單玉棟，趙艷萌，靳曉飛，周曉紅，葉佳蓓，馬秀娟，田 甜，蔡國英，高維娟

(河北中醫(yī)學院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

腦卒中是人類第二大死亡原因，也是導(dǎo)致殘疾的主要原因，給家庭與社會造成巨大的經(jīng)濟損失，缺血性腦卒中是其最常見的類型之一[1]。因此，更有效的防治缺血性腦卒中是迫切需要解決的重要問題。由動脈閉塞引起的缺血性卒中，通過靜脈溶栓和血管內(nèi)血栓清除術(shù)進行快速再灌注是治療的重點。中醫(yī)認為，缺血性腦卒中屬于“中風”范疇，氣虛血瘀是其根本病因，補氣活血化瘀是治療要義。在治療上與現(xiàn)代醫(yī)學有異曲同工之妙。

中醫(yī)藥是治療腦卒中的重要療法之一，補陽還五湯是治療缺血性腦卒中和卒中致殘的經(jīng)典方劑，已經(jīng)有數(shù)百年的歷史。補陽還五湯出自清·王清任的《醫(yī)林改錯》，方名寓含治法，是補氣活血的代表方劑之一。從中醫(yī)的觀點來看，該湯用于改善經(jīng)絡(luò)氣血，促進血液循環(huán)，廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中的臨床防治。已有文獻[2]及本課題組前期研究表明，補陽還五湯通過調(diào)節(jié)自噬減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷，但其具體作用機制尚待進一步探究。

研究表明PI3K/AKT通路對腦缺血/再灌注后的細胞存活至關(guān)重要[3]。因此，本研究將通過大鼠大腦中動脈阻塞再灌注(middle cerebral artery occulusion/ reperfusion,MCAO/R)模型為研究對象，探討補陽還五湯是否通過PI3K/AKT通路調(diào)控自噬起到神經(jīng)保護作用。

1 材料

1.1 實驗動物♂，體質(zhì)量(220～250)g，SPF級，SD大鼠50只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2016-0011。本實驗經(jīng)河北中醫(yī)學院倫理委員會批準(批準文號：DWLL2020075)，所有操作符合實驗動物倫理要求。

1.2 主要試劑與耗材PI3K通路抑制劑LY294002(HY-10108)購自MCE公司；p62抗體(18420-1-AP)購自Proteintech公司；β-actin抗體(23660-1-AP)購自Proteintech公司；SDS-PAGE試劑盒、Cy3標記山羊抗兔IgG(A0516)、抗熒光淬滅封片液含DAPI(P0131)購自beyotime公司；LC3B抗體(L7543)購自SIGMA公司；LC3B抗體(ZRB100)購自SIGMA公司；PI3K抗體(4249S)、AKT抗體(4691S)、p-AKT抗體(4060S)購自CST公司；蘇木精染液(G1004-100ML)、伊紅染液(G1001-100ML)、TTC(G1017)購自servicebio公司；MCAO線栓(2636-A3)購自北京西濃公司；黃芪120 g，當歸6 g，地龍3 g，川芎3 g，赤芍5 g，桃仁3 g，紅花3 g，購自北京同仁堂有限公司后本課題組進行液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)，檢測補陽還五湯中黃芪甲苷含量為0.133 mg·g-1生藥、毛蕊異黃酮苷含量為0.139 mg·g-1生藥、芍藥苷含量為0.492 mg·g-1生藥、阿魏酸含量為0.04 mg·g-1生藥并做成凍干粉。

1.3 主要儀器51700全自動腦立體定位儀(Stoelting公司)；EG11508組織包埋機(Leica公司)；RM2255全自動輪轉(zhuǎn)切片機(Leica公司)；DM5000B光學顯微鏡(Leica公司)；THUNDER免疫熒光顯微鏡(Leica公司)；Fusion FX5 Spectra成像系統(tǒng)(Vilber公司)；Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀(Thermofisher公司)，恒壓電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動物分組、動物模型制備及腦室內(nèi)注射隨機將50只SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham)10只、模型組(Model)10只、補陽還五湯組(BYHWD)10只、PI3K抑制劑組(LY294002)10只與溶媒劑組(Vehicle)10只。補陽還五湯組大鼠造模完成后，應(yīng)用補陽還五湯凍干粉3.02 g·kg-1·d-1灌胃處理。大鼠MCAO/R模型制備參照本課題組前期基礎(chǔ)[4-5]，1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉，在頸前橫過矢狀面做中線切口，結(jié)扎頸外動脈遠端。4-0單絲尼龍線結(jié)扎頸外動脈近端，并將多聚賴氨酸包被的線栓經(jīng)頸內(nèi)動脈送入大腦中動脈，MCAO 2 h后撤回線栓并結(jié)扎端口。72 h后進行各項檢測。手術(shù)全過程使用加熱墊，使大鼠保持37 ℃肛溫。

LY294002溶于DMSO后加入Tween-80助溶，后用生理鹽水稀釋到20 μmol·L-1，MCAO造模前30 min取5 μL進行腦立體定位注射[6]。在顱骨鉆孔，將10 μL Hamilton注射器的針頭經(jīng)顱骨鉆孔插入左側(cè)腦室。定位注射參數(shù)[7]：以前囟為坐標零點定位，AP為0.8 mm；ML為1.4 mm；DV為3.6 mm，1 μL·min-1注射完畢后留針15 min拔針，消毒縫合。

2.2 大鼠神經(jīng)功能學評分采用盲法對各組大鼠進行Zea longa[8]評分：無神經(jīng)功能損傷0分；不能完全伸展對側(cè)爪1分；向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈2分；向手術(shù)對側(cè)傾倒3分；意識喪失4分。選擇1～3分大鼠入組。

2.3 腦梗死體積測定斷頭取腦，-20 ℃中冷凍30 min，切成冠狀面切片，厚度2 mm。放入小培養(yǎng)皿中，37 ℃ 0.5% TTC避光孵育20 min，中途翻面1次，吸出多余的TTC，放入4%多聚甲醛中固定24 h后拍照。梗死體積/%=(正常側(cè)半腦面積-梗死側(cè)正常面積)/2×正常側(cè)半腦面積×100%[9]。

2.4 HE染色觀察腦組織病理損傷大鼠麻醉后，心臟灌流快速取腦。4 ℃中性甲醛固定48 h，石蠟包埋，行冠狀切片，厚5 μm。進行HE染色，光學顯微鏡下拍照，觀察腦組織IP神經(jīng)細胞的損傷情況。

2.5 免疫熒光檢測LC3B表達石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、雙氧水封閉。免疫染色封閉液封閉15 min，LC3抗體(1 ∶200)4 ℃過夜。Cy3標記山羊抗兔IgG(1 ∶500)37 ℃避光孵育1 h，封片液封片。Leica熒光顯微鏡拍攝圖片并分析熒光強度。

2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白提取大鼠缺血側(cè)半暗帶蛋白，測定組織蛋白濃度。將蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉，將膜與一抗LC3(1 ∶1 000)、p62(1 ∶2 000)、PI3K(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶2 000)、AKT(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶20 000)37 ℃孵育1 h，混合ECL A/B液，置于多功能成像系統(tǒng)中顯影，用軟件對條帶灰度值進行分析。

3 結(jié)果

3.1 補陽還五湯對神經(jīng)功能缺損的影響與Sham組比較，大鼠MCAO/R后，Model組神經(jīng)功能缺損明顯(P<0.01)；與Model組比較，BYHWD組神經(jīng)功能缺損明顯改善(P<0.05)；BYHWD改善神經(jīng)功能缺損的作用被LY294002降低(P<0.05)；BYHWD組與Vehicle組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見Fig 1。

3.2 補陽還五湯對腦梗死體積的影響與Sham組比較，大鼠MCAO/R后，Model組腦梗死體積明顯增加(P<0.05)；與Model組比較，BYHWD組腦梗死體積明顯縮小(P<0.05)；BYHWD降低腦梗死體積的作用被LY294002所減弱(P<0.05)；BYHWD組與Vehicle組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 2。

Fig 1 Neurological scores of each 1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.##P<0.01 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

3.3 補陽還五湯對腦組織缺血半暗帶病理損傷的影響Sham組大鼠腦組織IP形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細胞形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)致密，核仁清晰；Model組腦組織IP空泡化嚴重，大量神經(jīng)元丟失和死亡，部分核溶解和凝聚；與Model組比較，BYHWD組大鼠腦組織IP損傷情況明顯緩解；BYHWD改善大鼠腦組織IP病理損傷的作用被LY294002所抑制；BYHWD組與Vehicle組比較無差異，F(xiàn)ig 3。

3.4 補陽還五湯對大鼠腦組織LC3B免疫熒光表達的影響大鼠MCAO/R后，與Sham組比較，Model組大鼠腦組織LC3B熒光表達升高(P<0.05)；與Model組比較，BYHWD組大鼠腦組織LC3B熒光表達降低(P<0.05)；BYHWD降低大鼠腦組織LC3B熒光強度的作用被LY294002所減弱(P<0.05)；BYHWD組與Vehicle組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 4。

Fig 2 Representative pictures of TTC staining and relevant quantitative 1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative pictures of brain sections stained with TTC;B:Percentage of volume.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

Fig 3 HE staining of brain tissues in each group of rats(Scale=50 μm)Representative images of HE staining in the rat cerebral ischemic penumbra.A:Sham;B:Model;C:BYHWD;D:BYHWD+LY294002;E:BYHWD+Vehicle.

3.5 補陽還五湯對各組PI3K，p-AKT，AKT蛋白表達的影響大鼠MCAO/R后，相對于Sham組，Model組通路蛋白PI3K與p-AKT/AKT表達明顯降低(P<0.05)；與Model組比較，BYHWD組通路蛋白PI3K與p-AKT/AKT表達明顯升高(P<0.05)；BYHWD的調(diào)控作用被LY294002所抑制(P<0.05)；BYHWD組與Vehicle組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 5。

3.6 補陽還五湯對各組自噬標志蛋白LC3、p62的影響Sham組比較，Model組LC3Ⅱ/Ⅰ表達升高，p62表達降低(P<0.05)；與Model組比較BYHWD組LC3Ⅱ/Ⅰ表達降低，p62表達升高(P<0.05)；BYHWD降低LC3Ⅱ/Ⅰ與升高p62表達的作用被LY294002所減弱(P<0.05)；BYHWD組與Vehicle組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 6。

4 討論

缺血性腦卒中是臨床常見病，當大腦某個區(qū)域的血液供應(yīng)因栓塞或血栓而突然中斷，進而導(dǎo)致相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙甚至腦細胞死亡時，就會發(fā)生缺血性腦卒中。缺血性腦卒中患者最初的臨床缺陷很大程度上是由大腦中低灌流、生物電異常的缺血性半暗帶所致[10]。隨著時間的推移，這一區(qū)域逐漸轉(zhuǎn)化為不可逆轉(zhuǎn)的損傷組織即缺血核心區(qū)。因此，梗死組織半暗帶恢復(fù)再通是治療首選，但腦缺血/再灌注會引發(fā)一系列生化和細胞損傷。

細胞自噬是腦缺血/再灌注后細胞死亡的重要途徑之一。自噬是一種自我保護的細胞分解代謝途徑，通過該途徑，不需要的蛋白質(zhì)被降解成代謝元素，并被循環(huán)利用，進而維持細胞自身的動態(tài)平衡和其正常生命活動[11-12]。在分子角度上，自噬主要由多個自噬相關(guān)基因(Atg)執(zhí)行，同時也受多種信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。自噬小體的形成過程需要兩個泛素樣蛋白Atg12和Atg8，LC3-Ⅰ存在于胞質(zhì)中，是Atg8蛋白家族中最具特征性的成員。在磷脂酰乙醇胺參與下LC3-Ⅰ偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ參與自噬體膜的形成，因此LC3Ⅱ/Ⅰ的變化反應(yīng)自噬程度[13]。p62(也稱SQSTM1蛋白)是負責溶酶體降解的自噬適配器，可以被自噬機制識別，運送到溶酶體并進行降解，故自噬發(fā)生時p62含量下降[14]。有研究表明[15-16]基于自噬的PI3K/AKT通路在腦缺血/再灌注損傷中扮演著重要的角色。

Fig 4 Representative immunofluorescence staining images of LC3B in each group n=3)1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative immunofluorescence staining images of LC3B in each group B:Analysis of LC3B mean fluorescence intensity of each group.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

Fig 5 The protein expressions of PI3K,p-AKT and AKT in each n=3)1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative Western blot images of PI3K,p-AKT and AKT levels.B:PI3K and p-AKT/AKT expression.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

Fig 6 The protein expressions of LC3Ⅰ,LC3Ⅱ and p62 in each n=3)1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative Western blot images of LC3Ⅰ,LC3Ⅱ and p62 levels.B:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio.C.p62 expression.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

本研究以大鼠MCAO/R模型，模擬腦缺血/再灌注過程。實驗結(jié)果表明補陽還五湯能夠改善大鼠腦缺血/再灌注引起的損傷，同時能夠使PI3K，p-AKT/AKT，LC3Ⅱ/Ⅰ表達升高，使p62表達降低。而LY294002能夠減弱補陽還五湯的保護作用。綜上所述，補陽還五湯能夠通過激活PI3K/AKT通路抑制自噬抗大鼠腦缺血/再灌注損傷。