胡浩然，孫學(xué)強(qiáng)，邢亞群，韓卓越，林 翔(蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，蚌埠 040；蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院感染科；通訊作者，E-mail:6747749@qq.com)

嚴(yán)重的細(xì)菌感染(bacterial infection)，如自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis，SBP)、肺炎或敗血癥，是晚期肝硬化患者常見(jiàn)的威脅生命的并發(fā)癥。肝硬化患者，尤其是處于晚期疾病階段，免疫監(jiān)視功能受損，對(duì)病原體的反應(yīng)降低，同時(shí)出現(xiàn)“疲憊”的全身炎癥[1]，使其感染難以控制。并且對(duì)細(xì)菌感染的高度易感性和過(guò)度的全身反應(yīng)都會(huì)引發(fā)肝和肝外器官功能障礙，易導(dǎo)致急性和慢性肝功能衰竭[2]以及門(mén)靜脈高壓突然惡化。針對(duì)BI制定積極的、個(gè)體化用藥的策略已成為肝病學(xué)多個(gè)領(lǐng)域的基石。相關(guān)研究已經(jīng)證明，在肝硬化失代償期患者中，每不恰當(dāng)使用抗生素1 h，死亡幾率就會(huì)增加1.9倍[3]。因此，及時(shí)、充分的抗生素管理對(duì)伴有細(xì)菌感染的肝硬化失代償自發(fā)性腹膜炎患者的病情控制極為重要。而近年來(lái)，由于抗菌藥物的濫用，抗生素耐藥性已成為本世紀(jì)公共衛(wèi)生的主要威脅，交叉耐藥、多重耐藥等問(wèn)題的出現(xiàn)為臨床疾病尤其是自發(fā)性腹膜炎的預(yù)防和治療帶來(lái)愈加嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，臨床上自發(fā)性腹膜炎診療急需尋找新的抗菌藥物進(jìn)行替代治療。安妥沙星是我國(guó)有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的1.1類(lèi)喹諾酮類(lèi)新藥，2009年批準(zhǔn)上市，具有良好的體內(nèi)外抗菌能力和安全性，相關(guān)報(bào)道已證明了安妥沙星用于肝硬化自發(fā)性腹膜炎患者的安全性[4，5]，且其藥理學(xué)和微生物學(xué)特征使其成為晚期肝硬化患者抗感染的優(yōu)先選擇。國(guó)內(nèi)外針對(duì)安妥沙星在健康人群中的血藥濃度測(cè)定已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[6-10]，但血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和腹腔積液中有所不同，血藥濃度不能直接反應(yīng)感染部位的藥物分布情況，目前在該類(lèi)領(lǐng)域尚缺乏足夠的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)研究。本文旨在通過(guò)高效液相色譜-紫外檢測(cè)器，建立肝硬化自發(fā)性腹膜炎人群感染部位的藥物濃度測(cè)定方法及藥動(dòng)學(xué)研究，為指導(dǎo)臨床醫(yī)師更合理、更安全地應(yīng)用安妥沙星提供十分重大的臨床意義。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

LC-20A高效液相色譜儀(島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司)；ME204E電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；Multifuge X1R低溫高速離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；A10TOC純水儀(北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司)；XP205電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；MCR-88-8臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(ESCO生命科學(xué)集團(tuán))；-80 ℃低溫冰箱(中國(guó)海爾公司)；渦旋混合器(ABSON科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥品

安妥沙星對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130457-201101，含量：90.9%)；氧氟沙星對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130454-202007，含量：99.7%)；甲醇和乙腈(色譜純，默克公司)；超純水(實(shí)驗(yàn)室提供)，其他試劑為分析純。

1.3 研究對(duì)象

選擇蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院感染科收治的6名肝硬化自發(fā)性腹膜炎患者，采集6名患者的腹腔積液。本研究經(jīng)過(guò)蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)為：2021-10)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

研究入選標(biāo)準(zhǔn)：①臨床、影像學(xué)和肝功能等實(shí)驗(yàn)室檢查符合肝炎后肝硬化診斷(肝臟穿刺)，排除肝癌；②B超或CT提示有腹腔積液者，且臨床上有明顯腹脹腹痛，食欲下降，惡心嘔吐及相關(guān)腹水體征；③SBP診斷依據(jù)為入院時(shí)腹水檢查中性粒細(xì)胞(PMN)計(jì)數(shù)>250/mm3；④臨床實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)資料不支持繼發(fā)性腹膜炎；⑤血漿肌酐(Cr)濃度<84 μmol/L；⑥既往無(wú)肝性腦病病史，入院時(shí)無(wú)Ⅱ～Ⅳ級(jí)肝性腦?。虎邿o(wú)上消化道出血；⑧腹平片及CT提示無(wú)腸梗阻；⑨電解質(zhì)無(wú)紊亂；⑩患者心電圖無(wú)明顯異常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①過(guò)敏體質(zhì)，既往有氟喹諾酮類(lèi)藥物過(guò)敏史或已知對(duì)安妥沙星或制劑輔料中任何其他成分過(guò)敏者；②有潛在的心律失?；蛘逹T間期延長(zhǎng)史。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 給藥方法和樣本采集

符合入選標(biāo)準(zhǔn)且不符合排除標(biāo)準(zhǔn)的入院病人行腹腔穿刺引流術(shù)后，單次口服鹽酸安妥沙星片400 mg；按照用藥方法囑其服藥后，給藥前記為0 h，并在給藥后0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，12，24，36，48，72 h收集病人腹腔積液樣本，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min取上清保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

2.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18(4. 6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A相為0.05 mol/L KH2PO4緩沖液(緩沖液中含0.005 mol/L乙烷磺酸鈉，0.007%乙二胺四乙酸二鈉，磷酸調(diào)pH=2.4)，B相為乙腈，A相 ∶B相=85 ∶15；檢測(cè)波長(zhǎng)：297 nm，流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30 ℃。

2.3 溶液的配制

2.3.1 安妥沙星對(duì)照品溶液配制 精密稱(chēng)定安妥沙星對(duì)照品11.5 mg(安妥沙星記為10 mg)，置于50 ml容量瓶中，加入溶劑(甲醇與水體積比1 ∶1)溶解定容至刻度，搖勻，得200 μg/ml安妥沙星儲(chǔ)備液，將所得對(duì)照品儲(chǔ)備液置于4 ℃條件下貯存，使用前將安妥沙星母液用甲醇與水體積比1 ∶1逐級(jí)稀釋成20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.125 μg/ml系列對(duì)照品溶液。

2.3.2 氧氟沙星對(duì)照品(內(nèi)標(biāo)用)溶液配制 精密稱(chēng)定氧氟沙星對(duì)照品20 mg，置于50 ml容量瓶中，加入溶劑甲醇與水體積比1 ∶1溶解定容至刻度，搖勻，得400 μg/ml氧氟沙星儲(chǔ)備液，將所得對(duì)照品儲(chǔ)備液置于4 ℃條件下貯存，使用前將氧氟沙星母液用甲醇與水體積比1 ∶1稀釋成20 μg/ml對(duì)照品溶液。

2.4 腹腔積液樣品處理

取-80 ℃冰箱凍存的腹腔積液樣本于4 ℃條件下解凍，取樣品200 μl置于1.5 ml離心管中，加入20 μl(20 μg/ml)內(nèi)標(biāo)液混勻，再加入600 μl純甲醇，置于旋轉(zhuǎn)混合器震蕩1 min后，在14 000 r/min下離心10 min，離心后的混合樣品取上清液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，置于自動(dòng)進(jìn)樣分析瓶中進(jìn)樣測(cè)定。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專(zhuān)屬性考察 分別取空白腹腔積液、安妥沙星對(duì)照品溶液+空白腹腔積液、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)氧氟沙星溶液+空白腹腔積液、待測(cè)腹腔積液樣本(給藥后6 h)，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，于“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。在“2.2”描述的色譜條件下，腹腔積液中的內(nèi)源性物質(zhì)、內(nèi)標(biāo)物氧氟沙星與安妥沙星分離度較好(分離度R>1.5)，安妥沙星在18.5 min左右出峰，且空白腹腔積液、內(nèi)標(biāo)物氧氟沙星對(duì)安妥沙星的出峰均無(wú)干擾，基線(xiàn)平穩(wěn)(見(jiàn)圖1)。表明在上述色譜條件下專(zhuān)屬性良好。

圖1 安妥沙星和氧氟沙星在自發(fā)性腹膜炎患者腹水中的高效液相色譜圖Figure 1 The HPLC chromatograms of antofloxacin and ofloxacin in ascites of patients with spontaneuous peritonitis

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備和線(xiàn)性關(guān)系考察 取事先配置好的安妥沙星母液，用甲醇與水體積比1 ∶1逐級(jí)稀釋分別配制成質(zhì)量濃度為20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.312 5，0.125 μg/ml的腹腔積液溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度樣品分別測(cè)定3次，以安妥沙星濃度X為橫坐標(biāo)，安妥沙星和內(nèi)標(biāo)物氧氟沙星的峰面積之比Y為縱坐標(biāo)，權(quán)重因子為1/X2，對(duì)兩者進(jìn)行線(xiàn)性回歸計(jì)算。線(xiàn)性方程為Y=0.131 1X-0.003 1，R2=0.999 6，實(shí)驗(yàn)表明樣品在0.125～20 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5.3 定量下限確定 精密量取含安妥沙星對(duì)照品的空白腹腔積液，逐級(jí)稀釋?zhuān)础?.4”項(xiàng)下方法處理，“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，在經(jīng)過(guò)逐級(jí)稀釋進(jìn)樣測(cè)定后，得出安妥沙星對(duì)照品在0.125 μg/ml時(shí)其信噪比(S/N=10)，由此確定本方法定量下限為0.125 μg/ml。

2.5.4 準(zhǔn)確度和精密度 分別制備安妥沙星質(zhì)控樣品Q(chēng)C低、中、高3個(gè)濃度(0.625，2.500，15.000 μg/ml)的腹腔積液樣本各6份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，按“2.5.2”項(xiàng)下操作，用當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定QC樣品濃度，計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；每天同法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣分析質(zhì)控樣品3 d，測(cè)定3 d的日間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，低、中、高濃度日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度均符合相關(guān)要求(見(jiàn)表1)。

表1 腹水中安妥沙星的精密度和準(zhǔn)確度 (n=6)Table 1 Precision and accuracy of antofloxacin in ascites (n=6)

2.5.5 加樣回收率考察 分別制備安妥沙星質(zhì)控樣品Q(chēng)C低、中、高3個(gè)濃度(0.625，2.500，15.000 μg/ml)的腹腔積液樣本各6份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，得質(zhì)控樣品的峰面積記為A1，另將與質(zhì)控樣品濃度一致的空白提取液加工作液樣本進(jìn)樣分析的峰面積記為A2，安妥沙星腹水中加樣回收率為A1/A2。結(jié)果顯示，低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品的回收率均落在80%～120%的區(qū)間且RSD值在±15%內(nèi)(見(jiàn)表2)，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

表2 腹水中安妥沙星的加樣回收率 (n=6)Table 2 Recovery of antoloxacin in ascites (n=6)

2.5.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別制備安妥沙星質(zhì)控樣品Q(chēng)C低、中、高3個(gè)濃度(0.625，2.500，15.000 μg/ml)的腹腔積液樣本各6份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，考察安妥沙星腹水樣本在室溫放置4 h、-20 ℃反復(fù)凍融3次、-20 ℃冰凍30 d條件下的樣品穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在室溫下放置4 h、反復(fù)凍融3次、-20 ℃凍存30 d這3種情況下樣品穩(wěn)定性良好(見(jiàn)表3)。

表3 腹水中安妥沙星的穩(wěn)定性 (n=6)Table 3 Stability of antofloxacin in ascites (n=6)

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究

6名肝硬化自發(fā)性腹膜炎患者單次口服400 mg鹽酸安妥沙星片后，分別采集“2.1”項(xiàng)下各個(gè)病人各個(gè)時(shí)間的腹腔積液樣品，“2.4”項(xiàng)下方法處理，“2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析；帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中計(jì)算腹腔積液樣品中的安妥沙星濃度，6名肝硬化自發(fā)性腹膜炎患者單次口服400 mg鹽酸安妥沙星片后腹腔積液中安妥沙星濃度-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖2；winnonlin 8.1軟件對(duì)腹水濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(見(jiàn)表4)。

圖2 自發(fā)性腹膜炎患者單次給藥400 mg鹽酸安妥沙星腹水藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn) (n=6)Figure 2 Dose-time curve of drug in ascites in patients with spontaneous peritonitis after given 400 mg antofloxacin hydrochloride tablet (n=6)

表4 自發(fā)性腹膜炎患者單次給藥400 mg鹽酸安妥沙星腹水中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) (n=6)Table 4 Pharmacokinetic parameters of drug in ascites in patients with spontaneous peritonitis after 400 mg antofloxacin hydrochloride tablet (n=6)

3 討論

3.1 處理方法的確定

在實(shí)驗(yàn)前期，本研究借鑒了相關(guān)氟喹諾酮類(lèi)藥物研究胸腔積液的處理方法[11，12]，從而對(duì)腹腔積液的處理方法采用了氮?dú)鈨x濃縮復(fù)溶的方法來(lái)處理，發(fā)現(xiàn)采用該方法處理得到的腹腔積液中安妥沙星的回收率極低，難以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，后查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6，8，9]，決定更換為有機(jī)溶劑直接沉淀蛋白的方法來(lái)處理腹腔積液，同時(shí)針對(duì)市面上常見(jiàn)的蛋白沉淀有機(jī)溶劑甲醇和乙腈分別進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)使用3倍體積的甲醇在毒性、出峰干擾上優(yōu)于乙腈，同時(shí)結(jié)果表明在使用甲醇沉淀蛋白處理下，腹腔積液中安妥沙星的提取回收率達(dá)95%以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.2 色譜條件的確定

3.2.1 流動(dòng)相比例的優(yōu)化 本研究在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別嘗試不同的流動(dòng)相比例，來(lái)尋找最合適實(shí)驗(yàn)的條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示流動(dòng)相配比85 ∶15時(shí)，對(duì)安妥沙星與內(nèi)標(biāo)物氧氟沙星的分離度較好，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求(R>1.5)，且空白基質(zhì)中的內(nèi)源性成分對(duì)二者出峰影響較小。

3.2.2 柱溫的優(yōu)化 理論上提高色譜柱柱溫可以降低流動(dòng)相的黏度、增加樣品在流動(dòng)相中的溶解度、縮短樣品的保留時(shí)間，因此控制柱溫可調(diào)整待測(cè)物質(zhì)出峰時(shí)間[12]。本研究比較了柱溫為30 ℃，35 ℃，40 ℃時(shí)安妥沙星、內(nèi)標(biāo)氧氟沙星的吸收峰的峰形、兩者的分離度、拖尾因子等，考慮到柱溫過(guò)高可能縮短色譜柱壽命、影響生物樣品的穩(wěn)定性，因此最終柱溫確定為30 ℃。

3.3 臨床應(yīng)用性

安妥沙星為我國(guó)自主研發(fā)的新型氟喹諾酮類(lèi)藥物，是臨床上常見(jiàn)的抗菌藥，臨床上主要用于大腸埃希菌引起的急性腎盂腎炎和膀胱炎，而肝硬化自發(fā)性腹膜炎患者的相關(guān)菌種研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)該類(lèi)患者的細(xì)菌培養(yǎng)也以大腸埃希菌為主，大約占1/3左右[13-15]。目前已有相關(guān)研究證實(shí)了安妥沙星用于肝硬化自發(fā)性腹膜炎患者的安全性[4，5]，但除了安全性和療效評(píng)價(jià)，尚無(wú)充分的藥動(dòng)學(xué)研究證據(jù)支撐自發(fā)性腹膜炎患者使用安妥沙星。本研究建立了一套測(cè)定患者腹腔積液中安妥沙星濃度的HPLC法，同時(shí)收集分析了患者單次給藥400 mg后腹腔積液的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，與研究報(bào)道的健康人群?jiǎn)未谓o藥400 mg血藥濃度Cmax，T1/2和Tmax相差較大[8]，分析原因可能是由于肝硬化自發(fā)性腹膜炎患者肝功能低下藥物清除速率較慢、腹膜厚度、腹膜內(nèi)源性物質(zhì)及腹膜穿透率的差異導(dǎo)致這種現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中建立的方法靈敏、可靠、準(zhǔn)確度高，樣品處理簡(jiǎn)單方便，出峰速度快，20 min即可完成1個(gè)樣品分析，分析成本較低，適用于臨床安妥沙星腹腔積液濃度測(cè)定及自發(fā)性腹膜炎患者腹部藥動(dòng)學(xué)研究。

3.4 不足

由于本研究的開(kāi)展方案為單中心，且入選患者樣本量不大，因此最終得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可能會(huì)有所偏倚，不一定適用于所有該類(lèi)臨床疾病患者。本課題組預(yù)計(jì)下一步在此實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上擴(kuò)大患者樣本量，開(kāi)展安妥沙星在自發(fā)性腹膜炎患者首劑服藥400 mg，后每天給藥200 mg用藥方案的藥動(dòng)學(xué)研究，以期為臨床相關(guān)診療提供完整、安全的安妥沙星用藥指導(dǎo)和個(gè)體化服務(wù)。