劉 宇，李 成，朱 衛(wèi)，吳 松，劉曉紅，王宏健，王東艷，楊 莉，潘際剛

(貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025)

砷是一種自然環(huán)境中廣泛存在的非金屬元素[1]。人類在自然環(huán)境和工業(yè)活動中長期接觸受砷污染的水、空氣和食物而中毒，造成組織器官損傷、甚至癌變。此外，砷引起神經(jīng)系統(tǒng)損害也受到人們越來越多的關(guān)注[2]。但目前砷引起神經(jīng)損傷的具體機(jī)制仍不是十分明確。Hippo信號通路是一條在進(jìn)化上高度保守的激酶級聯(lián)信號通路，主要控制器官大小、組織穩(wěn)態(tài)和組織再生[3]。本課題組已經(jīng)證實(shí)，NaAsO2可通過激活Hippo信號通路，誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。突觸后致密蛋白95(post synaptic density protein，PSD95)、突觸素蛋白(synaptophysin，SYN)作為神經(jīng)突觸功能相關(guān)蛋白，其表達(dá)和缺失在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中十分重要[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上探討Hippo通路是否參與NaAsO2對PC12細(xì)胞活性、形態(tài)以及PSD95、SYN神經(jīng)突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 PC12細(xì)胞株(中科院昆明細(xì)胞庫)

1.1.2試劑 亞砷酸鈉(Sigma)，DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素(Gibco)，胎牛血清(BI)，CCK-8(碧云天)，PSD95、SYN(武漢三鷹)，XMU-MP-1(MCE)、抗兔IgG-HRP二抗(中杉金橋)，ECL曝光液(Millipore)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞的培養(yǎng)使用DMEM全培養(yǎng)基，培養(yǎng)在5% CO2、37 ℃環(huán)境的培養(yǎng)箱中。

1.2.2細(xì)胞處理及分組 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分別用0、10、20、30、40、50、60 μmol·L-1NaAsO2處理24和48 h，篩選NaAsO2濃度后分為Control組、XMU-MP-1組、NaAsO2組、XMU-MP-1+NaAsO2組。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 CCK-8檢測不同濃度NaAsO2處理24和48 h、XMU-MP-1處理和XMU-MP-1+NaAsO2處理后的細(xì)胞存活率。

1.2.4倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞平均長度 利用ImageJ軟件計(jì)數(shù)。對40 μmol·L-1NaAsO2、XMU-MP-1和XMU-MP-1+NaAsO2處理24 h的細(xì)胞隨機(jī)選取50個(gè)細(xì)胞進(jìn)行長度測定。

1.2.5Western blot檢測PSD95、SYN蛋白表達(dá) 提取各組蛋白并用BCA法定量。經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，孵育一抗、二抗，經(jīng)ECL曝光。

2 結(jié)果

2.1 NaAsO2對PC12細(xì)胞活力的影響CCK-8檢測表明，與對照組相比，不同濃度NaAsO2處理24或48 h均使PC12細(xì)胞活力降低(P<0.05)。

2.2 Hippo通路參與NaAsO2對PC12細(xì)胞活力的影響與對照組相比，NaAsO2(40 μmol·L-1)組細(xì)胞活力降低(P<0.01)；XMU-MP-1組細(xì)胞活力無影響；與NaAsO2組比較，XMU-MP-1+NaAsO2組細(xì)胞活力明顯增加(P<0.01)。

2.3 Hippo通路參與NaAsO2對PC12細(xì)胞形態(tài)的影響與對照組相比，NaAsO2組細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)闄E圓形；XMU-MP-1組細(xì)胞形態(tài)無影響；與NaAsO2組比較，XMU-MP-1+NaAsO2組細(xì)胞總數(shù)量和平均長度均增加(P<0.05)。

2.4 Hippo通路參與NaAsO2對SYN、PSD95突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響與對照組相比，NaAsO2組SYN、PSD95蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；MU-MP-1組SYN、PSD95蛋白表達(dá)無影響(P>0.05)；與NaAsO2組比較，XMU-MP-1+NaAsO2組SYN、PSD95蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。

3 討論

砷可通過抑制神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、成熟和神經(jīng)元遷移導(dǎo)致中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷[5]。本實(shí)驗(yàn)染砷組細(xì)胞數(shù)量變少、細(xì)胞間距變大、形態(tài)由長梭形變?yōu)閳A形或橢圓形。CCK-8實(shí)驗(yàn)也顯示砷處理的活細(xì)胞數(shù)量呈時(shí)間、劑量依賴性下降。

突觸形成是突觸可塑性的一個(gè)重要指標(biāo)，突觸丟失可導(dǎo)致認(rèn)知缺陷[6]。SYN和PSD95作為突觸相關(guān)蛋白，在維持突觸的正常功能和突觸可塑性中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在患有阿爾茨海默病大鼠腦組織中，PSD95、SYN蛋白的表達(dá)下調(diào)[7]，本實(shí)驗(yàn)中，NaAsO2導(dǎo)致PC12細(xì)胞中PSD95、SYN蛋白的表達(dá)降低，伴隨神經(jīng)突起縮短，形態(tài)呈圓形或者扁圓形改變。提示，NaAsO2影響突觸蛋白PSD95、SYN的表達(dá)，損傷神經(jīng)突起，細(xì)胞活性降低，影響神經(jīng)生長發(fā)育。

Hippo通路抑制劑XMU-MP -1抑制MST1/2活性從而抑制下游蛋白LATS1的磷酸化。在本實(shí)驗(yàn)中，XMU-MP -1預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)NaAsO2誘導(dǎo)的PSD95、SYN蛋白水平的下調(diào)、細(xì)胞長度、活力降低，提示Hippo通路參與NaAsO2對PC12細(xì)胞活力、形態(tài)和突觸蛋白的影響。然而，NaAsO2是如何通過Hippo通路下調(diào)突觸蛋白PSD95、SYN的表達(dá)從而造成PC12細(xì)胞損傷的，仍需進(jìn)一步的探討。