王會(huì)偉，朱世新，張新友，王 艷，楊鐵鋼，張向歌，王樹(shù)峰，李春鑫

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州 450002；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)院，河南 鄭州 450001）

我國(guó)是世界上植物油第一生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，受限于國(guó)內(nèi)產(chǎn)量，植物油供給對(duì)外依存度較高，已成為我國(guó)食用油供給安全的重大隱患。油莎豆（Cyperus esculentusL.）單產(chǎn)高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、綠色健康、耐澇節(jié)水[1-2]，是助力植物油自主供給、發(fā)展健康飲食的理想作物[3]。目前，油莎豆已被科技部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作為重要的新興油源作物進(jìn)行推廣，2021年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其正式列入“十四五”全國(guó)種植業(yè)發(fā)展規(guī)劃。

油莎豆屬于莎草科（Cyperaceae Juss.）、莎草屬（CyperusL.），該屬全世界約有600 種，分布于溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)，我國(guó)有60 多種[4]。油莎豆自20世紀(jì)50年代引入我國(guó)種植以來(lái)，由于種源多采用塊莖營(yíng)養(yǎng)繁殖，未經(jīng)過(guò)現(xiàn)代育種技術(shù)改良，退化嚴(yán)重。目前，完善的油莎豆良種繁育技術(shù)和優(yōu)異種質(zhì)資源非常匱乏[5]。這主要是因?yàn)橛蜕寡芯炕A(chǔ)薄弱，種質(zhì)資源的遺傳背景不明。因此，對(duì)油莎豆基因組大小、倍性和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析是油莎豆遺傳改良和育種的基礎(chǔ)。但是，目前此方面的研究非常少[6]。ZONNEVELD[6]在2019 年利用流式細(xì)胞儀分析了荷蘭油莎豆，發(fā)現(xiàn)其基因組約為0.669 Gb，并推測(cè)其為二倍體。通過(guò)測(cè)序來(lái)評(píng)估物種基因組大小和特性，是一種高效的方法。該方法已在研究基礎(chǔ)薄弱的動(dòng)植物遺傳背景分析中得到廣泛應(yīng)用[7-8]，但目前尚沒(méi)有利用該技術(shù)對(duì)油莎豆基因組進(jìn)行研究的報(bào)道。為此，通過(guò)流式細(xì)胞儀和基因組Survey 分析對(duì)黃淮地區(qū)油莎豆主栽品種和特色種質(zhì)資源的基因組大小、倍性進(jìn)行研究，并進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，為明確我國(guó)油莎豆種質(zhì)的遺傳背景奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試油莎豆為豫油莎1 號(hào)（C.esculentusL.‘Yuyousha 1’，中圓粒）、豫油莎2 號(hào)（C.esculentusL.‘Yuyousha 2’，中圓粒）、豫油莎3 號(hào)（C.esculentusL.‘Yuyousha 3’，中長(zhǎng)粒）、豫油莎5 號(hào)（C.esculentusL.‘Yuyousha 5’，中圓粒）、中油莎1 號(hào)（C.esculentusL.‘Zhongyousha 1’，中圓粒）、YYS-4（C.esculentusL.‘YYS-4’，大粒），均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所油莎豆育種研究室提供。其中，豫油莎1號(hào)、豫油莎2 號(hào)、豫油莎5 號(hào)和中油莎1號(hào)為主栽品種，豫油莎3號(hào)和YYS-4為特色種質(zhì)資源。

1.2 基因組大小、倍性分析

1.2.1 流式細(xì)胞儀分析 取6～8 葉期的6 個(gè)油莎豆材料的新鮮葉片20 mg 放在塑料培養(yǎng)皿的中心，添加1 mL 預(yù)冷的細(xì)胞核裂解液（45 mmol/L MgCl2·6H2O、20 mmol/L MOPS、30 mmol/L 檸檬酸鈉、10 mmol/L Na2EDTA、20 mL/L β-巰基乙醇、2% PVP-40、0.5% Triton X-100、0.1% Tween 20，pH 值7.0，-20 ℃下保存，解凍后4 ℃保存）到培養(yǎng)皿中，用刀片將葉片切碎，整個(gè)過(guò)程在冰袋上操作且保證葉片始終浸沒(méi)在裂解液中，上下混合勻漿數(shù)次，將勻漿過(guò)濾到標(biāo)記樣品管中，加入DNA 熒光鉻的儲(chǔ)備溶液，輕輕搖動(dòng)。分析前在冰上孵育樣品，偶爾搖晃。用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Accuri C6）測(cè)量染色核的相對(duì)熒光。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)，以小麥（基因組為17 Gb）為參照。測(cè)定所得圖像和數(shù)據(jù)由流式細(xì)胞儀自帶軟件進(jìn)行處理分析?；蚪M大小=（樣品熒光強(qiáng)度/參照熒光強(qiáng)度）×參照基因組大小。

1.2.2 Survey分析

1.2.2.1 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 取6～8 葉期3 種粒型油莎豆材料[豫油莎2 號(hào)（中圓粒）、豫油莎3 號(hào)（中長(zhǎng)粒）和YYS-4（大粒）]的葉片，用改良的CTAB 方法提取基因組DNA[9]。用Nano Drop 2000 分光光度計(jì)（Nano DropTechnologies，Wilmington，DE，USA）、Qubit 3.0 熒光計(jì)（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）和0.8%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)其濃度和質(zhì)量。然后3 個(gè)材料各取1 μg DNA 采用MGI DNA 文庫(kù)通用試劑盒（諾唯贊，南京）構(gòu)建文庫(kù)，對(duì)每個(gè)樣本添加index。文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Qubit 3.0熒光計(jì) 和Bioanalyzer 2100 系 統(tǒng)（Agilent Technologies，CA，USA）測(cè)定文庫(kù)中樣品的濃度和片段大小分布，以確定合適的上機(jī)pooling 方案。文庫(kù)檢測(cè)合格后，在MGI-SEQ 2000 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，具體測(cè)序服務(wù)由武漢菲沙基因信息有限公司提供。

1.2.2.2 Survey 分析 在二代測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后，利用HTQC（v1.92.310）軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)如下：去除接頭序列和PCR 擴(kuò)增等原因引起的冗余序列；去除單端測(cè)序讀長(zhǎng)中的一端含有的N含量占比超過(guò)10%的測(cè)序片段；去除測(cè)序片段中的一端含有的低質(zhì)量堿基數(shù)（≤5）占比超過(guò)50%的片段，得到高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)。參照LIU 等[10]的方法，通過(guò)GCE（Genome characteristics estimation）軟 件 的K-mer預(yù)估油莎豆的基因組大小、雜合率、重復(fù)序列占比及基因組倍性等，分析時(shí)采用K=17[11]。

1.2.3 花粉活力測(cè)定 挑選6個(gè)油莎豆材料即將散粉的單株，將其整個(gè)花器剪下，取少許花粉于載玻片上，滴加2～3 滴醋酸洋紅溶液，覆蓋載玻片，放在體視鏡（50×）下觀察花粉粒的染色情況。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

用DNA 提取試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]提取6個(gè)油莎豆材料的總DNA，然后進(jìn)行核糖體DNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）（ITS1-5.8S rDNA-ITS2）和 外 轉(zhuǎn) 錄 間 隔 區(qū)（External transcribed spacer，ETS）序列擴(kuò)增，其中，ITS序列的引物為SE17（5′-ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTC-3′）和SE26（5′-TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC-3′）[12]，ETS 序列的引物為ETS-F（5′-CTGTGGCGTCGCATGAGTTG-3′）和18S-R（5′-AGACAAGCATATGACTACTGGCAGG-3′）[13]。PCR 擴(kuò)增體系：12.5 μL 的2×TaqPCR Master Mix[生工生物工程（上海）股份有限公司]，11.2 μL ddH2O，正、反向引物各0.5 μL（10 μmol/L），0.3 μL模板DNA，總體積為25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物交河南尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行一代測(cè)序。

從GenBank中獲取長(zhǎng)尖莎草（C.cuspidatusH.B.K.）、異型莎草（C.difformisL.）、油莎豆（C.esculentusL.）、褐穗莎草（C.fuscusL.）、頭狀穗莎草（C.glomeratusL.）、畦畔莎草（C.haspanL.）、碎米莎草（C.iriaL.）、香附子（C.rotundusL.）、白毛羊胡子草（Eriophorum vaginatumL.）的ITS 和ETS 基因（表1），與6 個(gè)油莎豆材料的ITS 和ETS 基因用MAFFT[14]進(jìn)行多序列比對(duì)，然后將比對(duì)后的序列聯(lián)合用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。以白毛羊胡子草作為外類群，采用最大似然法（Maximum likelihood，ML）和 貝 葉 斯 推 論 法（Bayesian inference，BI）在Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research（CIPRES）Science Gateway（https://www.phylo.org/）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用RAxML（Randomized axelerated maximum likelihood）-HPC2 構(gòu)建ML 樹(shù)[15]，采用MrBayes Restart on XSEDE（3.2.x）構(gòu)建BI 樹(shù)[16]，參數(shù)設(shè)置參考WEI 等[17]的方法。在ML 樹(shù)中BS（自展支持率）≥70%結(jié)果可靠[17]，在BI 樹(shù)中PP（后驗(yàn)概率）≥0.95 結(jié)果可靠[16]，最終結(jié)果保留BS≥70%或PP≥0.95 的節(jié)點(diǎn)數(shù)值。最后用TreeGraph 2[18]查看、注解系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表1 油莎豆近源類群ITS和ETS序列的GenBank登錄號(hào)Tab.1 Accession numbers of ITS and ETS of closely related species ofC.esculentusL.from GenBank

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆基因組大小分析

2.1.1 基于流式細(xì)胞儀的基因組大小評(píng)估 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，6 個(gè)油莎豆材料的熒光峰對(duì)應(yīng)的基因組大小為0.808 6～0.858 5 Gb（圖1、表2），均值為0.826 0 Gb。其中，大粒材料（YYS-4）基因組最大，為0.858 5 Gb，中長(zhǎng)粒材料（豫油莎3 號(hào)）為0.831 1 Gb，豫油莎1 號(hào)、豫油莎2 號(hào)、豫油莎5 號(hào)和中油莎1 號(hào)等4 個(gè)中圓粒材料基因組均值為0.817 2 Gb。綜上，6 個(gè)油莎豆材料的基因組大小差異不明顯。

表2 基于流式細(xì)胞儀的6個(gè)油莎豆材料基因組大小評(píng)估Tab.2 Evaluation of genome size of sixC.esculentusL.materials by flow cytometry

圖1 6個(gè)油莎豆材料的流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果Fig.1 The determination results of sixC.esculentusL.materials by flow cytometry

2.1.2 基于Survey 分析的基因組大小評(píng)估 為進(jìn)一步準(zhǔn)確評(píng)估油莎豆基因組大小，對(duì)3 種粒型油莎豆材料（豫油莎2 號(hào)：中圓粒；豫油莎3 號(hào)：中長(zhǎng)粒；YYS-4：大粒）進(jìn)行基因組Survey分析。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控篩選，獲得測(cè)序數(shù)據(jù)量分別為豫油莎2 號(hào)58.70 Gb、豫油莎3 號(hào)52.60 Gb、YYS-4 64.36 Gb，測(cè)序深度分別為豫油莎2 號(hào)82×、豫油莎3 號(hào)66×、YYS-4 79×，Q20 均在95%以上，Q30 均在90%以上（表3），符合后續(xù)分析質(zhì)控要求。

表3 3種粒型油莎豆材料高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果Tab.3 Results of high quality sequence data of three tuber types ofC.esculentusL.

以過(guò)濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用軟件GCE基于K-mer（K=17）的方法估計(jì)基因組大小和雜合率及重復(fù)序列信息。結(jié)果（表4）顯示，3種粒型油莎豆材料豫油莎2 號(hào)、豫油莎3 號(hào)、YYS-4 基因組分別為0.697 9、0.778 7、0.790 6 Gb。3 種粒型油莎豆材料的雜合率均較低，其中，豫油莎2 號(hào)雜合率最高，為0.28%，豫油莎3 號(hào)雜合率僅為0.08%；重復(fù)序列占比在材料間基本相似，最高的豫油莎3 號(hào)為84.45%，最低的豫油莎2 號(hào)為81.02%；豫油莎3 號(hào)GC 含量最高為36.4%，豫油莎2 號(hào)和YYS-4 的GC含量非常接近，分別為34.7%和34.9%。

表4 3種粒型油莎豆材料的基因組特征信息Tab.4 Genome survey on three tuber types ofC.esculentusL.

2.2 油莎豆基因組倍性分析

對(duì)基因組K-mer深度分布（K=17）情況（圖2）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) 3個(gè)油莎豆材料均出現(xiàn)了 3個(gè)峰，且主峰與后面2個(gè)峰大約呈整數(shù)倍（1∶2∶3）關(guān)系，由此推測(cè)3個(gè)材料的倍性相同，可能均為三倍體。

圖2 3種粒型油莎豆材料K-mer深度分布Fig.2 The K-mer depth distribution of three tuber types ofC.esculentusL.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證油莎豆基因組倍性結(jié)果，利用醋酸洋紅對(duì)6 個(gè)油莎豆材料的花粉進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，6個(gè)材料的花粉中深紅色花粉粒占比均不超過(guò)2%，且部分材料中大量出現(xiàn)了不規(guī)則狀敗育花粉粒（圖3），說(shuō)明6 個(gè)材料的花粉粒均高度不育，從側(cè)面支持了基因組K-mer分析對(duì)油莎豆倍性的推斷。

圖3 6個(gè)油莎豆材料花粉粒醋酸洋紅染色結(jié)果Fig.3 Staining results of pollen grains of sixC.esculentusL.materials with magenta acetate

2.3 油莎豆系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS 和ETS 聯(lián)合序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），發(fā)現(xiàn)6 個(gè)油莎豆材料（豫油莎1 號(hào)、豫油莎2號(hào)、豫油莎3 號(hào)、豫油莎5 號(hào)、YYS-4 和中油莎1 號(hào)）和從GenBank 下載的油莎豆聚為一支，稱為油莎豆分支（BS=100%，PP=1）。在油莎豆分支中，豫油莎1號(hào)、豫油莎2 號(hào)和豫油莎5 號(hào)構(gòu)成一個(gè)高支持率的小分支（BS=99%，PP=1），與中油莎1 號(hào)形成姐妹群，然后它們共同與豫油莎3號(hào)構(gòu)成姐妹群。另外，油莎豆分支與香附子（C.rotundusL.）和頭狀穗莎草（C.glomeratusL.）構(gòu)成的分支（BS=100%，PP=1）形成親緣關(guān)系較近的姐妹群。

圖4 基于ITS和ETS聯(lián)合序列構(gòu)建的油莎豆與近緣類群的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree ofC.esculentusL.and closely related species based on ITS and ETS concatenate sequences

油莎豆與頭狀穗莎草、香附子、碎米莎草（C.iriaL.）、長(zhǎng)尖莎草（C.cuspidatusH.B.K.）等物種均為C4植物，共同構(gòu)成C4分支（BS=100%，PP=1）；而C3植物異型莎草（C.difformisL.）和褐穗莎草（C.fuscusL.）形成一支（BS=100%，PP=1）,與C4分支構(gòu)成姐妹群；畦畔莎草（C.haspanL.）位于莎草屬基部。

3 結(jié)論與討論

本研究中基因組Survey 分析結(jié)果表明，3 種代表粒型油莎豆材料中，YYS-4 基因組最大，其次是豫油莎3 號(hào)、豫油莎2 號(hào)，這與流式細(xì)胞儀分析結(jié)果的趨勢(shì)相符，但具體數(shù)值小于流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，大于ZONNEVELD[6]的結(jié)果。另外，根據(jù)K-mer分析結(jié)果，推測(cè)油莎豆為三倍體，油莎豆花粉粒高度敗育的觀察結(jié)果驗(yàn)證了該推測(cè)，但考慮到莎草科物種細(xì)胞學(xué)事件活躍，這一推論需要更多直接試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)是根據(jù)生物大分子包含的遺傳信息建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，推斷生物有機(jī)體間的遺傳與進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而明確屬間或?qū)傧赂鞣诸惾褐g的關(guān)系[19]。本研究結(jié)果顯示，6 個(gè)油莎豆材料間親緣關(guān)系較近，互為姐妹類群。其中，豫油莎1 號(hào)、2 號(hào)親緣關(guān)系最近，與豫油莎5 號(hào)、中油莎1 號(hào)稍遠(yuǎn)，再次為豫油莎3 號(hào)，YYS-4 與以上5 個(gè)材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。另外，油莎豆與香附子和頭狀穗莎草的親緣關(guān)系較近，這與LARRIDON 等[20]的研究結(jié)果一致。REN 等[21]基于葉綠體全基因組對(duì)13 個(gè)物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，在莎草屬分支中，栽培種油莎豆和香附子聚為一小支且有很高的支持率，褐穗莎草、頭狀穗莎草和異型莎草聚為一小支且有很高的支持率，兩小支形成姐妹群，并獲得很高的支持率。在本研究結(jié)果中，6 個(gè)油莎豆材料聚為具有高支持率的一支，香附子與頭狀穗莎草聚為一小支，且有很高的支持率，并與油莎豆形成姐妹群，獲得很高的支持率；但褐穗莎草和異型莎草聚為一小支且有很高的支持率，與油莎豆親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究結(jié)果與REN 等[21]的結(jié)果有所差異，可能的原因有兩點(diǎn)。首先，所選類群有差異。REN 等[21]選用的莎草屬物種僅有5 個(gè)，而本研究選取了河南省主栽油莎豆品種4 個(gè)、特色種質(zhì)2 個(gè)及莎草屬的其他物種7 個(gè)。其次，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的序列不同。REN 等[21]選用的是葉綠體全基因組，而本研究選用的是核基因片段（ETS 和ITS）。葉綠體基因組進(jìn)化速率適中，且為單親遺傳；而核基因能夠提供更多的信息位點(diǎn)，且為雙親遺傳，有助于發(fā)現(xiàn)進(jìn)化過(guò)程中的雜交和多倍化事件。然而，核基因序列為多拷貝，且存在致同進(jìn)化不完全現(xiàn)象，導(dǎo)致不同拷貝間的序列有差異，限制了其在系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用。因此，不同的基因有不同的特點(diǎn)，結(jié)合多基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)會(huì)獲得更全面準(zhǔn)確的結(jié)果。另外，莎草屬物種進(jìn)化歷史復(fù)雜，進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了多倍化、基因漸滲等現(xiàn)象[22]。因此，結(jié)合多種手段的分析結(jié)果才能真實(shí)地反映油莎豆與近緣野生種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。