噬(autophagy)是真核細(xì)胞中一種重要的分解代謝途徑，主要用于清除受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。然而，自噬是一把雙刃劍，適時(shí)上調(diào)細(xì)胞自噬水平具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，而過度的及低水平的細(xì)胞自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。目前，自噬在腦I/R損傷中的作用眾說紛紜，可能與復(fù)雜的病理環(huán)境、再灌注時(shí)間和治療干預(yù)方式等有關(guān)系。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是在自噬過程中細(xì)胞能量感知和細(xì)胞信號(hào)調(diào)控的一個(gè)重要的激酶，可以感受ATP的變化，并通過mTOR、p53、PI3K等3條途徑來調(diào)控細(xì)胞自噬，從而降解胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生能量[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族成員，包含α、δ(或β)、γ等3個(gè)亞基。PPARs通過DNA結(jié)合域結(jié)合，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，PPARs活化后在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、維持體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、參與細(xì)胞增殖及分化、調(diào)控炎癥和氧化應(yīng)激等過程中發(fā)揮重要作用[4，5]。目前，PPARα和β研究的比較多，功能比較明確，而PPARδ研究的比較少。已有研究[6，7]顯示，PPARδ可激活A(yù)MPK活性調(diào)控炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗、骨再生、腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞自噬等眾多生理病理過程。然而，PPARδ在腦I/R損傷中的作用尚不清楚。為此，本研究通過建立大鼠腦I/R損傷模型，探討GW501516激動(dòng)PPARδ對(duì)大鼠腦I/R損傷的作用及其機(jī)制，為缺血性腦損傷的臨床治療以及新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只SPF級(jí)SD大鼠，雄性，鼠齡8周，體質(zhì)量210～230 g，購(gòu)自湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2020-0018。大鼠被安置在無病原體環(huán)境條件下，環(huán)境溫度為(24±2)℃，相對(duì)濕度為55%～60%，光照/黑暗周期為12 h，大鼠可自由食用水和鼠糧。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，并獲得湖北省疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物委員會(huì)的批準(zhǔn)【安評(píng)中心動(dòng)(福)第202220224號(hào)】。

1.2 主要試劑與儀器

PPARδ激動(dòng)劑GW501516(純度≥98%)和AMPK抑制劑Dorsomorphin(純度≥98%)均購(gòu)自美國(guó)MCE公司；兔抗PPARδ、兔抗AMPKα、兔抗p-AMPKα(Thr172)、兔抗Beclin-1、兔抗LC3、兔抗GAPDH和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗LC3Ⅱ購(gòu)自美國(guó)PTG公司；CoraLite488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Aspen公司；IX51型倒置白光/熒光拍照顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；RM2016型切片機(jī)購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司；AX-Ⅱ型暗匣購(gòu)自廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司；LiDE110型掃描儀購(gòu)自日本Canon公司。

1.3 動(dòng)物模型制備與分組

將48只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分成：sham組、model組、GW組和GW+Dor組，每組12只。除sham組外，其余各組大鼠均采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉合并低血壓法建立腦I/R損傷模型[8]：采用4%水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉大鼠后，切口前皮下注射5 mg/kg卡洛芬用于鎮(zhèn)痛作用，取頸正中切口2 cm并向右延伸1 cm，分離右側(cè)頸總靜脈和雙側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎右側(cè)頸總靜脈遠(yuǎn)心端，夾閉近心端后剪“V”型切口，插管入右心房，輸入肝素2 ml(25 U/ml)抗凝，抽取總血容量30%的血液，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血20 min后去除雙側(cè)動(dòng)脈夾并將血液回輸，結(jié)扎右側(cè)頸總靜脈，縫合切口。除不夾閉左右頸總動(dòng)脈和抽取血液外，sham組大鼠手術(shù)步驟同model組。參照文獻(xiàn)[9]方法于造模前30 mim，GW組大鼠經(jīng)側(cè)腦室注射0.05 mg/kg GW501516，GW+Dor組大鼠經(jīng)側(cè)腦室注射0.05 mg/kg GW501516+0.25 mg/kg Dorsomorphin，注射體積為5 μl，而sham組和model組大鼠經(jīng)側(cè)腦室注射等量媒介。I/R 24 h后對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，然后處死大鼠并取腦缺血半暗帶區(qū)組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 Zea-Longa評(píng)分法評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能損傷情況

采用Zea-Longa評(píng)分法[10]對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)估。0分：正常行走(無神經(jīng)功能缺損)；1分：提尾時(shí)左前爪不能完全伸直(輕度神經(jīng)功能缺損)；2分：行走時(shí)不能直行，向左側(cè)繞圈(中度神經(jīng)功能缺損)；3分：行走時(shí)向左側(cè)傾倒(重度神經(jīng)功能缺損)；4分：不能自主行走或失去意識(shí)。評(píng)分越高說明大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.5 HE染色觀察各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)病理學(xué)變化

將大鼠腦缺血半暗帶區(qū)組織用4%多聚甲醛固定，脫水包埋，使用切片機(jī)切成2～3 μm的薄片，脫蠟至水，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片后置于顯微鏡下觀察大鼠腦缺血半暗帶區(qū)病理學(xué)變化。

1.6 TUNEL染色檢測(cè)大鼠腦缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡情況

腦缺血半暗帶區(qū)組織切片(同HE染色)脫蠟至水，加入蛋白酶K工作液，37 ℃水浴鍋中孵育30 min，再加入破膜液，室溫孵育10 min，然后加入TUNEL孵育液，37 ℃避光孵育1 h，最后加入DAPI染核，室溫避光孵育30 min，抗熒光淬滅封片劑封片后置于顯微鏡下觀察拍照。凋亡細(xì)胞呈綠色，DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞所占百分比，計(jì)算其平均值。

1.7 免疫熒光觀察各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)LC3Ⅱ陽性表達(dá)情況

腦缺血半暗帶區(qū)組織切片(同HE染色)放置檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中微波爐加熱10 min，待冷卻后用PBS洗滌3次，每次5 min，然后用山羊血清封閉切片15 min，4 ℃下與LC3Ⅱ一抗(1 ∶200)孵育過夜，次日，在切片中加入CoraLite488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶100)，室溫避光孵育1 h，然后加入PI溶液進(jìn)行核復(fù)染，封片后置于熒光顯微鏡下觀察染色情況。LC3Ⅱ陽性細(xì)胞呈綠色，PI染色細(xì)胞核呈橙紅色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)LC3Ⅱ陽性細(xì)胞所占百分比，計(jì)算其平均值。

1.8 Western blot檢測(cè)各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)PPARδ、AMPKα、p-AMPKα、Beclin-1和LC3等蛋白表達(dá)水平

使用RIPA裂解液提取大鼠腦缺血半暗帶區(qū)組織中的總蛋白，BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定提取物的蛋白濃度，采用10% SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜浸泡在5%脫脂奶粉中，室溫下封閉1 h，分別加入以下一抗：PPARδ(1 ∶1 000)、AMPKα(1 ∶1 000)、p-AMPKα(1 ∶1 000)、Beclin-1(1 ∶1 000)、LC3(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜，然后加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育1 h，最后采用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白條帶，暗匣中顯影后將膠片進(jìn)行掃描存檔，并用AlphaEaseFC軟件分析光密度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 GW501516對(duì)腦I/R損傷大鼠神經(jīng)功能的影響

sham組大鼠神經(jīng)功能無損傷，而model組大鼠神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重。與model組比較，GW組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05)；與GW比較，GW+Dor組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05，見圖1)。

與sham組比較，*P<0.05；與model組比較，#P<0.05；與GW組比較，△P<0.05圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分Figure 1 Neurological function score of rats in each group

2.2 GW501516對(duì)腦I/R損傷大鼠腦缺血半暗帶區(qū)病理學(xué)變化的影響

sham組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；model組和GW+Dor組細(xì)胞核固縮，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，胞質(zhì)分布不均勻，形成空泡，

并出現(xiàn)凝集，其中model組最為嚴(yán)重；GW組大部分腦結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，絕大部分神經(jīng)元出現(xiàn)整合，空泡明顯減少(見圖2)。

藍(lán)色為細(xì)胞核，紅色為細(xì)胞質(zhì)圖2 腦缺血半暗帶區(qū)HE染色 (×400)Figure 2 HE staining of cerebral ischemic penumbra (×400)

2.3 GW501516對(duì)腦I/R損傷大鼠腦缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

與sham組比較，model組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡水平顯著升高(P<0.05)；與model組比較，GW組大鼠細(xì)胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)；與GW比較，GW+Dor組大鼠細(xì)胞凋亡水平顯著升高(P<0.05，見圖3)。

圖3 各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡率 (×200)Figure 3 Apoptosis rates of cerebral ischemic penumbra in each group (×200)

2.4 GW501516對(duì)腦I/R損傷大鼠腦缺血半暗帶區(qū)LC3Ⅱ陽性表達(dá)的影響

與sham組比較，model組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)LC3Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P<0.05)；與model組比較，GW組大鼠LC3Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P<0.05)。與GW比較，GW+Dor組大鼠LC3Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05，見圖4)。

圖4 各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)LC3Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)量 (×200)Figure 4 Numbers of LC3Ⅱ positive cells in cerebral ischemic penumbra of rats in each group (×200)

2.5 GW501516對(duì)I/R損傷大鼠腦缺血半暗帶區(qū)PPARδ、AMPKα、p-AMPKα、Beclin-1和LC3等蛋白表達(dá)水平的影響

與sham組比較，model組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin-1蛋白及p-AMPKα/AMPKα、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值水平均顯著升高(P<0.05)，而PPARδ蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，見圖5)。與model組比較，GW組大鼠PPARδ、Beclin-1蛋白及p-AMPKα/AMPKα、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值水平均顯著升高(P<0.05，見圖5)。與GW比較，GW+Dor組大鼠Beclin-1蛋白及p-AMPKα/AMPKα、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值水平均顯著降低(P<0.05)，而PPARδ蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05，見圖5)。

與sham組比較，*P<0.05；與model組比較，#P<0.05；與GW組比較，△P<0.05圖5 各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)PPARδ、AMPKα、p-AMPKα、Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)水平Figure 5 Protein expression levels of PPARδ， AMPKα， P-AMPKα， Beclin-1 and LC3 in cerebral ischemic penumbra of rats in each group

3 討論

腦缺血是一種常見的腦血管疾病，嚴(yán)重危害人類健康。目前臨床上治療缺血性腦血管病中最有效的方法是通過溶栓盡早恢復(fù)供血，但溶栓后再灌注會(huì)導(dǎo)致一系列病理過程，包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的激活，進(jìn)一步加重腦組織損傷，即腦I/R損傷[11]。I/R損傷以多種類型的細(xì)胞死亡為特征，如自噬、凋亡等。由于腦I/R損傷的病理生理機(jī)制的復(fù)雜性，其臨床治療具有一定的局限性。因此，深入研究腦I/R損傷的具體機(jī)制可為治療缺血性腦血管病提供重要的理論依據(jù)。

自噬是真核細(xì)胞中高度保守的分解代謝過程，是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。當(dāng)受損細(xì)胞器數(shù)量增加、外部病原體入侵或發(fā)生蛋白質(zhì)異常堆積時(shí)，細(xì)胞內(nèi)容物被囊泡膜結(jié)構(gòu)包裹形成自噬小體，自噬小體進(jìn)一步與溶酶體結(jié)合，將細(xì)胞內(nèi)容物降解為小分子物質(zhì)[12]。Beclin-1和LC3是自噬的典型生物標(biāo)志物。Beclin-1是Beclin-1/PI3K-Ⅲ復(fù)合物的核心成分，參與自噬激活[13]。在自噬過程中，LC3I被轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ，因此，LC3 Ⅱ/Ⅰ表示自噬的程度[14]。眾多研究[15-17]顯示，腦I/R損傷與自噬密切相關(guān)，自噬在腦I/R損傷中有促生存或促死亡的潛能，被認(rèn)為是一把雙刃劍。本研究建立大鼠腦I/R損傷模型，結(jié)果顯示，model組大鼠神經(jīng)元空泡化，神經(jīng)功能評(píng)分、細(xì)胞凋亡率、LC3Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)量及Beclin-1蛋白和LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值水平均顯著升高，說明model組大鼠腦I/R損傷嚴(yán)重，且自噬水平升高，可能原因是在正常狀態(tài)下，細(xì)胞中自噬水平較低，但在腦I/R損傷的應(yīng)激條件下，大鼠腦缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞自噬被激活。

PPARs是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于人體肝臟、腎臟、褐色脂肪組織中。PPARs包含了α、δ(或β)、γ等3個(gè)亞基，其中關(guān)于PPARδ的研究最少。PPARδ在腦I/R損傷的作用目前未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，PPARδ激動(dòng)劑GW501516干預(yù)后，PPARδ蛋白表達(dá)水平和自噬水平均明顯升高，且大鼠腦I/R損傷明顯減輕。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷治療通過促進(jìn)自噬對(duì)大鼠腦I/R損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。lncRNA SNHG12誘導(dǎo)的自噬激活可以緩解小鼠腦I/R損傷，而自噬抑制劑3-MA可以部分逆轉(zhuǎn)這一損傷[19]。這些研究揭示了自噬在腦I/R損傷后具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果說明GW501516可激活自噬，從而減輕大鼠腦I/R損傷。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其由AMPKα(催化亞基)和AMPKβ/AMPKγ(調(diào)節(jié)亞基)組成。AMPK信號(hào)通路是調(diào)控自噬的關(guān)鍵通路。AMPK作為代謝和能量調(diào)節(jié)因子，被證實(shí)為自噬的啟動(dòng)子[20]，同時(shí)，AMPK介導(dǎo)的自噬激活是缺血性腦卒的一種保護(hù)機(jī)制[21]。本研究結(jié)果顯示，model組大鼠p-AMPKα/AMPKα水平和自噬水平均顯著升高，說明在腦I/R損傷的應(yīng)激條件下，AMPKα磷酸化被激活，其可作為應(yīng)激信號(hào)，激活大鼠腦缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞自噬[22]。GW501516干預(yù)后，PPARδ蛋白表達(dá)水平、AMPKα磷酸化水平和自噬水平均明顯升高，且大鼠腦I/R損傷明顯減輕。PPARδ與AMPK相互作用可調(diào)節(jié)糖代謝、血管內(nèi)皮功能障礙、胰島素抵抗和炎癥。有研究[23]發(fā)現(xiàn)，PPARδ激動(dòng)劑GW501516可通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路預(yù)防骨骼肌細(xì)胞炎癥和胰島素抵抗。此外，GW501516可通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬減輕肥胖小鼠肝臟脂肪變性[24]。本研究結(jié)果說明GW501516減輕大鼠腦I/R損傷可能與激活A(yù)MPK介導(dǎo)的自噬有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GW501516調(diào)控細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，采用AMPK抑制劑Dorsomorphin干預(yù)后，AMPK信號(hào)通路被抑制，自噬水平降低，同時(shí)GW501516對(duì)大鼠腦I/R損傷的改善作用被抑制，Dorsomorphin的作用靶點(diǎn)是AMPK，而PPARδ作為AMPK的上游調(diào)控蛋白，其表達(dá)水平不變，說明GW501516改善大鼠腦I/R損傷與激活A(yù)MPK信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬有關(guān)。

綜上所述，PPARδ激動(dòng)劑GW501516干預(yù)可通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬改善大鼠腦I/R損傷。因此，GW501516激動(dòng)PPARδ可能是一種有效的缺血性腦血管疾病治療干預(yù)措施。然而，本研究也有一些局限性。首先，需要確定GW501516是否還可以通過其他相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞自噬。其次，GW501516是否能通過興奮毒性、氧化應(yīng)激或神經(jīng)元炎癥等機(jī)制減輕腦I/R損傷有待進(jìn)一步研究。