姚 雷，蔡海建，劉 鄧，陳立建，唐震海，都 建

(安徽醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.科研實驗中心、3.第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230032)

肝臟缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)長期以來被認(rèn)為是引起缺血性休克、肝切除和肝移植不良結(jié)果的主導(dǎo)因素[1]。缺血/再灌注損傷引起炎癥因子積聚，加劇器官急性排斥反應(yīng)發(fā)生，同時引起膽道并發(fā)癥，致使移植物失功。在IRI的防治中，之前的研究重點是保護(hù)肝臟實質(zhì)細(xì)胞，然而，最近的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells，LSECs)在早期再灌注過程中會出現(xiàn)功能和表型失調(diào)，并對鄰近細(xì)胞和肝臟疾病病理生理學(xué)產(chǎn)生負(fù)面影響[2]。LSECs是肝臟內(nèi)最豐富的非實質(zhì)細(xì)胞，維持肝內(nèi)微循環(huán)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。LSECs形成肝竇壁，與其他毛細(xì)血管不同，它們?nèi)狈τ薪M織的基底膜，細(xì)胞質(zhì)被開放的小孔穿透，使肝臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù)[3]，這種連接方式使得肝實質(zhì)細(xì)胞與肝竇間物質(zhì)交換更加便捷[4]；窗孔是一種動態(tài)結(jié)構(gòu)，肝臟的病理生理改變都會影響窗孔的大小改變，調(diào)控肝臟微循環(huán)[5]。血紅素加氧酶是催化血紅素降解的限速步驟，產(chǎn)生膽紅素、一氧化碳(CO)和鐵離子[6]，分解產(chǎn)物具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、改善微循環(huán)等作用[7-8]，尤其在臨床肝移植手術(shù)過程中，肝微循環(huán)在再灌注后的恢復(fù)極為重要。紫檀芪(pterostilbene，PTE)是從紫檀、藍(lán)莓等植物提取的天然酚類化合物。近年來發(fā)現(xiàn)，PTE具有良好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性而被普遍關(guān)注[9-10]。由于其3、5位甲基化特殊結(jié)構(gòu)，使其具備比其他酚類化合物，如白藜蘆醇、白皮杉醇更高的生物利用度以及更強的穩(wěn)定特性。有相關(guān)研究表明，PTE對肝臟缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用[12]，然而對于LSECs保護(hù)及具體途徑尚不清楚。本實驗通過原代提取LSECs為細(xì)胞模型建立體外氧糖剝奪模型(oxygen-glucose-serum deprivation/reoxygenation，OGD/R)，研究PTE通過保護(hù)LSECs使肝臟免受缺血/再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料C57BL/6J小鼠(雄性，6-8周齡)購于河南斯克貝斯生物科技技術(shù)公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2020-0005。PTE(批號：41876)購于MCE公司；胎牛血清(批號：2203013)、鏈霉素(批號：2149393)均購于Vivacell公司；無糖培養(yǎng)基(批號：2323273)購于Gibco公司；ECM(批號：34356)完全培養(yǎng)基購于Sciencell公司；HO-1抗體(批號：KK1123)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔(批號：KK1116)、山羊抗鼠二抗(批號：KK0824)購于成都正能生物公司；β-actin(批號：10021787)購于武漢三鷹公司；AST(批號：20211027)及ALT(批號：20211028)檢測試劑盒購于南京建成公司。

1.2 實驗方法實驗小鼠分為：假手術(shù)組、模型組(I/R組)、PTE處理組(10、20、40 mg·kg-1)。實驗前1 d對上述分組小鼠12 h禁食處理。(1)假手術(shù)組：1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，固定小鼠，于肋下緣與腹中線交點作縱向切口，裸露出第一肝門，眼科鑷小心游離出門靜脈和肝動脈，不夾閉肝葉供血，不進(jìn)行任何其他處理，最后縫合腹腔。(2)肝缺血/再灌注損傷模型組(I/R)：1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，固定小鼠，于肋下緣與腹中線交點作縱向切口，裸露出第一肝門，眼科鑷小心游離出門靜脈和肝動脈，止血夾夾閉肝中葉和左葉門靜脈，夾閉0.5 min觀察左葉和中葉同肝右葉對比明顯變白，臨時縫合腹腔創(chuàng)口，覆蓋無菌紗布，立即將小鼠置于37 ℃恒溫墊維持體溫恒定。持續(xù)缺血60 min，拆除縫合線，快速取下止血夾，0.5 min肝臟缺血部分逐漸恢復(fù)正常顏色，縫合腹腔，再灌注6 h后摘取眼球收集血液樣本，取肝臟樣本。(3)PTE處理組(10、20、40 mg·kg-1)：肝缺血/再灌注前1 h，小鼠腹腔注射3種濃度的PTE，再灌注6 h后眼球取血，取肝臟樣本。

1.3 LSECs原代細(xì)胞提取分組1%戊巴比妥鈉注射麻醉小鼠，沿腹股溝中線開放腹腔，留置針穿刺門靜脈，切開下腔靜脈，使用37 ℃預(yù)熱的0.5 mmol·L-1的EGTA灌流3 min，蠕動泵速率為60 r·min-1，換用37 ℃預(yù)熱的消化液對肝臟再灌注5 min，蠕動泵速率為40 r·min-1，至肝臟松塌有裂痕。剪下肝臟放入純培養(yǎng)基的平皿，撕碎讓肝細(xì)胞流出，200目濾網(wǎng)過濾未消化的組織，分離肝竇內(nèi)皮細(xì)胞使用Percoll梯度離心法和選擇貼壁法純化。LSECs分組為對照組、模型組、PTE處理組。對照組使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，無任何處理；模型組做缺氧復(fù)氧處理；PTE處理組使用不同濃度PTE(10、20、40 μmol·L-1)預(yù)處理6 h，再進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理。

1.4 小鼠血清ALT/AST測定各實驗組小鼠在手術(shù)完成后，使用眼科鑷摘去眼球取血，37 ℃靜置1.5 h，4 ℃(3 500 r·min-1，10 min) ，收取血清，按照檢測試劑盒說明書操作，在405 nm測定吸光度，分別計算ALT/AST含量。

1.5 肝組織病理學(xué)檢查小鼠肝臟缺血/再灌注后，離體分離在4%多聚甲醛固定。乙醇梯度脫水后包埋，蘇木精伊紅染色后封片，隨機選擇區(qū)域光學(xué)顯微鏡拍攝觀察。

1.6 透射電鏡觀察肝竇內(nèi)皮組織細(xì)胞根據(jù)上述方法分組，小鼠肝臟組織再灌注后，將肝臟標(biāo)本分割成1 mm3，立即放入5%稀釋濃度的戊二醛中固定，乙醇梯度脫水、塊染、滲透和包埋處理，使用超薄切片機獲得超薄切片，在透射電子顯微鏡(Talos L120C G2)觀察。

1.7 掃描電鏡觀察窗肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔按照上述分組，肝竇內(nèi)皮原代細(xì)胞提取后接種于24孔板，孔板下覆蓋14 mm細(xì)胞爬片，經(jīng)缺氧復(fù)氧步驟處理，5%稀釋濃度的戊二醛固定6 h，經(jīng)乙醇梯度脫水后，K850型臨界點干燥儀干燥，離子濺射儀涂上薄層金屬，并在場發(fā)射掃描電子顯微鏡下(Gemini SEM 300)觀察。

1.8 Western blot按照上述分組，原代細(xì)胞經(jīng)體外缺氧復(fù)氧步驟在RIPA裂解緩沖液中制備全細(xì)胞裂解物，經(jīng)恒壓SDS凝膠電泳采用恒流濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素轉(zhuǎn)印膜，放于封閉液中常溫封閉3 h。洗膜后常溫一抗孵育2 h，漂洗后室溫二抗于低速搖床上孵育1.5 h，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取圖像。使用ImageJ軟件定量。

2 結(jié)果

2.1 PTE處理對肝臟ALT、AST表達(dá)影響檢測各組血清ALT和AST水平，由Fig 1可得出，I/R組ALT和AST水平明顯上升髙(P<0.01)，同時PTE治療組血清ALT和AST水平較I/R組明顯降低(P<0.01)，說明PTE對小鼠肝臟有明顯保護(hù)作用。

2.2 PTE處理對肝臟結(jié)構(gòu)保護(hù)小鼠肝臟組織HE染色結(jié)果如Fig 2，假手術(shù)組(Fig 2A)肝細(xì)胞形態(tài)邊界完整，無任何病理性改變；I/R組(Fig 2B)核固縮，出現(xiàn)嚴(yán)重壞死，病理損傷明顯增加。經(jīng)3種劑量的PTE治療組(Fig 2C～E)顯示出較小的肝細(xì)胞死亡區(qū)域，同I/R組相比壞死明顯降低。

2.3 PTE處理對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用TEM觀察肝臟各組超微結(jié)構(gòu)(Fig 3)，假手術(shù)組：肝竇內(nèi)皮細(xì)胞繞肝竇腔排列，呈扁平狀，可明顯觀察到大量的開放的開窗結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮下膜薄，缺乏有組織的基底膜，腔內(nèi)膠原纖維較少；I/R組：窗孔數(shù)量同假手術(shù)組相比，明顯減少，內(nèi)皮下胞膜增生變厚，出現(xiàn)連續(xù)基底膜；PTE預(yù)處理組：窗孔開放數(shù)量明顯增多。

Fig 1 Changes in serum ALT and AST levels in mice A：Serum ALT level;B：Serum AST level;CON：Control group;I/R：Model group;PTE-10：Pterostilbene 10 mg·kg-1 treatment group;PTE-20：Pterostilbene 20 mg·kg-1 treatment group;PTE-40：Pterostilbene 40 mg·kg-1 treatment group;##P<0.01 vs CON group;**P<0.01 vs I/R group.

2.4 PTE處理對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔的影響肝竇內(nèi)皮原代細(xì)胞SEM檢測(Fig 4)，結(jié)果顯示：在正常肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中，具有明顯的窗孔結(jié)構(gòu)，窗孔開放；I/R組細(xì)胞窗孔明顯減少；PTE處理組窗孔數(shù)量同I/R組相比，有明顯增加。表明PTE可改善缺血/再灌注后肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔開放，有利于肝臟微循環(huán)恢復(fù)，減輕肝臟缺血/再灌注損傷。

Fig 2 Hetopathological HE staining of liver in various groups of miceA：Sham group;B：I/R group;C：Pterostilbene 10 mg·kg-1 treatment group;D：Pterostilbene 20 mg·kg-1 treatment group;E：Pterostilbene 40 mg·kg-1 treatment group.

Fig 3 Effects of pterostilbene on liver tissue in various groups of mice observed by transmission electron microscopy (TEM)A：Liver tissue in the sham group;B：Liver tissue in the I/R model group;C：Pterostilbene treatment group.E：endothelial cells，H：hepatocytes，V：villi，F(xiàn)：fenestrae，S：blood sinuses

Fig 4 Effects of pterostilbene on fenestrae of liver sinusoidal endothelial cells in each group of mice observed by scanning electron microscopyA：Liver sinusoidal cells of normal mice;B：Liver sinusoidal endothelial cells of model group;C：Liver sinusoidal endothelial cells of pterostilbene treatment group.

2.5 PTE處理對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶蛋白表達(dá)影響同對照組相比(Fig 5)，OGD/R后HO-1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)，經(jīng)過PTE預(yù)處理后，HO-1表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)。

3 討論

PTE從藍(lán)莓漿果中提取，屬于天然結(jié)構(gòu)化合物，具有抗炎、抗氧化作用。PTE能通過上調(diào) PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬在肝臟I/R損傷中發(fā)揮保護(hù)作用；并且還可以降低TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達(dá)，減輕急性肝損傷誘導(dǎo)的組織損傷、炎癥反應(yīng)[12]。在前期研究中，通過體內(nèi)實驗建立70%肝臟缺血/再灌注(缺血60 min)模型，也證實了PTE處理顯著降低血清中ALT、AST表達(dá)，減少肝臟缺血/再灌注后的組織水腫壞死。但這都是在肝實質(zhì)細(xì)胞中討論，對于非實質(zhì)細(xì)胞還沒有具體研究。

Fig 5 Effects of pterostilbene on HO-1 protein expression levels of liver sinusoidal endothelial cells in various groups A：Western blot detected the expression level of HO-1;B：HO-1 protein semi-quantitative analysis;1：Control group;2：OGD/R group;3：Perostilbene 10 μmol·L-1 treatment group;4：Pterostilbene 20 μmol·L-1 treatment group;5：Pterostilbene 40 μmol·L-1 treatment group;##P<0.01 vs Control group;**P<0.01 vs OGD/R group

肝臟70%非實質(zhì)細(xì)胞為LSECs，與其他血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能不同，LSECs沿竇壁排列呈扁平狀，細(xì)胞邊界清晰，存在典型的窗孔結(jié)構(gòu)。缺乏基底膜，沒有隔膜，從而使肝臟微血管內(nèi)皮不連續(xù)[13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，LSECs在IRI期間迅速去分化，獲得血管收縮、促炎和促血栓特性，這一過程被稱為“毛細(xì)血管化”，窗孔和基膜沉積的缺失阻礙了肝細(xì)胞的適當(dāng)氧化，ATP供應(yīng)減少，物質(zhì)運輸障礙，最終導(dǎo)致?lián)p傷相關(guān)分子模式(DAMP)的分泌[14]。本研究在體內(nèi)實驗通過TEM觀察發(fā)現(xiàn)，缺血/再灌注后LSECs窗孔數(shù)量明顯減少，內(nèi)皮下胞膜增生變厚，出現(xiàn)連續(xù)基底膜。而當(dāng)PTE預(yù)處理后窗孔開放數(shù)量顯著增多。為進(jìn)一步證實這種現(xiàn)象，體外實驗通過差速離心法分離原代LSECs，并采用氧-葡萄糖剝奪再恢復(fù)(OGD/R)構(gòu)建肝缺血/再灌注模型。SEM顯示，正常組LSECs窗孔數(shù)較多，缺氧后窗口數(shù)減少；與模型組相比，PTE治療組LSECs窗口數(shù)顯著增加。這些證據(jù)說明肝臟I/R期間，PTE對于LSECs窗孔結(jié)構(gòu)的完整性具有很好的保護(hù)作用，進(jìn)而維持肝臟的微循環(huán)，保證能量供應(yīng)和物質(zhì)運輸。

HO-1是催化血紅素降解限速酶，是炎癥細(xì)胞和組織損傷的關(guān)鍵介質(zhì)，通過減輕氧化應(yīng)激損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及改善微循環(huán)發(fā)揮有益作用。有相關(guān)研究表明通過上調(diào)HO-1可以減輕LSECs中的缺血性損傷[15]。本課題組發(fā)現(xiàn)，PTE能夠誘導(dǎo)OGD/R后LSECs內(nèi)HO-1表達(dá)，降低LSECs缺氧-復(fù)氧損傷。

綜上所述，PTE通過保護(hù)LSECs的結(jié)構(gòu)和功能減輕肝臟免受缺血/再灌注損傷。該過程中，PTE通過保護(hù)LSECs窗孔結(jié)構(gòu)的完整性，上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)水平發(fā)揮重要作用。因此，本研究為PTE保護(hù)肝臟免受缺血性損傷提供了新的理論依據(jù)。