郝雪峰亢春霞裴雁曦金竹萍

（1.太原師范學(xué)院，生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，晉中 030619；2.山西大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，特色植物資源研究與利用山西省重點實驗室，太原 030006）

H2S 作為新興的第3 種氣體信號分子近年來備受關(guān)注。自1978 年Wilson 等［1］在黃瓜（Cucumis sativus）、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）等高等植物中檢測到內(nèi)源H2S的釋放，陸續(xù)有報道揭示了H2S 廣泛而特殊的生理功能［2-4］。H2S 信號參與調(diào)控植物生長發(fā)育等過程，如種子萌發(fā)［5］、根系形態(tài)發(fā)生［6-7］、花期調(diào)節(jié)［8］、花器官衰老［9］、果實成熟［10］、生物合成［11-12］等；同時，H2S還能有效增強植物抵御各種生物和非生物脅迫的能力，它廣泛參與氧化應(yīng)激［13］、重金屬［14-16］、干旱［17-18］、滲透［19］、鹽分［20］、溫度［5，21］和細(xì)胞自噬［22］等非生物脅迫以及病原體等［23］生物脅迫過程；其中在植物抵抗干旱脅迫過程中，H2S信號通過與植物激素和其他信號分子相互作用關(guān)閉氣孔［17，24-25］。

Ca2+是生物體中最重要的信號分子之一。干旱脅迫可引發(fā)植物細(xì)胞Ca2+信號的產(chǎn)生，可通過調(diào)節(jié)滲透脅迫反應(yīng)影響相關(guān)基因的表達(dá)，參與磷脂信號通路ABA 信號的傳遞來調(diào)節(jié)植物的抗旱性［26-27］。已有證據(jù)表明H2S信號和Ca2+之間存在交互作用：外源H2S 在增強植物抗旱性過程中，能夠調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞Ca2+離子通道蛋白的編碼基因表達(dá)量［27］；H2S 供體預(yù)處理能提高胞外Ca2+內(nèi)流，增強煙草（Nicotiana tabacum）懸浮細(xì)胞的耐熱性［28］；H2S 通過對SnRK2.6 蛋白激酶的硫巰基化修飾和活性氧的積累誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞中Ca2+內(nèi)流，從而導(dǎo)致氣孔關(guān)閉［29］；定位于質(zhì)膜上的Orai3 通道蛋白在其半胱氨酸C226和C232處經(jīng)H2S修飾后限制了Ca2+的流入［30］；此外，H2S 與鈣信號在植物抵御重金屬Cr6+脅迫過程中的互作機制也被深入探究［14-15］。這些結(jié)果都表明Ca2+在H2S 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色。

苜蓿（Medicago sativa）作為我國一種重要的經(jīng)濟作物，近年來受環(huán)境脅迫的影響其產(chǎn)量大大下降，畜牧業(yè)生產(chǎn)中呈現(xiàn)出嚴(yán)重的供不應(yīng)求，需要通過進(jìn)口途徑大量獲得［31］。因此，研究苜蓿在抵抗干旱過程中的生理特征、提高其產(chǎn)量已成為亟待解決的問題。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）由于生長周期較短、基因組較小、遺傳轉(zhuǎn)化效率較高和自花授粉等特點成為豆科（Fabaceae）模式植物。因此，本研究以蒺藜苜蓿為試驗材料，通過研究其干旱脅迫下H2S 信號和Ca2+的關(guān)系，闡明H2S 增強植物抗旱性的作用機理，以期為H2S信號進(jìn)一步應(yīng)用于生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型材料為蒺藜苜蓿R108，2 個突變體敲除的均為COSTIN（compact stalk internodes）基因，編碼1個鈣離子交換蛋白，表現(xiàn)為植株矮化［32］。分別記作Tnt1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入突變體NF3011（costin-2）和NF2734（costin-3）（購自美國諾貝爾研究所），均由中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所牛麗芳研究員提供。主要試劑有H2S 供體NaHS（上海阿拉?。a2+離子探針Fluo-4AM（上海碧云天Beyotime）、分子生物學(xué)相關(guān)試劑（購自上海寶生物Ta-KaRa）、LaCl3等化學(xué)試劑（均為國產(chǎn)分析純，購自上海生工）。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取及qRT-PCR檢測

生長2 周的野生型R108 幼苗，分為2 組，對照組和生理濃度的H2S 熏蒸組（100 μmol·L-1），分別于0、1、3、6、12、24 h 取葉片，液氮冷凍-80 ℃下保存；用RNAiso Plus 試劑提取總RNA，5×All-In-One MasterMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作方法按照說明書進(jìn)行。以cDNA 為模板，蒺藜苜蓿ACTIN基因作為內(nèi)參，熒光定量PCR 儀檢測鈣交換器（cation/calcium exchanger 1）編碼基因（MTR_6g027580）的表達(dá)，每個試驗均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)（見表1）。

表1 qRT-PCR特異性引物Table 1 Specific primers of real-time PCR

1.2.2 葉片中H2S含量的測定

生長到4周齡的蒺藜苜蓿幼苗，分為正常澆水的對照組和完全不澆水的干旱組，1周后分別剪取3種植株相同部位的葉片稱取質(zhì)量，參考本實驗室建立的測定方法［33］，利用四通道自由基測試儀（WPI，美國）的H2S 電極記錄實時特征信號，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算植物體內(nèi)H2S的濃度。

1.2.3 測量氣孔孔徑

撕取3種植株（R108、NF3011、NF2734）葉片下表皮，分別置于裝有4 mL PBS（pH=7.0）緩沖液的培養(yǎng)皿中，光照30 min 使其氣孔充分張開；然后用NaHS、LaCl3溶液于光照下繼續(xù)處理30 min（見表2），制片后用光學(xué)顯微鏡觀察并測量氣孔孔徑。

表2 表皮條的不同處理Table 2 Different treatments of epidermal strips

1.2.4 Ca2+含量的測定

蒺藜苜蓿幼苗自然干旱1 周，取3 種植株，撕取葉片下表皮置于裝有4 mL PBS（pH=7.0）的培養(yǎng)皿中，光照30 min；然后按表2 進(jìn)行不同處理30 min；分別加入Fluo-4 AM 避光4 ℃孵育；用PBS溶液沖洗3 次，加入PBS 繼續(xù)孵育4 h；制片觀察，藍(lán)光激發(fā)，紅光偏移0.8，整體增益41，曝光時間150 ms左右，拍照，用Image J軟件計算熒光強度。

1.3 統(tǒng)計分析

用Excel和SPSS statistics 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與單因素ANOVA分析，實際數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Duncan’s測驗分析處理間差異顯著性。經(jīng)統(tǒng)計分析后以不同字母表示結(jié)果具有顯著性差異（顯著差異表示P＜0.05；極顯著差異表示P＜0.01），使用SigmaPlot 10.0及Photoshop軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣離子轉(zhuǎn)運體對H2S產(chǎn)生的影響

以野生型R108 和Ca2+轉(zhuǎn)運體突變體植株NF3011 和NF2734 為試驗材料，分別處于正常條件和干旱脅迫1 周，測定各自體內(nèi)的H2S 含量（見圖1）。結(jié)果表明，在正常生理狀況下，突變體NF3011 和NF2734 體內(nèi)H2S 的含量與野生型相比極顯著降低；在干旱脅迫條件下，突變體NF3011和NF2734體內(nèi)H2S的含量與野生型相比呈顯著性差異；各基因型植株體內(nèi)的H2S 含量與其對應(yīng)的CK 相比均表現(xiàn)為升高，且Ca2+轉(zhuǎn)運突變體的內(nèi)源H2S與其相應(yīng)CK相比呈顯著性差異，說明植株體內(nèi)H2S的產(chǎn)生部分依賴Ca2+轉(zhuǎn)運體，兩者密切相關(guān)。

圖1 干旱脅迫前后野生型和突變體植株內(nèi)源H2S含量的比較不同大寫字母表示相同條件下不同材料間的顯著性差異，而不同小寫字母表示同一種材料在不同處理條件下的差異顯著性（P＜0.05）；下同F(xiàn)ig.1 Comparison of endogenous H2S content in WT and mutants before and after drought stress Different uppercase letters indicate significant differences between different materials under the same conditions，while different lowercase letters indicate the significant difference between the same material under different treatment（sP＜0.05）；the same as below

2.2 H2S信號對鈣離子轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)錄水平的影響

以野生型植株為材料分別設(shè)立對照組和NaHS 熏蒸組（100 μmol·L-1）。Ca2+轉(zhuǎn)運體編碼基因MTR_6g027580的表達(dá)量呈現(xiàn)晝夜周期性的變化趨勢（見圖2），H2S 熏蒸后的整體趨勢與對照保持一致。具體表現(xiàn)為：在24 h 的處理周期內(nèi)，處理前期（＜3 h）2 組的基因表達(dá)量均無顯著差異；在6 h 后CK 組表達(dá)量顯著增高，而NaHS 熏蒸組表達(dá)量依然保持較低水平，此時2處理組間差異極其顯著；在之后的時間段內(nèi)可以明顯看出NaHS 熏蒸組的基因表達(dá)量明顯低于對照組，12 h 時表現(xiàn)為顯著差異。說明H2S 信號在轉(zhuǎn)錄水平一定程度上抑制MTR_6g027580基因的表達(dá)。

圖2 H2S處理時長對MTR_6g027580基因表達(dá)量的影響不同大寫字母表示相同處理條件而不同處理時間的差異顯著性，不同小寫字母表示不同處理條件而相同處理時間的差異顯著性（P＜0.05）Fig.2 Effect of H2S treatment duration on MTR_6g027580gene expression Different uppercase letters indicate the difference significance of the same treatments but different processing time，different lowercase letters indicate the difference significant in the same processing time due to different treatment（sP＜0.05）

2.3 鈣離子通道在H2S調(diào)節(jié)氣孔運動中的作用

為了進(jìn)一步探究H2S 與Ca2+離子通道的關(guān)系，引入H2S 供體NaHS 和Ca2+通道阻斷劑LaCl3分別進(jìn)行單獨和聯(lián)合處理，以各自CK 組的氣孔孔徑為基礎(chǔ)，對同一種植株在不同處理間進(jìn)行統(tǒng)計分析。從圖3可以看出3種植株經(jīng)過NaHS熏蒸處理的葉片氣孔孔徑，比CK 組顯著或極顯著減小，其大部分氣孔表現(xiàn)為關(guān)閉狀態(tài)；在加入LaCl3后，野生植株的孔徑較CK 組沒有明顯變化，但2 種突變體孔徑較CK 組變小，且NF2734 呈現(xiàn)為顯著差異；加入LaCl3之后再進(jìn)行NaHS 處理，突變體的氣孔孔徑較LaCl3單獨處理均減小，其中NF3011 呈現(xiàn)顯著水平，但此條件下野生型R108 的氣孔孔徑與其CK 處于一個水平。換句話說，H2S 信號對蒺藜苜蓿的氣孔運動中的Ca2+調(diào)節(jié)，很大程度上依賴于Ca2+轉(zhuǎn)運體來進(jìn)行，相對而言，對Ca2+離子通道的依賴作用較小。

圖3 不同處理下3種植株氣孔孔徑的比較Fig.3 Comparison of stomatal aperture of three plants under different treatments

2.4 體內(nèi)Ca2+含量對H2S信號調(diào)節(jié)氣孔運動的影響

眾所周知，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+含量增高會導(dǎo)致氣孔關(guān)閉。從上述結(jié)果可知，生理濃度H2S熏蒸導(dǎo)致野生型和突變體的葉片氣孔關(guān)閉，為了探索蒺藜苜蓿體內(nèi)H2S 信號調(diào)節(jié)氣孔運動過程中與體內(nèi)Ca2+含量的關(guān)系，對不同材料的小表皮條進(jìn)行NaHS 和LaCl3的單獨和聯(lián)合處理，然后通過檢測保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強度得知二者間存在密切關(guān)聯(lián)，結(jié)果如圖4 所示：NaHS 熏蒸組的Ca2+含量比CK 組顯著增加，說明H2S 誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉是經(jīng)過誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+含量升高來實現(xiàn)的；在加入鈣離子阻斷劑LaCl3后，Ca2+進(jìn)入保衛(wèi)細(xì)胞的能力被部分抑制，Ca2+含量降低但與對照組相比未呈現(xiàn)顯著差異，而突變體中雖然缺失鈣離子轉(zhuǎn)運體，但Ca2+含量的變化與野生型相比仍然處于同一水平，說明Ca2+進(jìn)入細(xì)胞少部分是依賴鈣離子通道。Ca2+被阻斷后再施加生理濃度H2S，野生型保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的含量明顯增高，而突變體未呈現(xiàn)顯著變化，進(jìn)一步證明H2S 誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過程中的Ca2+含量變化，很大程度依賴于Ca2+轉(zhuǎn)運體。

圖4 不同處理下3種植株Ca2+含量的比較A.不同處理下保衛(wèi)細(xì)胞的鈣離子熒光；B.不同處理下的熒光強度量化Fig.4 Comparison of Ca2+content in three plants under different treatments A.The Ca2+fluorescent of guard cellsunder different treatments；B.Fluorescence intensity quantification under different treatments

3 討論

葉片是植物進(jìn)行光合作用制造有機物的主要場所，也是在植物發(fā)展進(jìn)化過程中對周圍的環(huán)境比較敏感、可塑性較大的器官。氣孔是植物體生長發(fā)育中與外界進(jìn)行氣體（CO2和O2）和水分交換的重要門戶，氣孔數(shù)量和孔徑大小受周圍環(huán)境變化的影響。前期的研究結(jié)果表明，H2S通過誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉增強植物的抗旱性，而氣孔運動調(diào)節(jié)又是一個極其精密的調(diào)控系統(tǒng)，其中Ca2+的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用至關(guān)重要。因此，本研究以經(jīng)濟作物蒺藜苜蓿為研究材料，以其Ca2+轉(zhuǎn)運突變體為突破口，外源施加生理濃度的H2S，來驗證H2S 信號與Ca2+轉(zhuǎn)運的關(guān)系。通過從各個水平進(jìn)行的檢測和觀察比較，得到了Ca2+參與H2S 信號調(diào)節(jié)氣孔運動過程的具體方式，這些理論數(shù)據(jù)可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐，提高在各種脅迫條件下生長的作物產(chǎn)量。

以往研究表明當(dāng)植物遭受到環(huán)境刺激后，細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度會瞬間升高，然后這些鈣作為信號將信息逐級傳遞到下游分子，從而產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)［34-35］。Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的組分大概分為兩類：一類是受鈣濃度調(diào)節(jié)的蛋白（鈣調(diào)素CaM、鈣依賴的蛋白激酶PKC、膜聯(lián)蛋白annexin 等），Ca2+的濃度變化產(chǎn)生鈣信號，Ca2+與CaM 等受體結(jié)合，進(jìn)而影響CaM 結(jié)合蛋白等靶蛋白的活性，從而調(diào)控下游基因表達(dá)和一系列生理反應(yīng)［36］；另一類是Ca2+依賴的通道，包括K+和Cl-等通道相關(guān)的信號通路，大都是Ca2+依賴的通道，且這些通道在一定程度受鈣信號的調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度受調(diào)控的方式大致也分為3 類：一是通道（如質(zhì)膜上有關(guān)Ca2+進(jìn)出細(xì)胞相關(guān)的特異性通道、非特異性通道、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器膜上的相關(guān)通道）；二是細(xì)胞內(nèi)的鈣緩沖系統(tǒng)（包括各種鈣結(jié)合蛋白）；三是細(xì)胞膜上離子交換通道和相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白（如Na+-Ca2+交換系統(tǒng)、相關(guān)Ca2+轉(zhuǎn)運蛋白、各種鈣泵等）。除上述因素直接影響細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度外，鈣離子通道阻滯劑也是目前應(yīng)用非常廣泛的干預(yù)方式，外源施加可阻斷Ca2+通過鈣離子通道的方式進(jìn)入細(xì)胞［34］。換句話說，Ca2+進(jìn)出保衛(wèi)細(xì)胞有2 種主要方式：Ca2+離子通道和Ca2+轉(zhuǎn)運體。因此，本研究利用Ca2+轉(zhuǎn)運相關(guān)的突變體（NF3011 和NF2734）（圖1～2）和Ca2+的離子通道阻斷劑LaCl3（圖3），對H2S誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過程中的氣孔孔徑（圖3）和Ca2+含量（圖4）等方面進(jìn)行比較，證明了H2S 在苜蓿體內(nèi)主要依賴Ca2+轉(zhuǎn)運體進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式。

H2S 與Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系的探討已有一些報道，試驗材料大多集中在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）［27］和煙草［28］，也有推廣到作物方面如谷子（Setaria italicavar.germanica）［15］；響應(yīng)的環(huán)境脅迫包括熱脅迫［28］、重金屬脅迫［14-15］和干旱脅迫［27］等。本試驗在前人研究基礎(chǔ)上，引入重要的經(jīng)濟作物蒺藜苜蓿，并以其Ca2+轉(zhuǎn)運相關(guān)的突變體為材料，為干旱脅迫下H2S 與Ca2+信號關(guān)系提供遺傳學(xué)證據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)Ca2+缺乏會導(dǎo)致苜蓿體內(nèi)H2S 含量減少（圖1），反之，H2S 的處理也會在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)Ca2+轉(zhuǎn)運體的表達(dá)（圖2），說明兩者不是簡單的上下游關(guān)系，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中存在反饋調(diào)節(jié)，這與之前研究的綜合結(jié)果［14，27-28］是一致的。干旱脅迫下野生型體內(nèi)H2S含量未發(fā)生變化，相對而言，Ca2+轉(zhuǎn)運突變體的H2S 含量顯著升高（圖1），意味著苜蓿體內(nèi)H2S 的產(chǎn)生與其遭受的干旱脅迫密切相關(guān)，且此過程部分依賴于Ca2+的轉(zhuǎn)運，與在擬南芥中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致［27］。

4 結(jié)論

本研究以重要經(jīng)濟作物蒺藜苜蓿為試驗材料，利用其Ca2+轉(zhuǎn)運體突變體和Ca2+離子通道阻斷劑進(jìn)行試驗設(shè)計，證明了H2S信號誘導(dǎo)蒺藜苜蓿體內(nèi)細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度升高進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機制，且在此過程中，H2S 主要依賴Ca2+轉(zhuǎn)運體、少部分依賴Ca2+離子通道傳遞信號，進(jìn)而誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉。同時，突變體NF3011和NF2734體內(nèi)的H2S含量與野生型相比極顯著降低，說明鈣信號對H2S存在反饋作用，二者在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中具有復(fù)雜的互作。進(jìn)一步深入研究H2S 信號對植物氣孔運動的作用機制，對農(nóng)業(yè)實踐中增強植物抗逆性、提高作物產(chǎn)量有重要意義。