王 剛，謝 雅，楊麗君，覃曉莉，趙方毓，，向家鵬，何一多，陳顯兵，

(1.湖北民族大學醫(yī)學部，2.湖北民族大學附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000)

根據第七次全國人口普查結果顯示，截止2020年我國65歲及以上人口約有1.9億人，占總人口的13.5%，與第六次普查相比上升了4.63%，現已成為世界上老齡化速度最快的國家之一[1]。研究顯示，在人體衰老的進程中，大腦是最先衰老的器官之一，腦衰老可誘發(fā)阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病等多種神經退行性疾病，給老年人的健康帶來嚴重影響。

線粒體自噬是一種選擇性的自噬，可特異性的清除功能失調或受損的線粒體，是維持線粒體穩(wěn)態(tài)及功能的重要途徑[2]。在衰老的進程中，存在大量錯誤折疊的蛋白質及功能老化的線粒體，且隨著年齡的增加，線粒體自噬的水平逐漸減弱，對受損細胞器和蛋白的降解能力降低，同時自噬水平的減弱也加速衰老的進程[3]。腦衰老會引起多種機體功能障礙，其中以學習記憶功能減退最為突出。研究顯示PTEN誘導假定激酶1(Pink1)/E3泛素-連接酶活性帕金森病蛋白2(Parkin)介導的線粒體自噬與學習記憶能力有著密切的關系，且Pink1、Parkin基因的突變可誘發(fā)線粒體自噬異常，使受損線粒體聚集增多從而引起神經元和膠質細胞損傷以及神經軸突退化變性，這也是神經系統(tǒng)疾病的主要致病機制之一[4]。此外Pink1/Parkin介導的線粒體自噬在異常線粒體清除，緩解突觸消失和認知損害方面也發(fā)揮著重要的作用。

延齡草(Trilliumtschonoskiimaxim，TTM)為湖北省恩施州土家族地區(qū)珍貴藥材，味甘、性平，有小毒，其活性成分皂苷類具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、改善心功能及抗衰老等作用[5-6]。前期研究顯示，TST具有延緩衰老、促進學習記憶等功效[7-8]，但作用機制尚未完全闡明。本研究通過給大鼠注射D-gal誘導衰老模型，探究延齡草總皂苷(total saponins fromTrilliumtschonoskiimaxim，TST)對D-gal誘導的衰老大鼠認知功能及線粒體自噬相關蛋白表達水平的影響，深入探討其作用機制，為延齡草總皂苷延緩衰老尤其是延緩腦部衰老作用提供現代生物學依據。

1 材料與方法

1.1 動物選取SPF級雄性SD大鼠50只，8周齡，體質量達(220±20) g，購自湖北省動物實驗中心，許可證號：SCXK (鄂)2015-0018。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，飼養(yǎng)溫度保持在22 ℃～26 ℃、相對濕度保持在50%～55%之間，12 h自然交替給予照明，自由進食飲水。本次實驗研究經湖北民族大學醫(yī)學倫理委員會批準同意進行。

1.2 藥物與試劑藥材采自恩施州，由湖北民族大學中藥實驗室殷智教授鑒定為延齡草植物的干燥根莖(TTM)。TST由該校中藥學實驗中心自制，除去藥材非藥用部位及泥土雜質后，經60 ℃恒溫箱干燥后進行粉碎處理，將藥材粉末置于圓底燒瓶后加入適量75%乙醇浸泡萃取，將提取后的藥液過濾并濃縮干燥，得TST總提取物。加入雙蒸水，將總提取物完全溶解，采用飽和正丁醇再次萃取，減壓濃縮干燥，得到含量為61.48%TST。通過TST對照品制作標準曲線，測定得總皂苷含量為14.72 mg·g-1生藥。

D-gal(批號：G5388)購自美國Sigma-Aldrich試劑公司，Anti-rabbit IgG(批號：7074S)購自CST 公司，Parkin(批號：bs-1865R)購自博奧森生物公司，尼氏(Nissl)染液(批號：C0117)、β-actin(批號：0831171710)、PINK1(批號：AF7755)、LC3(批號：AF5225)、p62(批號：AF5312)及Beclin1(批號：AF5123)購自碧云天生物公司，免疫組化試劑盒購自邁新生物公司。

1.3 儀器酶標儀(1510型)購自Thermo Scientific公司；Morris水迷宮系統(tǒng)(DMS-2型)購自中國醫(yī)學科學院藥物研究所；Western印跡全套設備購自美國Bio-Rad公司；熒光顯微鏡(Eclipse80i)購自日本Nikon公司；-80 ℃冰箱購自SANYO公司；全自動曝光成像系統(tǒng)(Tanon-5200)購自上海天能科技公司。

1.4 動物分組、造模及干預方法采用隨機數字表法將實驗大鼠分為5組：正常對照組(Normal control)、模型組(D-gal model)、TST低、中、高(TST50、100、200 mg·kg-1)劑量組，每組10只。模型組及TST各劑量組的大鼠經頸背部皮下注射D-半乳糖(D-gal，100 mg·kg-1，注射容積為10 mL·kg-1·d-1)構建大鼠腦衰老模型，Normal control注射等量生量鹽水，連續(xù)注射6周。TST各劑量組每日分別給予50、100、200 mg·kg-1的TST進行灌胃干預，Normal control和D-gal model每日給予等體積的雙蒸水灌胃，連續(xù)灌胃6周。

1.5 檢測指標

1.5.1Morris水迷宮 水迷宮實驗在封閉隔音、無光環(huán)境中進行，于造模d 36～40行定位航行實驗：系統(tǒng)自動將圓形水池分為四個象限，在第三象限放置一個略低于水面0.6～1 cm的圓形逃生平臺，設定好水中游泳最長時間為60 s，每組7只大鼠進行實驗。將大鼠面向池壁分別沿1、2、4象限邊緣緩慢放下，此時系統(tǒng)記錄大鼠游泳軌跡和上平臺時間，在大鼠掉入水后由于求生本能會尋找逃離水的方法，若在60 s內沒有找到逃生平臺則需人為引導站在臺上并停留15 s使其形成記憶，記錄并分析大鼠在d5的平臺潛伏期；水迷宮實驗的d 6休息，d 7行空間探索實驗：將求生平臺撤去，大鼠沿第一象限邊緣放入，記錄60 s內大鼠穿越平臺次數、第一次上平臺及在目標象限停留時間，并進行統(tǒng)計學分析。

1.5.2組織灌注和取材 水迷宮實驗結束后，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。每組隨機選取7只大鼠，斷頭取海馬組織并儲存至-80 ℃冰箱；剩余3只大鼠麻醉后將其固定，用有齒鑷夾持胸骨劍突，剪刀垂直打開胸腔，從心尖稍左側位置插入穿刺針至升主動脈處，剪開右心耳。先快速灌注溫生理鹽水直至血液流凈，再換4%多聚甲醛溶液灌注固定，脫水后石蠟包埋切片備用。

1.5.3HE、Nissl染色 各組大鼠腦組織切片常規(guī)脫蠟后，蘇木精染色5～10 min，雙蒸水洗滌，0.5%鹽酸乙醇分化5～10 s，雙蒸水沖洗，0.2%氨水反藍40 s，雙蒸水沖洗，伊紅染色5 min后用雙蒸水速洗，再行脫水、透明、封固；標本切片脫蠟后，放入尼氏染液中染色15 min，雙蒸水洗滌數秒后進行脫水、透明、封固等步驟完成尼氏染色，最后掃描切片。

1.5.4免疫組化檢測 取制備的腦組織蠟塊樣本，4 μm切片，70 ℃烤片過夜，二甲苯梯度脫蠟3次，梯度乙醇水化。高壓鍋抗原修復5 min，待切片冷卻至常溫后再用PBS漂洗3次，每次3 min，甩干后滴加3%H2O2以清除內源性過氧化物酶。PBS漂洗3次甩干，滴加5%BSA封閉液，濕盒靜置30 min，甩去封閉液，滴加一抗Pink1和Parkin，4 ℃孵育過夜。次日室溫環(huán)境中復溫30 min，PBS漂洗3次甩干，滴加生物標記山羊抗兔IgG靜置1 h。PBS漂洗3次甩干，滴加DAB顯色液避光靜置10 min，此時可以鏡下觀察著色程度。純水洗滌數秒后蘇木精復染1 min，1%鹽酸酒精分化1 min，反藍30 s，無水乙醇2 min，二甲苯透明2 min，中性樹膠封固、切片掃描。

1.5.5海馬組織蛋白的提取及Western blot檢測 從-80 ℃低溫冰箱中取出適量海馬組織，按照1 mg組織加入9 μL裂解液、0.09 μL蛋白酶抑制劑的比例進行組織勻漿、超聲，勻漿液低溫高速離心(4 ℃，12 000 r·min-1，15 min)后取上清液，用BCA試劑盒測組織蛋白濃度并進行配平。

制備SDS-PAGE凝膠(12%分離膠，5%濃縮膠)，依次進行電泳、轉膜、封閉、洗膜、4 ℃孵育一抗Pink1(1 ∶1 000)、Parkin(1 ∶2 000)、p62(1 ∶1 000)、LC3(1 ∶1 000)、Beclin1(1 ∶1 000)過夜。次日洗膜、二抗孵育1 h、洗膜，最后采用化學發(fā)光法在成像系統(tǒng)下顯影并記錄其灰度值。以目標蛋白/內參蛋白(β-actin)的灰度值比值進行結果分析。

2 結果

2.1 TST對衰老大鼠學習能力的影響與正常對照組比較，D-gal模型組大鼠游泳軌跡雜亂，逃避潛伏期時間延長，第1次抵達求生平臺時間明顯增加(P<0.05)，穿越平臺次數減少，停留在目標象限時間縮短(P<0.05)。與D-gal模型組比較，TST各劑量組大鼠表現出一定的目標趨向性，逃避潛伏期明顯縮短，第1次抵達求生平臺時間明顯減少(P<0.05)，穿越求生平臺次數增加，停留在目標象限的時間明顯延長(P<0.05)(Fig 1，2，Tab 1)。

Tab 1 Results in spatial probe test of each

2.2 TST對衰老大鼠腦組織結構的影響如Fig 3所示，正常對照組海馬CA1區(qū)和皮質著色較深，神經元數目較多、排列整齊，胞漿豐富、胞核清晰飽滿；D-gal模型組海馬CA1區(qū)和皮質著色較淺，神經元稀疏、排列紊亂，細胞核丟失，可見細胞腫脹空泡化，其海馬組織內神經細胞的數量明顯少于正常組；TST各劑量組海馬CA1區(qū)和皮質著色較D-gal模型組深，細胞損傷性改變減輕，海馬組織內神經元尼氏小體的數量明顯多于模型組，且排列相對整齊，胞體之間的間隔較小(Fig 3)。

Fig 1 Results in place navigation test of each groupA：Swimming track in each group;B：The relative change of time of escape latency in each group.1：Normal control；2：D-gal model；3：D-gal+TST 50 mg·kg-1；4：D-gal+TST 100 mg·kg-1；5：D-gal+TST 200 mg·kg-1.#P<0.05 vs normal control，*P<0.05 vs D-gal model.

Fig 2 Results in spatial probe test of each groupA：The relative change of target-zone frequency in each group;B：The relative change of target-zone duration.1：Normal control；2：D-gal model；3：D-gal+TST 50 mg·kg-1；4：D-gal+TST 100 mg·kg-1；5：D-gal+TST 200 mg·kg-1.#P<0.05 vs normal control，*P<0.05 vs D-gal model.

2.3 TST對衰老大鼠海馬組織Pink1、Parkin表達的影響免疫組化結果顯示，與正常對照組相比，D-gal模型組海馬CA1、CA3、DG區(qū)Pink1、Parkin的陽性細胞明顯減少，著色較淡；與D-gal模型組相比，TST中、高劑量組Pink1、Parkin在海馬CA1、CA3、DG區(qū)的陽性細胞明顯增加，著色加深；低劑量組Pink1在CA1、CA3區(qū)陽性細胞明顯增加，DG區(qū)無明顯差別，低劑量組Parkin在CA1區(qū)陽性細胞增加，CA3區(qū)無明顯差別、DG區(qū)減少(Fig 4A)；Western blot結果顯示，與正常對照組相比，D-gal模型組海馬Pink1、Parkin蛋白表達降低(P<0.05)，與D-gal模型組相比，TST各劑量組海馬Pink1、Parkin蛋白表達增加(P<0.05)(Fig 4B)。

2.4 TST對衰老大鼠海馬組織LC3-Ⅱ、Beclin1、p62表達的影響與正常對照組相比，D-gal模型組海馬LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達明顯下降(P<0.05)，分別是正常組的0.49倍、0.77倍。p62的表達明顯上升，是正常對照組的1.98倍(P<0.05)，提示大腦海馬組織自噬活性降低，且海馬組織損傷嚴重；與D-gal模型組相比，TST低、中、高劑量組海馬LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯上升(P<0.05)，分別是D-gal模型組的1.74倍、2.09倍、2.58倍。Beclin1蛋白的表達量明顯上升(P<0.05)，分別是D-gal模型組的1.77倍、1.62倍、1.69倍。p62蛋白的表達量明顯下降(P<0.05)，分別是D-gal模型組的1.17倍、0.59倍、0.63倍，說明TST可以激活自噬，減輕海馬組織損傷(Fig 5)。

3 討論

在腦衰老進程中主要有反應遲緩、感覺遲鈍、記憶力下降等癥狀，其中學習記憶障礙為衡量腦衰老模型的重要指標[9]。研究表明[10]過量注射D-gal可誘導大量氧自由基的產生與累積，降低抗氧化酶活性，加速脂質過氧化物反應，損傷組織細胞，引起動物衰老。本研究通過Morris水迷宮實驗發(fā)現，大鼠注射D-gal后逃避潛伏期時間增加，穿越平臺次數及目標象限停留時間減少，均說明大鼠出現明顯的學習記憶障礙，而不同劑量TST干預可改善D-gal所致的模型大鼠學習記憶功能，表明TST具有改善衰老大鼠學習記憶障礙的作用。

研究顯示[10]，神經元衰老后，細胞內可見大量損傷的蛋白質和細胞器，而線粒體自噬是清除這類物質的主要途徑之一。Wu等[11]研究發(fā)現，Pink1/Parkin介導的線粒體自噬激活時，腦神經細胞的凋亡受到抑制，延緩腦部的衰老。Du等[12]研究發(fā)現，抑制Pink1/Parkin的蛋白表達，導致線粒體自噬水平下降，從而加重了AD大鼠認知功能障礙。本研究發(fā)現過量注射D-gal可引起衰老模型大鼠神經元受損和Pink1、Parkin的表達降低，通過TST干預后上調了海馬組織內Pink1和Parkin的表達，從而提高了對衰老大鼠海馬中受損線粒體的清除水平，因而表明TST改善衰老大鼠學習記憶障礙可能與上調Pink1/Parkin介導的線粒體自噬有關。

Fig 3 Morphology of hippocampus and cortex in each group by hematoxylin-eosin staining and Nissl staining HE staining(Ai 40×，Aii 400×)；Nissl staining(Ai 40×，Aii 400×).

Fig 4 Expression of Pink1，Parkin in hippocampus of each A.Immunohistochemistry staining；B.Relative expression of Pink 1 and Parkin.#P<0.05 vs normal control，*P<0.05 vs D-gal model.

LC3、p62、Beclin1對于調控自噬起著至關重要的作用。當自噬發(fā)生時，LC3會被酯化成LC3-Ⅱ，此時位于損傷線粒體外膜上的Pink1蛋白維持其激酶活性，同時招募Parkin蛋白并使其磷酸化，從而將受損的線粒體分離出來；活化后的Parkin蛋白繼而招募泛素結合因子p62，并與LC3-Ⅱ結合形成自噬小體并包裹受損的線粒體片段，隨后與溶酶體結合形成自噬溶酶體從而將線粒體片段降解[13-14]。LC3-Ⅱ可評估自噬體的穩(wěn)定狀態(tài)；p62可作為溶酶體降解活性的標志；Beclin1與自噬的活性呈正相關，也是自噬過程中最重要的調節(jié)因子。在本實驗的研究中，對比正常組，D-gal模型組海馬組織中p62蛋白的表達量有所上調，Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白的表達量下調；對比D-gal模型組，在各劑量TST干預后，大鼠海馬組織中p62的表達量下調，Beclin1、LC3-Ⅱ的表達量有所上調，說明TST能夠在一定程度上激活線粒體自噬，以延緩衰老。

綜上所述，TST干預能夠改善D-gal誘導的衰老大鼠認知功能障礙，并上調海馬組織中Pink1和Parkin的表達，激活線粒體自噬，減輕神經元損傷，從而發(fā)揮抗衰老作用。

Fig 5 Expressions of LC3-Ⅱ，p62 and Beclin1 in hippocampus of each