邢喜平，何玉林，薛 娜，顏春魯，伍志偉,

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

鎘是自然界中含量豐富、分布廣泛的一種重金屬元素，同時，鎘及其化合物也是一類重要的重金屬污染物，可通過氧化應(yīng)激[1]等方式引起人和動物腎臟[2]、肝臟[3]、骨[4]等多種組織器官的炎性反應(yīng)和功能紊亂[5]。飲食是人體鎘暴露的最主要途徑，經(jīng)飲食攝入的含Cd食物和/或水進入腸道后，被腸道上皮細(xì)胞吸收，在腸上皮細(xì)胞的頂膜處通過質(zhì)子-金屬共轉(zhuǎn)運體二價金屬轉(zhuǎn)運體1(divalent metalion tranxporter-1，DMT1)、鈣-ATP酶轉(zhuǎn)運子、鋅轉(zhuǎn)運子等轉(zhuǎn)運體的介導(dǎo)進入體液循環(huán)并散布于人體的不同組織與器官，逐步造成相應(yīng)組織和器官的鎘蓄積。沉積在細(xì)胞中的鎘離子可與含羥基、巰基、氨基的蛋白分子結(jié)合形成鎘-蛋白質(zhì)復(fù)合物，或通過鎘與鈣、鋅競爭，從而抑制堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等多種酶的活性，引起細(xì)胞氧化損傷、代謝紊亂和凋亡[6]，然而，鎘暴露引起人和動物中毒具體機制依然不清。

鎘的攝入不僅會對人和動物肝、腎、睪丸等造成損傷，也會通過氧化損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫病理等途徑對腸道造成影響。腸道菌群作為腸道的重要組成部分，在調(diào)節(jié)機體生理平衡、維持機體健康、有效清除和促進體內(nèi)重金屬排泄方面發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，低劑量鎘暴露會導(dǎo)致小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，引起腸壁通透性增強和調(diào)節(jié)部分肝臟基因的表達水平，造成雄性小鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂和脂肪堆積，同時，重金屬暴露時間長短與腸道菌群變化程度呈正向關(guān)[7]。

目前，對于鎘中毒的治療以乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、1,2-二巰基丙醇(2,3-dimercaptopropanol，BAL)、二乙基二硫代氨基甲酸鈉(diethyl dithiocarbamate，DDTC)螯合劑類藥物為主。近年來，以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，應(yīng)用中藥復(fù)方、單味中藥或組分在治療鎘中毒方面取得了長足發(fā)展和明顯療效，但其機制尚不清楚。

本研究采用CdCl2腹腔注射法建立鎘染毒W(wǎng)istar大鼠模型，以具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等功效的黃芪多糖為調(diào)節(jié)劑，應(yīng)用高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)軟件分析其對鎘中毒大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用，以期從腸道菌群的角度揭示黃芪多糖對鎘造成肝腎損傷的改善。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量(180±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(甘)2015-0002，使用許可證號：SYXK(甘)2015-0005。實驗動物處理程序符合相關(guān)倫理要求，得到甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器黃芪多糖由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心藥物制劑實驗室提取(純度50%以上)；糞便基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)公司(DP180523)；CdCl2購自天津市巴斯夫化工公司(20161010)；鎘標(biāo)準(zhǔn)貯存溶液(100 mg·L-1)購自廈門海標(biāo)科技公司(2018324)。

1-14K高速低溫冷凍離心機，德國Sigma公司；CP214精密電子天秤，美國OHAUS儀器有限公司；Illumina PE250測序系統(tǒng)，美國Illumina公司；ZEENIT700石墨爐原子吸收光譜儀，德國Analytikjena公司。

1.3 方法

1.3.1動物分組與造模 40只SPF級Wistar雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組(BC)、黃芪多糖組(APS)、CdCl2組(CD)、黃芪多糖+CdCl2組(APS+CD)，每組10只，分籠飼養(yǎng)。SPF級飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(20～25) ℃，濕度40.0%～50.0%，12 h·d-1采光，自由攝食和飲水。

BC和APS組小鼠以0.9%無菌生理鹽水腹腔注射(2 mL·d-1)，其余各組腹腔注射CdCl2水溶液(1.5 mg·kg-1·d-1)，每周5次，持續(xù)處理5周，以建立鎘染毒大鼠模型[8]。

1.3.2動物給藥 CD和APS+CD組于每次腹腔注射CdCl2前2 h，分別以生理鹽水和20 mg·kg-1·d-1黃芪多糖灌胃[19]；BC和APS于每次腹腔注射0.9%生理鹽水前2 h，分別以生理鹽水和20 mg·kg-1·d-1黃芪多糖灌胃；每日1次，持續(xù)處理5周。

1.3.3鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取0.1 mL鎘標(biāo)準(zhǔn)貯存溶液(100 mg·L-1)于100 mL容量瓶，用1% HNO3定容、稀釋成濃度為100 μg·L-1鎘標(biāo)準(zhǔn)使用液。吸取0.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0 μL鎘標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別置于100 mL容量瓶，用1% HNO3定容、稀釋成濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg·L-1鎘標(biāo)準(zhǔn)工作液；應(yīng)用石墨爐原子吸收光譜法測定其吸光度[9]。

1.3.4尿量及尿鎘檢測 于每周末次灌胃結(jié)束后，將動物單獨置于代謝籠中，收集24 h尿液和測量體積，連續(xù)進行5周；應(yīng)用石墨爐原子吸收光譜法測定尿液中鎘的含量[9]。

1.3.5肝腎中鎘殘留檢測 末次藥物和染毒處理24 h后，采用CO2窒息法處死大鼠，解剖、收集大鼠肝臟和腎臟。采用石墨爐原子吸收光譜法測定組織中鎘的含量[9]。

1.3.6肝腎病理學(xué)組織學(xué)檢查 切取解剖后大鼠部分肝腎組織，以無菌生理鹽水浸洗，經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋、切片后，采用HE染色法觀察各組大鼠肝臟、腎臟組織病理變化。

1.3.7DNA的提取、PCR檢測和測序 建模結(jié)束前24 h，每只大鼠隨機無菌收集新鮮糞便4粒，經(jīng)搗碎、混合均勻后，應(yīng)用QIAamp糞便總DNA提取試劑盒提取糞便總DNA，具體操作參照說明書；樣品總DNA 16S rDNA V3-V4區(qū)擴增與反應(yīng)參照文獻[10]進行，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測分析后，采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶；回收產(chǎn)物通過QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)定量分析，符合標(biāo)準(zhǔn)的純化回收產(chǎn)物送上海凌恩生物科技有限公司進行Illumina PE250測序。

1.3.8生物信息學(xué)分析 Illumina PE250測序所得PE reads經(jīng)overlap關(guān)系拼接、質(zhì)控和過濾后，應(yīng)用UPARSE 7.1軟件在97%相似性原則下進行操作分類單元(OTU)聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于OTU聚類分析數(shù)據(jù)，進行物種多樣性指數(shù)分析和測序深度檢測；基于GreenGene數(shù)據(jù)庫對OTU代表序列進行比對和物種注釋，在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程的建立以ZEENIT700石墨爐原子吸收光譜儀測得的吸光度(A)為縱標(biāo)準(zhǔn)、鎘標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線(Fig 1)，根據(jù)相應(yīng)數(shù)據(jù)和曲線計算得到回歸方程Y=0.0129X+5.0×10-5和相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。由此表明，濃度在0.5～3.0 μg·L-1鎘標(biāo)準(zhǔn)工作液吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

Fig 1 Cadmium standard curve obtained by calculation

2.2 尿量與尿鎘含量分析1～5周各組大鼠尿量的收集分析表明，正常大鼠(BC)24 h的平均尿量約為10.6 mL；腹腔注射0.1% CdCl2后，尿量隨處理時間的延長逐漸減少，在第4～5周時基本保持穩(wěn)定，與BC相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；經(jīng)黃芪多糖灌胃處理后，鎘染毒大鼠尿量回升，與CD相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。由此可見，黃芪多糖具有緩解鎘暴露大鼠尿量減少的作用，見Tab 1。

1～5周各組大鼠尿鎘含量檢測結(jié)果如Tab 2所示，BC大鼠的尿鎘含量約為1.07 μg·L-1，與APS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；腹腔注射CdCl2后，CD和APS+CD大鼠尿鎘含量隨注射時間的延長明顯增加，在第4周時達到峰值并保持相對穩(wěn)定，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與BC相比，差異極明顯(P<0.01)。由此可見，黃芪多糖灌胃對鎘染毒大鼠尿鎘含量影響不明顯，但可通過利尿作用促進體內(nèi)鎘的排除。

2.3 腎臟與肝臟鎘蓄積分析實驗大鼠腎臟和肝臟中鎘含量的石墨爐原子吸收光譜顯示，鎘染毒大鼠(CD)腎臟和肝臟鎘含量明顯增加，與BC和APS相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)黃芪多糖灌胃處理后，APS+CD腎臟和肝臟中鎘含量均下降，與CD相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見Tab 3。由此可見，黃芪多糖具有降低大鼠肝臟和腎臟中含量的功效。

2.4 大鼠肝腎組織病理學(xué)分析

2.4.1肝組織病理學(xué)分析 HE染色顯示，BC和APS組肝細(xì)胞排列規(guī)則、緊密，胞核輪廓清晰分明，肝小葉清晰可見，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇正常(Fig 2A，2C)；腹腔注射CdCl2后，肝細(xì)胞腫脹，部分區(qū)域呈現(xiàn)片狀壞死，胞核著色較淺，肝小葉邊界不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(圖Fig 2B)；黃芪多糖灌胃處理后，部分肝細(xì)胞腫脹壞死，細(xì)胞輪廓可見，胞核著色加深，肝竇走向正常、清晰，呈放射狀(Fig 2D)。

2.4.2腎組織病理學(xué)分析 HE染色鏡檢顯示，BC和APS組腎小管上皮細(xì)胞排列規(guī)則，管腔完整，胞核清晰可見、大小均一(Fig 3A，3C)；腹腔注射CdCl2后，CD腎組織細(xì)胞腫脹、壞死，腎小管結(jié)構(gòu)不完整，管腔內(nèi)出現(xiàn)蛋白樣沉淀，腎小球萎縮，細(xì)胞空泡化及炎性細(xì)胞浸潤(Fig 3B)；APS灌胃處理后，APS+CD腎組織細(xì)胞腫脹、壞死減輕，腎小管結(jié)構(gòu)趨于完整，炎性細(xì)胞浸潤和空泡減少，腎組織損傷改善明顯(Fig 3D)。

Tab 1 Effect of astragalus polysaccharides on urine volume of cadmium exposed n=10)

Tab 2 Effect of astragalus polysaccharides on cadmium content in urine of cadmium-exposed n=10)

Tab 3 Effect of astragalus polysaccharides on cadmium content in kidney and liver of cadmium-exposed n=10)

Fig 2 Histopathological examination of liverA：BC，B：CD，C：APS，D：APS+CD(×200)

Fig 3 Histopathological examination of kidneyA：BC，B：CD，C：APS，D：APS+CD(×200)

2.5 黃芪多糖對鎘染毒大鼠腸道菌群的影響

2.5.1OTUs聚類分析 原始序列經(jīng)數(shù)據(jù)過濾篩選獲得優(yōu)質(zhì)序列662 513條，平均長度為420 bp，占總序列數(shù)的99.87%。按照97%相似性原則對優(yōu)質(zhì)非重復(fù)序列進行OTU聚類分析，4組測序樣品共得到1408個OTU，其中BC為356個、CD為332個、APS為372個、APS+CD為348；4組共有OTU為223個；BC、CD、APS和APS+CD獨有OTU數(shù)分別為17、14、11和6，F(xiàn)ig 4提示，黃芪多糖灌胃有逆轉(zhuǎn)CdCl2注射引起的大鼠腸道菌群多樣性減少的作用。

Fig 4 Venn analysis of OTU existing in BC,CD,APS,and APS+CD

2.5.2Alpha多樣性分析 Alpha多樣性是基于樣本中OTU分類和序列數(shù)，通過計算Chao1、ace、shannon和simpson指數(shù)反映樣品中物種豐富度和均勻度的一種分析方法。Chao1和ace指數(shù)通常能反映樣本物種的相對豐度，即OTU的數(shù)目；shannon和simpson指數(shù)反映腸道細(xì)菌群落的多樣性，shannon指數(shù)越大、simpson指數(shù)越小，表明樣品物種多樣性越高。腹腔注射CdCl2后，大鼠chao1、ace、shannon指數(shù)明顯降低，simpson指數(shù)明顯升高，與BC相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)與黃芪多糖合并處理后，鎘染毒大鼠樣本chao1、ace、shannon指數(shù)明顯回升、simpson指數(shù)明顯回落(P<0.05)。數(shù)據(jù)表明，黃芪多糖提升了鎘染毒大鼠腸道細(xì)菌的相對豐度和多樣性，F(xiàn)ig 5。

2.5.3β多樣性分析 β多樣性主要用于分析不同樣本間腸道菌群組成的相似性。采用NMDS法對各樣本數(shù)據(jù)的β多樣性分析顯示，同一組別的重復(fù)樣本距離較近，聚集在一起；不同組別明顯分布于由NMDS1和NMDS2組成二維平面圖的不同區(qū)域，表明各組之間腸道菌群結(jié)構(gòu)區(qū)分明顯(Fig 6)。不同組別重復(fù)樣本的PCoA分析顯示，腹腔注射CdCl2后，CD與BC間距離拉大，經(jīng)黃芪多糖灌胃處理后，APS+CD與BC之間距離拉近(Fig 6)，表明黃芪多糖具有調(diào)節(jié)鎘暴露大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)向正常組過渡的作用。

Fig 5 Alpha diversity index (Chao,ace,Shannon and Simpson) analysis

Fig 6 Analysis of different samples by NMDS (A) and PCoA (B) methods

2.5.4腸道菌群結(jié)構(gòu)差異性分析

2.5.4.1門水平分析 按照0.97的相似性比對原則，經(jīng)OUT注釋分析表明，4組樣本共獲得11個菌門，分別為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、CandidatusSaccharibacteria、柔膜菌門(Tenericutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、螺旋體門(Spirochaetes)和迷蹤菌門(Elusimicrobia)；各樣本優(yōu)勢菌門均為Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria，三者之和占比均在96%以上。與BC比較，腹腔注射CdCl2后，Proteobacteria、Elusimicrobia和Fibrobacteres豐度明顯下降，F(xiàn)usobacteria和Actinobacteria豐度增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；經(jīng)黃芪多糖灌胃后，鎘染毒大鼠腸道中Firmicutes豐度極明顯下降，Bacteroidetes、Proteobacteria、Elusimicrobia和Fibrobacteres明顯增加(P<0.05或P<0.01)，F(xiàn)usobacteria在腸道中消失，出現(xiàn)Acidobacteria、Spirochaetes和Tenericutes，F(xiàn)ig 7A。

2.5.4.2屬水平分析 16份樣本共包含62個菌屬，Prevotella、Ruminococcus、Oscillibacter、Bacteroides、Flavonifractor、ClostridiumXlVa和Roseburia均為各樣品優(yōu)勢菌屬，豐度占總數(shù)的70%以上。腹腔注射CdCl2后，Ruminococcus、Bacteroides、Flavonifractor、Roseburia和Elusimicrobium豐度明顯下降，Lactobacillus、Lachnospiracea_incertae_sedis、Parasutterella、ClostridiumXlVb、ClostridiumXI、Intestinimonas和Fusobacterium豐度明顯上升，與BC相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；黃芪多糖灌胃后，鎘染毒大鼠腸道中Prevotella、Bacteroides、Parasutterella、Elusimicrobium和Barnesiella豐度明顯上升，Ruminococcus、Oscillibacter、Flavonifractor、ClostridiumXlVa、Roseburia、Lactobacillus、Ruminococcus2、Lachnospiracea_incertae_sedis、ClostridiumIV、ClostridiumXlVb、ClostridiumXI和Intestinimonas明顯下降，同時出現(xiàn)了Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，但Fusobacterium消失，與CD相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，F(xiàn)ig 7B。

3 討論

鎘經(jīng)消化道、皮膚、血液、淋巴液到達肝臟和腎臟后，在其內(nèi)大量蓄積，通過血管內(nèi)皮細(xì)胞變性、非實質(zhì)細(xì)胞空泡化、功能性蛋白失活、氧化壓力和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等多種途徑，導(dǎo)致部分肝腎組織缺血、細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核仁功能紊亂及炎性損傷[11]。在病理學(xué)上表現(xiàn)為，肝細(xì)胞腫脹、壞死，胞核著色較淺，肝小葉邊界不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤[12]；腎臟表現(xiàn)為腎小管結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞腫脹、壞死，管腔內(nèi)出現(xiàn)蛋白樣沉淀，腎小球萎縮，細(xì)胞空泡化及炎性細(xì)胞浸潤[11]。本研究中，鎘染毒大鼠肝臟和腎臟HE染色結(jié)果與上述結(jié)論一致。同時，課題組前提研究表明，鎘染毒后肝腎組織中MDA含量升高、SOD 活性降低、IL-2水平下降，提示肝腎組織的氧化壓力和炎性反應(yīng)增強[8]。

黃芪多糖為中藥黃芪的重要活性成分，可通過抗氧化、增強機體免疫功能、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、利水等作用改善和保護鎘中毒引起的肝腎損傷[13]。課題組前期研究證實，黃芪多糖灌胃可使鎘染毒大鼠肝腎組織中MDA含量下降、SOD活性增加、IL-2水平升高[11]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)黃芪多糖灌胃處理后，鎘染毒大鼠肝腎組織中鎘含量明顯下降、尿量增加、病理損傷減輕，兩實驗結(jié)果均證實黃芪多糖可通過上述作用改善由鎘暴露引起的肝腎損傷，但其發(fā)生的具體機制尚待進一步探究。

近年來，隨著腸道微生態(tài)研究的逐步深入，微生態(tài)作為機體的重要組織器官，其結(jié)構(gòu)和功能得到進一步揭示[14]。中藥來源的多糖既是人體所需的重要能量物質(zhì)和疾病治療的必要藥物組分，也是腸道菌群的天然底物。已有研究表明，藜麥多糖、人參多糖、麥冬多糖等以底物誘導(dǎo)的方式調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成，同時腸道菌群亦可通過底物代謝產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物促進腸道菌群的動態(tài)平衡和維持機體健康[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過黃芪多糖灌胃處理正常大鼠后，腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生了較大的變化。從門水平而言，F(xiàn)irmicutes和Fusobacteria豐度明顯下降，Bacteroidetes、Proteobacteria和Fibrobacteres明顯增加，Elusimicrobia消失，CandidatusSaccharibacteria、Acidobacteria、Tenericutes和Spirochaetes顯現(xiàn)。從屬水平而言，Prevotella、Bacteroides和Parasutterella豐度明顯上升，Ruminococcus、Oscillibacter、Flavonifractor、Roseburia、Lactobacillus、ClostridiumIV和ClostridiumXI明顯下降，同時出現(xiàn)了Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，但Fusobacterium消失。這一結(jié)果與吳莉等[16]基本一致。

鎘具有較強的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)作用，低劑量鎘的攝入就會引起腸壁細(xì)胞和蓄積組織或器官的代謝、分泌等功能異常，從而抑制菌群生長和降低細(xì)菌豐度，導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)及穩(wěn)態(tài)破壞，影響細(xì)菌排除體內(nèi)有害物質(zhì)和金屬離子的作用[17]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，從門水平而言，CdCl2的攝入明顯抑制了Proteobacteria、Elusimicrobia和Fibrobacteres細(xì)菌的生長，相應(yīng)細(xì)菌豐度下降，但促進了Fusobacteria和Actinobacteria生長，相應(yīng)細(xì)菌豐度增加；從屬水平而言，Ruminococcus、Bacteroides、Flavonifractor、Roseburia和Elusimicrobium細(xì)菌生長被抑制，相應(yīng)細(xì)菌豐度下降，但Lactobacillus、Lachnospiracea_incertae_sedis、Parasutterella、Clostridium XlVb、Clostridium XI、Intestinimonas和Fusobacterium細(xì)菌生長得到促進，細(xì)菌豐度上升。由此可見，鎘明顯影響了腸道菌群的結(jié)構(gòu)和細(xì)菌豐度，對肝腎造成了嚴(yán)重的損傷。

Fig 7 Relative abundances of top 10 phyla (A) and 20 genera (B) in each sample

經(jīng)黃芪多糖灌胃后，從門水平而言，鎘染毒大鼠腸道中Firmicutes細(xì)菌生長被限制，細(xì)菌豐度回落，Bacteroidetes、Proteobacteria、Elusimicrobia和Fibrobacteres細(xì)菌得到促進，細(xì)菌豐度回升；同時，F(xiàn)usobacteria在腸道中消失，出現(xiàn)了Acidobacteria、Spirochaetes和Tenericutes細(xì)菌。從屬水平而言，Prevotella、Bacteroides、Parasutterella、Elusimicrobium和Barnesiella細(xì)菌生長被促進、豐度回升，Ruminococcus、Oscillibacter、Flavonifractor、Clostridium XlVa、Roseburia、Lactobacillus、Ruminococcus2、Lachnospiracea_incertae_sedis、Clostridium IV、Clostridium XlVb、Clostridium XI和Intestinimonas細(xì)菌生長被抑制、豐度明顯回落；同時，出現(xiàn)了Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，但Fusobacterium消失。由此可見，黃芪多糖可在一定程度上通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)來改善鎘染毒大鼠的肝腎損傷。

總之，黃芪多糖和鎘的攝入均可改變大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與多樣性。然而菌群結(jié)構(gòu)的變化在不同的實驗研究報告中并不具有嚴(yán)格的規(guī)律性或一致性，其數(shù)據(jù)差異來源可能與實驗動物異質(zhì)性、飼養(yǎng)方式、腸道菌群的原始組成、鎘的注射劑量、處理時間、DNA提取方式、測序技術(shù)平臺和分析設(shè)定參數(shù)等因素有關(guān)。目前，鎘染毒實驗多選用大鼠、小鼠、家兔等為實驗動物，以吸入、飲食和腹腔注射的方式建立實驗動物模型。在本研究中，選用與人親緣關(guān)系較近的嚙類動物—大鼠，采用腹腔注射的方式能夠快速、準(zhǔn)確、科學(xué)地建立鎘染毒大鼠動物模型，在實驗設(shè)計和操作中盡量減少由于上述因素帶來的偏差。雖然腹腔注射能夠有效控制小鼠攝入體內(nèi)的鎘劑量和快速建立動物模型，但無法完全切實模擬人體正常攝入重金屬鎘的方式，從而導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)與結(jié)果在不同的實驗中出現(xiàn)一定的偏差。

腹腔注射CdCl2后，重金屬鎘可通過腸壁吸收、體液輸送至腸腔、肝臟和腎臟，引起機體組織功能分泌異常，從而直接或間接導(dǎo)致大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)生理平衡狀態(tài)破壞，使得有害菌的種類和數(shù)量增加，有益菌的種類和數(shù)量相對減少或消失，嚴(yán)重抑制了菌群解毒和排毒的功能。隨著重金屬污染程度的日益加劇，采用重金屬實驗動物模型從腸道菌群結(jié)構(gòu)角度揭密鎘暴露對人體組織器官的功能危害的機制顯得尤為必要。然而，目前對于鎘中毒的治療及體內(nèi)蓄積鎘的驅(qū)除，多采用具有吸附功能的螯合劑藥物，通過螯合方式排出體外，但其仍然存在一定的安全性與有效性隱患。天然藥物或其組分具有調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)能力強、解毒作用明確、來源廣泛、毒副作用小、安全性高等優(yōu)點，而成為目前預(yù)防重金屬中毒的重要研發(fā)焦點。