曾 凡，陳柏屹，王 康，米倚林，段 航，廖小林,4，鄺高艷，盧 敏

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一中醫(yī)臨床學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院四肢關(guān)節(jié)科，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.懷化市中醫(yī)院小兒骨科，湖南 懷化 418000；4.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種常見、多發(fā)的慢性筋骨疾病，疼痛為大多數(shù)患者就醫(yī)的首要癥狀[1]，因此，目前KOA治療目的主要集中在減輕炎癥，最大程度減少疼痛并維持關(guān)節(jié)功能。非甾體類抗炎藥是KOA疼痛治療的基石，但療效有限，并且長(zhǎng)期使用此類藥物產(chǎn)生的副作用給臨床醫(yī)生帶來了巨大的挑戰(zhàn)。由于KOA為一種慢性疾病，長(zhǎng)期治療是不可避免的，因此，找到可長(zhǎng)期使用并安全有效的治療方案極為重要。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥中眾多經(jīng)典復(fù)方經(jīng)過現(xiàn)代科學(xué)諸多臨床試驗(yàn)驗(yàn)證其療效穩(wěn)定，安全可靠，近年來，在KOA的治療過程中愈加廣泛使用。加味獨(dú)活寄生合劑為《備急千金要方》中經(jīng)典中藥復(fù)方獨(dú)活寄生湯的基礎(chǔ)上加用黃芩、木瓜、威靈仙、制天南星四味中藥而成的改革制劑(湘藥制備字：Z20190064，批號(hào)：20191111)，本課題組前期通過大量臨床及基礎(chǔ)研究證實(shí)其可有效改善KOA患者臨床癥狀，療效可靠[2]。但由于中藥成分復(fù)雜，目前尚缺乏對(duì)其有效發(fā)揮顯著治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的科學(xué)認(rèn)識(shí)，阻礙了中藥成分的應(yīng)用，因此，亟需揭示中藥治療疾病的作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)因其具備良好的整體性與系統(tǒng)性，使其迅速成為應(yīng)用于闡明中藥方劑的活性成分和潛在作用機(jī)制的一種新策略，在新藥發(fā)現(xiàn)、藥物再利用和合理配方發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究加味獨(dú)活寄生合劑發(fā)揮治療KOA作用的潛在靶點(diǎn)及通路，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證，以期為加味獨(dú)活寄生合劑的臨床合理應(yīng)用和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 加味獨(dú)活寄生合劑治療KOA的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1藥物化學(xué)成分檢索與篩選 將加味獨(dú)活寄生合劑中包含的19味中藥依次輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)[4]進(jìn)行檢索相關(guān)化學(xué)成分的藥動(dòng)力學(xué)特性(ADME)參數(shù)，設(shè)定類藥性(drug likeness，DL)≥0.18及口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30進(jìn)行篩選，獲得藥物的主要活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息，不符合TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選條件的藥物則借助中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM)數(shù)據(jù)庫查詢，篩選條件設(shè)為校正后P值<0.05及分?jǐn)?shù)截?cái)嘀怠?0[5]。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)將加味獨(dú)活寄生合劑中有效成分靶點(diǎn)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.1.2膝骨關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn) 從GeneCards、OMIM和GEO 3個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲取KOA疾病靶點(diǎn)。其中，在GEO數(shù)據(jù)庫中獲得的基因數(shù)據(jù)集使用R軟件(version 3.6.2)中的Limma軟件包在|log FC|值>0.5的篩選條件下對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得KOA的差異表達(dá)基因。將上述3個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲得的所有KOA相關(guān)基因進(jìn)行匯總?cè)ブ?，獲得KOA相關(guān)靶點(diǎn)。

1.1.3藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 KOA相關(guān)靶點(diǎn)與“1.1.1”中獲得的藥物活性成分靶點(diǎn)相映射，獲得加味獨(dú)活寄生合劑治療KOA的作用靶點(diǎn)，即藥物-疾病共同靶點(diǎn)，制作Venn圖，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建加味獨(dú)活寄生合劑活性成分-疾病靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.4靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建 將藥物-疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)進(jìn)行分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并借助 Cytoscape軟件計(jì)算相關(guān)拓?fù)鋮?shù)，分析PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)中某個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連線數(shù)量稱之為度(degree)，度值越大，表示該節(jié)點(diǎn)在所構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中越重要。利用R軟件，根據(jù)度值大小繪制排序圖，篩選出核心靶點(diǎn)。

1.1.5交集基因GO富集與KEGG通路富集分析 借助Metascape數(shù)據(jù)庫[6](http：//metascape.org)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。P<0.01被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的，前20個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，根據(jù)基因比率，以直方圖顯示。

1.1.6分子對(duì)接 選取PPI圖中度值最大的疾病靶點(diǎn)蛋白通過PDB數(shù)據(jù)庫獲取三維結(jié)構(gòu)，經(jīng)AutoDockTools1.5.6軟件去水、加氫等處理后，與加味獨(dú)活寄生合劑中的主要活性成分分別作為受體和配體導(dǎo)入AutoDock Vina1.1.2軟件中進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)結(jié)合能是否小于0初步判定配體與受體能否自發(fā)結(jié)合，當(dāng)結(jié)合能絕對(duì)值大于5.0代表擁有較強(qiáng)結(jié)合能力[7]。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1動(dòng)物選取與倫理聲明 24只成年新西蘭正常雄性健康白兔(體質(zhì)量2.0～2.5 kg)購自湖南太平生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湖南)2020-0005，檢疫合格后單獨(dú)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的日常飼料和飲水由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。本實(shí)驗(yàn)已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(倫理編號(hào)：LLBH-202006190001)。

1.2.2 主要試劑及儀器加味獨(dú)活寄生合劑購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科(批號(hào)：20191111，湘藥制備字：Z20190064)。方藥組成：桑寄生18 g，獨(dú)活6 g，當(dāng)歸12 g，杜仲12 g，牛膝6 g，秦艽6 g，細(xì)辛3 g，川芎6 g，黨參12 g，茯苓12 g，肉桂3 g，防風(fēng)6 g，木瓜12 g，白芍10 g，甘草3 g，熟地黃15 g，制天南星6 g，黃芩6 g，威靈仙12 g。每瓶250 mL，含生藥量為0.664 kg·L-1。白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：CSB-E06900Rb、CSB-E06998Rb)，Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶3(Caspase 3)ELISA試劑盒(江萊生物公司，批號(hào)：JL10071、JL33424)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1(AKT1)、β-肌動(dòng)蛋白抗體(β-actin)(美國Proteintech公司，批號(hào)：60203-2-Ig、66009-1-Ig)。

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R)、多功能酶標(biāo)分析儀(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：MB-530)、電泳儀(中國北京六一儀器廠、型號(hào)：DYY-6C)、熒光定量RCP儀(Thermo，型號(hào)：PIKOREAL96)。

1.2.3模型建立、分組與給藥 將兔隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、中藥組(JDJM)，每組8只，模型組及中藥組均參考經(jīng)典Videman造模法，即采用高分子石膏將兔右下肢固定伸直位造模建立KOA模型[8]。6周后，在模型及中藥組中隨機(jī)選取3只兔拍攝膝關(guān)節(jié)X線片。X線見造模側(cè)關(guān)節(jié)間隙較健側(cè)狹窄，且可見軟骨下硬化或骨贅形成提示造模成功[9]。隨后，中藥組予以3.4 mL·kg-1加味獨(dú)活寄生合劑灌胃，劑量按體表面積劑量換算法計(jì)算得出，模型組每日給予等量蒸餾水灌胃，每日2次，持續(xù)4周。

1.2.4影像學(xué)及ELISA檢測(cè) 給藥4周后，每組隨機(jī)挑選5只兔右側(cè)膝關(guān)節(jié)予以X片拍攝；禁食禁水一晚，于d 2處死兔子，抽取關(guān)節(jié)液、血液室溫放置2 h后，于2 ℃、3 000 r·min-1(離心半徑10 cm)離心15 min，取上清-80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明，測(cè)定關(guān)節(jié)液及血清中IL-1β、TNF-α、BAX 、Caspase 3的含量。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn) 根據(jù)PPI分析結(jié)果，選取度值最大的關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1進(jìn)行驗(yàn)證。通過TRIzol法提取兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA，使用SYBR法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，引物采用Primer5軟件設(shè)計(jì)，由上海生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下：AKT1(上游：5′-AAGGATGAAGTCGCCCACAC-3′;下游：5′-GACGATTTCCGCACCGTAGA-3′)。PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為：95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6Western Blot檢測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn) 加入300 μL RIPA裂解液裂解0.025g關(guān)節(jié)軟骨組織10 min，在4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，然后用BCA法測(cè)定蛋白濃度。裂解液總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封膜90 min，將一抗溶液按一定比例稀釋(AKT1 ∶1 ∶2 000)與膜一起孵育，置于4 ℃冰箱中過夜。然后用二抗在室溫下孵育90 min，用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，曝光后用Quantity one軟件對(duì)曝光膜進(jìn)行掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 加味獨(dú)活寄生合劑-KOA共同靶點(diǎn)和活性成分篩選依據(jù)設(shè)定的檢索條件，19味中藥共獲得309個(gè)有效成分，其中白芍13個(gè)，川芎7個(gè)，茯苓15個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，黨參21個(gè)，獨(dú)活9個(gè)，秦艽2個(gè)，杜仲28個(gè)，熟地2個(gè)，防風(fēng)18個(gè)，黃芩36個(gè)，木瓜4個(gè)，牛膝20個(gè)，甘草92個(gè)，桑寄生2個(gè)，天南星7個(gè)，威靈仙7個(gè)，細(xì)辛8個(gè)，肉桂16個(gè)，去重后獲得194種活性成分、278個(gè)作用靶點(diǎn)。從GeneCard、OMIM數(shù)據(jù)庫中分別獲得2 564、2 593個(gè)與KOA相關(guān)的靶點(diǎn)。在GEO數(shù)據(jù)庫中，獲得包含5例正常受試者和6例KOA患者樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集(GSE169077)，分析后獲得差異表達(dá)基因345個(gè)，包含151個(gè)上調(diào)基因以及194個(gè)下調(diào)基因(Fig 1A,B)。所有靶點(diǎn)匯總?cè)ブ睾?，共獲得2 783個(gè)KOA相關(guān)靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與藥物作用靶點(diǎn)匹配，得到152個(gè)共同靶點(diǎn)(Fig 1C)。

2.2 加味獨(dú)活寄生合劑成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)分析將上述數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示152個(gè)共同靶點(diǎn)與加味獨(dú)活寄生合劑中180種活性成分相映射，其中作用靶點(diǎn)較多的活性成分為：槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)等。

Fig 1 Screening of JDJM-KOA common targets and active ingredientsA：Heatmap of the GSE169077 gene expression dataset;B：Volcano plot of the GSE169077 gene expression dataset;C：Venn diagram of JDJM-related and KOA-related targets.

篩選獲得的共同靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING平臺(tái)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化并計(jì)算度值，根據(jù)度值大小，針對(duì)前20個(gè)進(jìn)行繪制直方圖(Fig 2)，其中，AKT1為度值最大的靶點(diǎn)。

Fig 2 Key proteins in PPI network diagram

2.3 GO富集分析及KEGG通路富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)2.2中獲得的152個(gè)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果可分為生物過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組成(CC)3類，其中，生物過程占比最多(Fig 3 A-D)，說明生物過程起主要作用，內(nèi)容主要富集于炎癥反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路有關(guān)。因此，加味獨(dú)活寄生合劑可能主要通過抗炎和抗凋亡過程發(fā)揮對(duì)KOA的治療作用。KEGG富集分析顯示，加味獨(dú)活寄生合劑治療KOA的機(jī)制可能涉及314條相關(guān)通路，主要包括TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、p53信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路(Fig 3E)，這些通路均已被證實(shí)與KOA的病理發(fā)展密切相關(guān)。

2.4 分子對(duì)接驗(yàn)證基于PPI分析結(jié)果，本研究選用AKT1作為疾病靶點(diǎn)蛋白作為受體與加味獨(dú)活寄生合劑中的主要有效活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。加味獨(dú)活寄生合劑中主要活性成分與疾病靶點(diǎn)蛋白AKT1結(jié)合能均為負(fù)值，說明其能自發(fā)結(jié)合；AKT1與槲皮素、山奈酚、木犀草素對(duì)接結(jié)合能分別為：-6.0 kcal·mol-1、-5.9 kcal·mol-1、-6.1 kcal·mol-1，結(jié)合能均小于-5 kcal·mol-1，體現(xiàn)了較強(qiáng)的結(jié)合能力( Fig 4)。

2.5 加味獨(dú)活寄生合劑對(duì)KOA兔膝關(guān)節(jié)影像學(xué)的影響為初步評(píng)估加味獨(dú)活寄生合劑對(duì)KOA兔膝關(guān)節(jié)的影響，本研究通過拍攝其膝關(guān)節(jié)X片來評(píng)估KOA的嚴(yán)重程度。與對(duì)照組相比，模型組兔膝關(guān)節(jié)僵硬，屈伸活動(dòng)受限，X片示內(nèi)外側(cè)關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，部分出現(xiàn)軟骨下骨硬化以及骨贅形成；與模型組相比，中藥組外側(cè)關(guān)節(jié)間隙較均勻，以內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙變窄為主，偶見軟骨下骨硬化，未見明顯骨贅形成。參考Kellgren-Lawrence評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，結(jié)果顯示，中藥組評(píng)分明顯低于模型組(P<0.05) ( Fig 5)。

Fig 3 Bar chart of GO function and KEGG pathway enrichment analysisA：GO analysis results percentage chart;B：Top 20 significantly enriched terms in GO-BPs;C：Top 20 significantly enriched terms in GO-MFs;D：Top 20 significantly enriched terms in GO-CCs;E：KEGG pathway analysis

Fig 4 The docking diagram of AKT1 with Quercetin (A),Kaempferol (B) and Luteolin (C)

Fig 5 Effects of JDJM on severity of knee osteoarthritis in rabbits Median(Q25,Q75) (n=5)A：Anteroposterior X-rays of rabbit knee joint;B：Lateral X-rays of rabbit knee joint;C：KL score.*P<0.05 vs Control；#P<0.05 vs Model

Fig 6 Effect of JDJM on inflammatory cytokines in KOA 或6)A：Relative expression levels of IL-1β and TNF-α in serum;B：Relative expression levels of IL-1β and TNF-α in joint fluid;**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model.

2.6 加味獨(dú)活寄生合劑對(duì)KOA兔炎癥因子表達(dá)情況的影響本研究通過檢測(cè)各組兔IL-1β和TNF-α表達(dá)變化情況，評(píng)估加味獨(dú)活寄生合劑對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。與對(duì)照組比較，模型組兔血清中IL-1β、TNF-α含量均升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組血清中IL-1β、TNF-α含量降低(P<0.05)(Fig 6 A)。隨后，通過檢測(cè)關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α表達(dá)變化情況進(jìn)一步驗(yàn)證。模型組兔關(guān)節(jié)液中IL-β、TNF-α的表達(dá)明顯高于對(duì)照組；中藥組關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-1β含量較模型組明顯降低(P<0.05)(Fig 6 B)。

2.7 加味獨(dú)活寄生合劑對(duì)KOA兔凋亡相關(guān)因子表達(dá)情況的影響ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組兔血清及關(guān)節(jié)液中Caspase 3、BAX含量均升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥組Caspase 3、BAX含量降低(P<0.05)( Fig 7)。

Fig 7 Effect of JDJM on apoptosis factors in KOA 或6)A：Relative expression levels of Caspase 3 and Bax in serum;B：Relative expression levels of Caspase 3 and Bax in joint fluid;*P<0.05,**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model.

2.8 加味獨(dú)活寄生合劑對(duì)軟骨組織中AKT1表達(dá)的影響采用Real-time PCR、Western blot對(duì)加味獨(dú)活寄生合劑抗KOA核心靶點(diǎn)AKT1的mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。同對(duì)照組相比，模型組AKT1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.01)；同模型組相比，中藥組AKT1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.01)( Fig 8)。

Fig 8 Effect of JDJM on AKT1 n=4)**P<0.01 vs Control;##P<0.01 vs Model

3 討論

骨痹多因虛實(shí)之邪夾雜所致，而肝腎不足、正氣虧虛是其發(fā)病的重要內(nèi)因。獨(dú)活寄生湯為治痹經(jīng)方，功可補(bǔ)益肝腎，祛風(fēng)除痹，加味獨(dú)活寄生合劑在其基礎(chǔ)上增加黃芩、木瓜、制天南星、威靈仙，使其解毒除痹、祛風(fēng)除濕之效加強(qiáng)，可有效緩解患者疼痛等相關(guān)癥狀，運(yùn)用于臨床治療KOA卓有成效，表現(xiàn)出其抗KOA的巨大潛力。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探索加味獨(dú)活寄生合劑抗KOA的作用機(jī)制，并進(jìn)一步對(duì)其藥效進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)可能為加味獨(dú)活寄生合劑發(fā)揮主要作用的有效活性成分。槲皮素、山奈酚、木犀草素3者同屬于黃酮類化合物，是植物為抵御外界脅迫而產(chǎn)生天然化合物，諸多研究均證實(shí)槲皮素可以通過抑制炎癥相關(guān)信號(hào)通路、降低促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用，從而延緩OA進(jìn)展[10]。山奈酚因在多種疾病治療過程中表現(xiàn)出突出的抗炎和抗氧化作用而被廣泛關(guān)注，其可通過抑制MAPK相關(guān)途徑有效下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶水平，在一定程度上減緩了軟骨退變的程度[11]。施鳳超等[12]通過實(shí)驗(yàn)表明，木犀草素可通過降低血液及關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平，改善Treg/Th17細(xì)胞免疫失衡達(dá)到抗骨關(guān)節(jié)炎的作用。炎癥反應(yīng)貫穿KOA病程的始終。關(guān)節(jié)液中的IL-1β水平可在一定程度上反映骨關(guān)節(jié)炎的病變程度，是誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)分解代謝及炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，在OA關(guān)節(jié)的軟骨、滑液及滑膜中均可檢測(cè)到表達(dá)水平升高，其生物活性復(fù)雜多樣，能夠作用于骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展病理過程中諸多環(huán)節(jié)，加重關(guān)節(jié)的炎癥程度[13]；TNF-α是導(dǎo)致OA發(fā)病的關(guān)鍵細(xì)胞因子，IL-1β可通過與TNF-α的協(xié)同刺激激活多條炎癥相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)大量促炎因子的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性細(xì)胞外基質(zhì)損傷和軟骨破壞[14]。本研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，予以加味獨(dú)活寄生合劑治療后，血清及關(guān)節(jié)液中炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)水平較模型組同時(shí)出現(xiàn)明顯降低。因此，加味獨(dú)活寄生合劑很可能通過黃酮類化合物如槲皮素、山奈酚、木犀草素等關(guān)鍵有效成分發(fā)揮抗炎作用達(dá)到治療KOA的目的。

為進(jìn)一步探究加味獨(dú)活寄生合劑作用于KOA的關(guān)鍵靶點(diǎn)，本研究構(gòu)建了加味獨(dú)活寄生合劑-KOA蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，排名第一的靶點(diǎn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1(AKT1)可能為其治療KOA最重要的關(guān)鍵潛在靶點(diǎn)。軟骨內(nèi)骨化不僅是生理性骨骼生長(zhǎng)的重要過程，也是骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展過程中骨贅形成等病理表現(xiàn)的重要過程，AKT1在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中的軟骨鈣化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，降低AKT1水平可減少骨贅的形成[15]，同時(shí)，AKT1也是PI3K/AKT信號(hào)通路中重要下游靶點(diǎn)，Pan等[16]研究報(bào)道了抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可抑制炎癥和凋亡；Caspase 3和BAX是細(xì)胞凋亡過程的重要參與者和執(zhí)行者，Caspase 3在OA的軟骨高表達(dá)能夠調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡并破壞OA中結(jié)構(gòu)和生化穩(wěn)態(tài)，與OA的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[17]。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，予以加味獨(dú)活寄生合劑治療后，中藥組兔的KOA影像學(xué)嚴(yán)重程度較模型組明顯改善，血清及關(guān)節(jié)液中Caspase 3、BAX表達(dá)水平出現(xiàn)明顯降低，AKT1m RNA及蛋白表達(dá)水平均較模型組明顯下降。因此，抑制AKT1的表達(dá)可能在使用加味獨(dú)活寄生合劑治療KOA中起關(guān)鍵作用，然而可能還有其他分子機(jī)制尚未探索，需要進(jìn)一步研究。

通過功能富集分析可更加方便揭示和理解基因產(chǎn)物如何相互作用，進(jìn)一步探尋加味獨(dú)活寄生合劑在KOA的治療過程中發(fā)揮的潛在作用機(jī)制。從其GO、KEGG富集分析結(jié)果可見大量與KOA有關(guān)的GO功能及KEGG通路顯現(xiàn)出顯著富集，GO富集分析中生物過程占比最多，內(nèi)容主要富集于炎癥反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路有關(guān)，KEGG通路主要富集TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路等。TNF信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起顯著作用，通路中的TNF-α可誘導(dǎo)大量炎癥和分解代謝因子的產(chǎn)生并激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，加速軟骨破壞[14]；HIF-1信號(hào)通路可在軟骨細(xì)胞處于嚴(yán)重缺氧環(huán)境下出現(xiàn)過度激活，抑制軟骨細(xì)胞內(nèi)能量代謝和生物合成，影響軟骨細(xì)胞增殖，研究表明缺氧誘導(dǎo)因子參與關(guān)節(jié)軟骨的退化過程，在軟骨細(xì)胞存活及維持正常缺氧環(huán)境中軟骨細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[18]。以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果反映了在KOA疾病進(jìn)展過程中諸多分子、生物過程及信號(hào)通路出現(xiàn)紊亂，涉及炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激等信號(hào)通路表現(xiàn)出異?；钴S狀態(tài)。

綜上，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探究得出加味獨(dú)活寄生合劑治療KOA具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特征，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用機(jī)制可能與抗炎癥及抗凋亡相關(guān)。但是，本研究仍存在很多不足，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)只選取了少量核心靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，未完全驗(yàn)證涉及的相關(guān)信號(hào)通路，這也是今后課題組團(tuán)隊(duì)研究的方向，將進(jìn)行更加深入的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來加以驗(yàn)證加味獨(dú)活寄生合劑治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為加味獨(dú)活寄生合劑的臨床合理應(yīng)用提供更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。