武 旭，王 晶，鄒 婷，吳亞楠，問(wèn)思華，陳 曦，賀素容,2，祁春艷,2，劉 倩，李雅娟，年 婧，張 橋，趙重博

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，2.陜西省中藥飲片工程技術(shù)研究中心，3.陜西省中藥炮制技術(shù)傳承基地，4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 咸陽(yáng) 712046)

天南星具有燥濕化痰、祛風(fēng)止痙和散結(jié)消腫的功效，臨床多用于頑痰咳嗽、風(fēng)痰眩暈、中風(fēng)痰壅等證[1]。因其生品有毒，臨床使用前多以生姜白礬炮制，達(dá)到減毒增效的目的。天南星的毒性物質(zhì)報(bào)道較多的是毒針晶和毒蛋白，與生姜、白礬炮制后針晶結(jié)構(gòu)破壞，蛋白變性，從而降低天南星的毒性；同時(shí)，生姜可溫肺化痰止咳，白礬可燥濕化痰止咳，兩者同用有降低毒性，增強(qiáng)治療喘咳的作用[2]。但其發(fā)揮治療作用的藥效物質(zhì)和作用機(jī)制目前尚不清楚，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道表明炮制可影響天南星化痰止咳的作用，如采用小鼠酚紅排泄法比較天南星炮制前后“祛痰、平喘咳”的作用，結(jié)果顯示，天南星炮制前后均有化痰作用且炮制品不及生品[3]，小鼠氨水致咳模型比較止咳作用，炮制后止咳作用強(qiáng)于生品[2]。還有報(bào)道，生天南星長(zhǎng)于祛風(fēng)止痙，多用于破傷風(fēng)、癲癇、中風(fēng)；炮制后則多用于頑痰咳嗽。

“喘、痰”是慢性支氣管炎發(fā)作期的主證，病變部位涉及肺、脾、腎。從中醫(yī)角度來(lái)講，肺易貯痰，脾易生痰。痰濁藏于肺中，從而影響肺部的宣降功能，肺失其司則易感外邪，外邪束肺則痰喘發(fā)作[4]。由于肺部的痰蘊(yùn)導(dǎo)致氣道阻塞和呼吸不良，痰是哮喘的直接病因和發(fā)病機(jī)制。過(guò)敏性哮喘模型最接近人類哮喘的病理生理機(jī)制[5]。卵清蛋白(ovalbumin，OVA)是使用最早和最廣泛的過(guò)敏原，OVA致敏和霧化觸發(fā)的過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型在研究哮喘中使用頻次較高[6]。因此，本文對(duì)天南星炮制前后的化學(xué)成分進(jìn)行分析，探討炮制對(duì)其成分的影響。選取“喘證”經(jīng)典的OVA致敏的大鼠過(guò)敏性哮喘模型，初步探討天南星炮制前后對(duì)過(guò)敏性哮喘的治療作用；聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其治療“痰、喘”疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行映射分析和作用機(jī)制分析，探討天南星炮制前后祛痰平喘的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器1290 UHPLC超高效液相色譜儀(Agilent)，Q Exactive Focus高分辨質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific)，Heraeus Fresco17離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)，BSA124S-CW天平(Sartorius)，JXFSTPRP-24研磨儀(上海凈信科技有限公司)，明澈 D24 UV純水儀(Merck Millipore)，YM-080S超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司)，轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徠卡-2016，德國(guó))，JT-12S自動(dòng)組織脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，BMJ-A型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)，RS36型全自動(dòng)染色機(jī)(常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司)，PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)，數(shù)字切片掃描儀(Pannoramic 250，濟(jì)南丹吉爾電子有限公司)，霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.2 藥物與試劑LC-MS級(jí)甲醇、乙腈、甲酸品牌均為CNW Technologies。組織標(biāo)本固定液(10%中性甲醛固定液)，OVA(源葉生物科技有限公司)，鋁鎂佐劑(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，天南星購(gòu)自陜西恒瑞萬(wàn)壽路中藥材專業(yè)市場(chǎng)，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院趙重博副教授鑒定為天南星科植物天南星的干燥塊莖。制天南星按照2020年版《中國(guó)藥典》實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)址及軟件Pubmed(https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)，SwissTargetPrediction(http：//new.swisstargetprediction.ch/)，TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)，Uniprot(http：//www.uniprot.org/)，KEGG(http：//www.genome.jp/kegg/)，DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)等數(shù)據(jù)庫(kù)。chemdraw 19.0，Cytoscape3.8.0等軟件。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(180±20) g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(陜)2018-001。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)研究獲陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.5 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的天南星炮制前后成分分析

1.5.1供試品的制備 分別取生天南星和制天南星粉末各約3 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇30 mL，超聲提取45 min，冷卻至室溫并補(bǔ)足減失重量，離心，精密量取上清液18 mL，減壓濃縮至干，加60%乙醇使之溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中并定容，濾過(guò)，即得生制南星醇提樣[1]。

1.5.2色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Waters C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，洗脫梯度：0～3.5 min，95%～85% A；3.5～6 min，85%～70% A；6～6.5 min，70% A；6.5～12 min，70%～30% A；12～12.5 min，30% A；12.5～18 min，30%～0%；18～25 min，0% A；25～26 min，0%～95% A；26～30 min，95% A。柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速400 μL·min-1。

1.5.3質(zhì)譜條件 Q Exactive Focus高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行正、負(fù)2種模式掃描測(cè)定，參數(shù)如下：氣體流速：45 Arb，輔助氣體流速：15 Arb，毛細(xì)管溫度：400 ℃，全ms分辨率：70 000，ms/ms分辨率：17 500，碰撞能量：15/30/45，在NCE模式下，噴射電壓：4.0 kV(正)或-3.6kV(負(fù))。

1.5.4成分鑒定 使用XCMS軟件將生天南星和制天南星質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入。進(jìn)行保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對(duì)齊等工作，利用自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)含有MS/MS數(shù)據(jù)的峰物質(zhì)鑒定。

1.6 天南星炮制前后治療“喘、痰”的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.6.1成分篩選 通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS 對(duì)天南星進(jìn)行化合物表征后的主要成分，結(jié)合 TCMSP中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)中收錄的化學(xué)成分，按以下方式進(jìn)行篩選：(1)通過(guò)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)可以搜索得到的已有明確藥理活性的化合物；(2)含量相對(duì)較高的化合物[7]。

1.6.2化合物的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 整理目標(biāo)化合物，導(dǎo)入Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)種獲取SMILES結(jié)構(gòu)式，在Swiss Target prediction網(wǎng)站中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因，最后將靶點(diǎn)去重，整合，即得。

1.6.3“喘、痰”疾病靶點(diǎn)的獲取 在國(guó)內(nèi)外權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)知網(wǎng)、維普、萬(wàn)方、Web of Science、pubmed等查閱文獻(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“痰”與“氣道黏液分泌”有關(guān)，故選擇“phlegm”，“hypersecretion of airway mucus”定為“痰”的關(guān)鍵詞[8]，同法選擇“asthma”定位“喘”的關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相關(guān)疾病靶標(biāo)，篩選、整理、后得到疾病靶點(diǎn)。

1.6.4目標(biāo)化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將化合物導(dǎo)入Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)中，檢索SMILES號(hào)，然后在Swiss Target Prediction網(wǎng)站中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，設(shè)置“Probability”≥0.05，篩選整理目標(biāo)化合物的靶點(diǎn)。

1.6.5藥物-疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將成分靶點(diǎn)與“喘、痰”靶點(diǎn)取交集并繪圖。交集靶點(diǎn)則為目標(biāo)成分直接作用于“喘、痰”的靶點(diǎn)。在Cytosecape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖[9]。

1.6.6PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，選擇物種為“Homo sapiens”，隱藏沒(méi)有互作關(guān)系的節(jié)點(diǎn)，后保存數(shù)據(jù)為“.tsv”格式，在Cytoscape 3.7.2軟件中對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行節(jié)點(diǎn)度值分布(node degree distribution)，介數(shù)中心性(betweenness centrality)及接近中心性(closeness centrality)等拓?fù)鋮?shù)分析。并將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，得到核心靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6.7GO富集分析和KEGG通路分析 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)“天南星-‘喘、痰’”的交集靶點(diǎn)，進(jìn)行基因功能富集分析(gene ontology，GO)，探討藥物生物學(xué)過(guò)程功能中的分子功能(molecular function，MF)、生物過(guò)程(biological process，BP)和細(xì)胞組成(cellular component，CC)等基因靶點(diǎn)的功能。同時(shí)，在該數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)交集基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，探討藥物作用的生物通路，分析潛在靶點(diǎn)所富集的信號(hào)通路。

1.7 天南星炮制前后治療“痰、喘”的藥效

1.7.1試藥的制備 根據(jù)《中國(guó)藥典》，天南星臨床用量是(3～9) g，按照中間劑量6 g計(jì)算，人的平均體質(zhì)量為60 kg，平均1 d的用藥劑量為0.1 g·kg-1，大鼠以人劑量的6倍計(jì)算，即得給藥劑量為0.6 g·kg-1·d-1。稱取天南星和制天南星粉末(過(guò)4號(hào)篩)各300 g，加6倍量水浸提l h，濾過(guò)，減壓濃縮至生藥含量0.6 kg·L-1的提取液﹐-4 ℃冰箱保存[10]。

1.7.2動(dòng)物的給藥與分組 取50只10～14周齡雄性SD大鼠，隨機(jī)分為空白組、造模組，空白組12只，造模組38只。適應(yīng)性喂養(yǎng)后，造模組d 1、7和14用OVA 2 g·L-1與10 g·L-1氫氧化鋁的混懸液1 mL腹腔注射導(dǎo)致過(guò)敏，d 14～21 5% OVA霧化吸入激發(fā)哮喘，制造動(dòng)物模型。根據(jù)動(dòng)物行為學(xué)和肺組織HE染色對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，造模成功后，將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥組、天南星組、制天南星組，每組8只。分別灌胃0.6 g·kg-1·d-1生天南星，制天南星水提液(參考臨床劑量換算)，共35 d。陽(yáng)性藥組給與孟魯斯特納5 mg·kg-1霧化，空白組給予等體積的生理鹽水[11]。

1.7.3觀察指標(biāo) 各組大鼠于d 36用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，收集肺泡灌洗液，立即置于冰上，1 000 r·min-1離心10 min，取上清，-80 ℃保存，備用，檢測(cè)其炎性細(xì)胞分類百分比。取出肺組織，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，觀察肺組織PAS染色。

2 結(jié)果

2.1 基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的天南星炮制前后成分分析在正、負(fù)2種不同掃描模式下，共從樣品中鑒定出27個(gè)化學(xué)成分，見(jiàn)Tab 1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，天南星炮制前后成分大致相同，但也存在差異，差異成分有姜黃素、6-姜烯酚、樟腦、去甲基姜黃素等。制天南星增加的成分均來(lái)源于輔料生姜。

Fig 1 TIC diagrams of Arisaematis rhizoma in positive ion (A) and negative ion (B) modes and Arisaematis rhizoma preparatum in positive ion (C) and negative ion (D) modes

Tab 1 Identification of chemical composition

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果通過(guò)文獻(xiàn)挖掘和數(shù)據(jù)庫(kù)篩選等方法對(duì)天南星的化學(xué)成分進(jìn)行預(yù)測(cè)，在TCMSP中設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18，結(jié)合文獻(xiàn)挖掘和TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)得到天南星化合物見(jiàn)Tab 2。結(jié)合“2.1”項(xiàng)下的27種成分，共整合36個(gè)目標(biāo)化合物，獲取成分的靶點(diǎn)基因共1 369個(gè)。在Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)中將疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行整理，設(shè)置“Probability”≥0.4(中位數(shù))，最終獲取3 825個(gè)與“喘、痰”有關(guān)的疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析：將天南星化學(xué)成分作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)基因取交集(Fig 1)，共獲得天南星-疾病交集基因共239個(gè)；制天南星-疾病交集基因299個(gè)，使用Cytosecape 3.7.2軟件中構(gòu)建天南星“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 2)，網(wǎng)絡(luò)中共有335個(gè)節(jié)點(diǎn)(化合物35個(gè)節(jié)點(diǎn)，靶點(diǎn)300個(gè)節(jié)點(diǎn))，1 042條邊。結(jié)果顯示，天南星、制天南星治療“喘、痰”相關(guān)疾病多成分，多靶點(diǎn)的特征。其中“Degree”值較高的化合物有秋水仙堿、6-姜烯酚、亞油酸、去甲基姜黃素、阿魏酸、壬二酸、谷甾醇、豆甾醇、鳥苷、尿苷、異夏佛塔苷等，這些化合物可能為天南星治療“喘、痰”疾病中的關(guān)鍵成分。

“以往老百姓需要跑幾個(gè)部門，輾轉(zhuǎn)才能辦完的事項(xiàng)，如今一窗、一網(wǎng)、一人就能全部辦結(jié)，我們把非涉密的數(shù)據(jù)資源都集中在華為大數(shù)據(jù)中心，利用信息技術(shù)對(duì)政務(wù)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合共享，以實(shí)現(xiàn)跨部門信息的互聯(lián)互通，極大提升了行政效率，真正實(shí)現(xiàn)讓‘?dāng)?shù)據(jù)多跑路，讓群眾少跑路’的理念。”瀘州市委常委、副市長(zhǎng)劉春對(duì)《中國(guó)經(jīng)濟(jì)周刊》表示。

Fig 2 Intersection of chemical composition target and disease target

Tab 2 Composition of TNX in database

在Cytoscape2.7.2軟件中，利用StringApp插件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析。核心靶點(diǎn)詳見(jiàn)Tab 3。MAPK3，MAPK/ERK級(jí)聯(lián)通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞骨架重排等多種生物學(xué)功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附和分化等生物學(xué)功能。VEGFA生長(zhǎng)因子在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中起著重要的作用，VEGF能夠通過(guò)抑制炎癥及CD133+祖細(xì)胞調(diào)節(jié)保護(hù)肺部免受炎癥損傷。STAT3通過(guò)調(diào)節(jié)初生CD4的分化來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[12]。

在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)篩選的靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，設(shè)置P<0.05，表示富集結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)Fig 4(TOP15)。在天南星治療“喘、痰”相關(guān)疾病生物學(xué)過(guò)程中，分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、Zn離子結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合等；細(xì)胞組成主要富集在質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、膜整體組件、線粒體和細(xì)胞外泌體等；生物過(guò)程主要富集在RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、藥物反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA 模板化以及炎癥反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等過(guò)程。結(jié)果顯示，天南星通過(guò)多種生物途徑治療“喘、痰”相關(guān)疾病。

Fig 3 Component-Target-Disease networkOrange：chemical composition (yellow node refers to differential composition);Purple：disease;Green：disease target

Tab 3 PPI core targets

KEGG通路分析結(jié)果中，天南星炮制前后均主要通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)治療“喘、痰”等疾病，其中制天南星在通路中調(diào)控的靶點(diǎn)多于生品此外還涉及MAPK信號(hào)通路，癌癥中的蛋白多糖，Rap1信號(hào)通路，HIF-1 信號(hào)通路，結(jié)核病，F(xiàn)oxO信號(hào)通路，鈣信號(hào)通路和cAMP信號(hào)通路等，表明天南星炮制前后在治療“喘、痰”相關(guān)疾病過(guò)程中調(diào)控多條通路。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1模型評(píng)價(jià) 觀察造模組大鼠是否持續(xù)表現(xiàn)出口唇黏膜顯紫紅色、腹肌痙攣、喘息頻次變多、打噴嚏、咳嗽、抓耳部和臉部等行為學(xué)的改變，去除行為學(xué)沒(méi)有改變的大鼠。從空白組大鼠，造模組的大鼠中，隨機(jī)選取3只進(jìn)行肺組織病理切片，HE染色觀察，進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。如Fig 5所示，空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)較為正常，壁薄，無(wú)結(jié)締組織增生、增厚；各級(jí)支氣管結(jié)構(gòu)完整清晰，上皮細(xì)胞形態(tài)較為正常，排列較為整齊，未見(jiàn)明顯水腫；未見(jiàn)其他明顯病理變化。造模組大鼠肺泡上皮細(xì)胞變性壞死，壞死細(xì)胞胞核固縮或裂解，不規(guī)則，病變嚴(yán)重區(qū)域肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊，肺泡隔增厚。結(jié)果表明模型建立成功。

2.3.2大鼠BALF中炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 各組大鼠BALF中炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)百分比結(jié)果如Fig 6所示，與空白組相比較，模型組大鼠BALF中巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯上升；與模型組大鼠相比較，陽(yáng)性藥組大鼠BALF中巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯下降，天南星組大鼠BALF中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯下降，制天南星組大鼠BALF中巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯下降?？傮w來(lái)看，制天南星作用略優(yōu)于生天南星。

Fig 4 GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis (P<0.05)A-D：AR;E-H：ARP，A，E：MF;B，F(xiàn)：CC;C，G：BP;D，H：KEGG

Fig 5 Effect of allergic asthma model on lung tissues of rats(A：Control，B：Model building；100×)

3 討論

天南星，味苦，性溫，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥，已有 2 000 多年的藥用歷史，常常用于治療“痰”證，中醫(yī)認(rèn)為“痰飲病”可以誘發(fā)“哮病”，現(xiàn)代臨床以哮喘為多見(jiàn)。天南星作為有毒中藥，炮制對(duì)其毒性和功效的影響尤為重要。

本文應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)快速檢測(cè)了天南星和制天南星中的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)制天南星較原料中夏佛塔苷、棕櫚酸、亞油酸、精氨酸、沒(méi)食子酸、甘露醇等基礎(chǔ)物質(zhì)略有下降，據(jù)報(bào)道夏佛塔苷是關(guān)鍵抗炎活性成分；棕櫚酸與抗前列腺增生有較好的相關(guān)性；亞油酸對(duì)DPPH和ABTS+自由基具有一定的清除效果；精氨酸具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡、調(diào)控脂質(zhì)代謝等作用；沒(méi)食子酸可抑制結(jié)腸癌HCT-116和Caco-2細(xì)胞活性；20%甘露醇加溫至37 ℃靜脈滴注可減輕患者疼痛，降低患者靜脈炎的發(fā)生率等。同時(shí)制天南星中增加了姜黃素、6-姜烯酚、樟腦、去甲基姜黃素等成分，這些成分均來(lái)源于炮制輔料生姜，此外，精氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等成分既存在于天南星中又存在于生姜中。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)目標(biāo)化合物治療疾病的作用靶點(diǎn)，通過(guò)“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析，6-姜烯酚、秋水仙堿、亞油酸、去甲基姜黃素、阿魏酸、壬二酸、谷甾醇、豆甾醇、鳥苷、尿苷、異夏佛塔苷等成分在天南星炮制前后治療疾病中起到關(guān)鍵作用。鐘凌云等[3]通過(guò)對(duì)天南星中皂苷類成分的研究發(fā)現(xiàn)，皂苷類成分對(duì)胃黏膜有刺激作用，也可以增加氣管、支氣管分泌黏液，從而發(fā)揮去痰的作用。

Fig 6 Percentage count of inflammatory cells in BALF**P<0.01 vs Control，#P<0.05,##P<0.01 vs Model

Fig 7 PAS staining results of rat lung tissues (100×)A：Control；B：Model；C：Positive；D：AR；E：ARP

比較天南星和制天南星抗“喘、痰”的KEGG通路分析可知，天南星炮制前后均主要通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路治療疾病。不同的是，制天南星在通路中是直接調(diào)控PI3K、AKT1等關(guān)鍵靶點(diǎn)，而天南星是間接調(diào)控。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天南星炮制前后均對(duì)過(guò)敏性哮喘模型大鼠肺組織有改善作用，可降低大鼠BALF中的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞，制天南星略優(yōu)于生天南星，但組間并無(wú)顯著性差異。由此可見(jiàn)，天南星“炮制-增效”的機(jī)制可能是因?yàn)橛行С煞值脑黾?，進(jìn)而調(diào)控更多通路和靶蛋白參與的生物過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)“喘、痰”等疾病的治療。GO富集分析可知，其涉及RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、脂多糖的反應(yīng)等生物過(guò)程，體現(xiàn)出中藥天南星在治療“喘、痰”疾病中有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

PPI分析篩選出11個(gè)核心靶點(diǎn)。分別為STAT3、SRC、MAPK3、PIK3CA、RELA、ESR1、VEGFA、EGFR、MAPK8、IL-6、JAK1。氣道炎癥是哮喘的典型特征之一，緩解炎癥反應(yīng)可有效控制哮喘癥狀。研究發(fā)現(xiàn)哮喘幼年大鼠體內(nèi)，IL-21/STAT3通路被激活可能與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)增強(qiáng)以及肺組織受損有關(guān)。IL-21在多種與免疫相關(guān)的疾病中可檢測(cè)出IL-21的高表達(dá)水平，并隨著疾病的控制而表達(dá)下降。STAT3蛋白是IL-21的主要信號(hào)傳導(dǎo)因子，其磷酸化活化后可參與多種自身免疫性疾病產(chǎn)生和進(jìn)展過(guò)程[13]。RELA (p65) 是NF-κB家族成員之一，作為關(guān)鍵的抗凋亡信號(hào)和二聚體狀態(tài)下NF-κB最重要的功能亞基，RELA在中性粒細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮著重要的作用，而KLF-2/RELA的比例失衡能夠調(diào)控哮喘患者中性粒細(xì)胞的凋亡，并且隨著病情的加重，KLF-2/RELA比值逐漸降低[14]。VEGFA在肺組織，尤其是肺泡上皮中表達(dá)豐富，參與肺泡發(fā)育和成熟，可通過(guò)促進(jìn)前列環(huán)素產(chǎn)生、增加超氧化物歧化酶表達(dá)等維持肺的正常結(jié)構(gòu)和生理功能，并對(duì)肺損傷起修復(fù)作用;VEGFA、Periostin過(guò)度合成和分泌可能加重氣道和肺組織酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，加重氣道和肺組織損傷，引起肺功能降低，EGFR在哮喘的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，哮喘患者氣道的支氣管上皮、腺體、平滑肌等均可明顯觀察到EGF及EGFR的免疫反應(yīng)[15]。哮喘的病理特征之一是氣道平滑肌的增生與肥大，而SRC在氣道平滑肌的增殖與遷移中具有重要作用[16]。多種細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-6和IL-8，研究表明，哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中肺泡巨噬細(xì)胞分泌的IL-6和IL-8較對(duì)照組明顯增高，肺部受到過(guò)敏原刺激后，產(chǎn)生過(guò)多的IL-6和IL-8參與哮喘免疫炎性反應(yīng)發(fā)生與進(jìn)展[17]。由此可見(jiàn)，天南星可能通過(guò)這些核心靶點(diǎn)發(fā)揮治療“喘、痰”等肺部疾病的作用。

本實(shí)驗(yàn)在比較研究天南星炮制前后成分變化的基礎(chǔ)上，聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討了天南星炮制增效的原理可能是由于炮制后化學(xué)成分的增加，在治療“喘、痰”等疾病的藥理機(jī)制中共涉及299個(gè)核心靶點(diǎn)，作用調(diào)控124條信號(hào)通路。通過(guò)OVA致敏的大鼠過(guò)敏性哮喘模型，比較天南星炮制前后的藥效作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制天南星抗過(guò)敏性哮喘的作用優(yōu)于生品，其治療“喘、痰”等疾病的作用機(jī)制仍需深入研究。“藥物-成分-靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵成分分析，發(fā)現(xiàn)原料藥材與炮制輔料均在治療疾病的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而為臨床規(guī)范化應(yīng)用制天南星提供參考依據(jù)。此外，根據(jù)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘天南星有效成分的結(jié)果，天南星的化學(xué)成分還有待補(bǔ)充研究。