陳昕誼 彭東正

變態(tài)反應(yīng)性疾病的診斷是治療的依據(jù)。對普通的吸入性變應(yīng)原，根據(jù)臨床病史，結(jié)合皮膚測試和（或）過敏原特異性IgE（specific immunoglobulin E，sIgE）的測定，可以作出特異的變應(yīng)原診斷[1]。sIgE 法是一種安全的檢測指標(biāo)，它不受患者的皮膚狀況、藥物使用歷史的影響，能檢出多種變態(tài)反應(yīng)原，并在臨床上得到廣泛的應(yīng)用[2]。長期以來，在臨床上很少有可用于 sIgE 的定量測定，目前國內(nèi)只有 Immuno CAP 系統(tǒng)。本系統(tǒng)應(yīng)用熒光酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)，是目前世界上對變應(yīng)原sIgE 的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。但是，由于采用的是進(jìn)口設(shè)備，價格昂貴，難以在我國大規(guī)模推廣。酶聯(lián)免疫捕獲法是一種全自動的全定量的變應(yīng)原免疫吸附檢測系統(tǒng)，它與傳統(tǒng)的固相包被致敏原不同，它首先將血清中的 IgE 抗體被包覆于固相載體上的抗IgE 抗體捕獲，在此基礎(chǔ)上，添加了液相的變應(yīng)原，以消除非 IgE 抗體的干擾，提高了檢測的敏感性[4]。本研究選取廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2019 年3 月—2022 年2 月收治的耳鼻喉科患兒血清樣本300 份，旨在探討酶聯(lián)免疫捕獲法檢測對耳鼻喉科患兒血清過敏原特異性IgE（sIgE）水平分析的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年3 月—2022 年2 月廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的耳鼻喉科患兒300 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）于本院耳鼻喉科就診，且需進(jìn)行過血液生化檢驗(yàn)。（2）臨床資料完整。（3）年齡≤18 周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入組前1 周有免疫抑制劑應(yīng)用史。（2）因精神疾病或其他原因無法配合完成。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，批準(zhǔn)免除知情同意（批號20220132）。取患兒臨床血液生化檢驗(yàn)剩余血清進(jìn)行過敏原特異性IgE 檢測?；举Y料中，患兒年齡2 ～18 歲，平均（11.5±2.4）歲。病程0.5 ～5 年，平均（2.3±0.4）年。

1.2 方法

取已知粉塵螨、戶塵螨、狗毛屑、貓毛屑、艾蒿花粉、鏈格孢sIgE 抗體陽性血清高、中、低濃度各3 份，每份200μL，分裝好后保存在-20℃冷凍，用前復(fù)溶。樣品稀釋液則不含任何過敏原的sIgE 抗體，保存在2 ～8 ℃冷藏。另取前述患者血清樣本300 份，保存在2 ～8 ℃冷藏待用。

分別使用酶聯(lián)免疫捕獲法和Immuno CAP 系統(tǒng)對sIgE水平進(jìn)行檢驗(yàn)。其中，酶聯(lián)免疫捕獲法sIgE 抗體檢測試劑盒購自蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司，廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動酶免儀則由深圳愛康生物科技有限公司生產(chǎn)。Immuno CAP 系統(tǒng)則由瑞典Phadia AB 公司生產(chǎn)的試劑盒以及全自動熒光免疫分析儀組成。相關(guān)操作均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩種系統(tǒng)檢驗(yàn)sIgE 水平的精密度、靈敏度、線性范圍，并進(jìn)行方法學(xué)對比。其中，精密度評價依據(jù)CLSIEPl5-A2 文件進(jìn)行[5]，酶聯(lián)免疫捕獲法檢測對血清樣本上述過敏原sIgE 分別檢測，4 次/d，連續(xù)5 d，計算批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）以及總CV%。靈敏度評價則對稀釋液樣本進(jìn)行上述過敏原sIgE 分別檢測，同一批內(nèi)進(jìn)行連續(xù)20 次測定，得到吸光度平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果，使用定標(biāo)曲線方程計算定量下限（limit of quantitation，LOQ）。線性范圍評價則依據(jù)張秀明的方法進(jìn)行[6]，2 種方法對血清樣本的過敏原sIgE 檢測后，使用線性回歸對定量結(jié)果進(jìn)行分析，依照國際慣例，0.35 kU/L 作為結(jié)果閾值，小于該結(jié)果則判定為陰性，大于等于該結(jié)果則判定為陽性[5]。使用Kappa 分析對定性結(jié)果進(jìn)行評價，同樣依照上述國際標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

研究數(shù)據(jù)全部導(dǎo)入SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件包進(jìn)行整理和分析，計量資料以（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)；計數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。定量數(shù)據(jù)使用線性回歸分析，定性數(shù)據(jù)使用Kappa 一致性分析，以α=0.05 為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，Kappa 分析標(biāo)準(zhǔn)為0.75。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度比較

酶聯(lián)免疫捕獲法檢測6 種過敏原sIgE 的批內(nèi)CV 值均＜7%，而總CV%＜8%，根據(jù)產(chǎn)品說明書，以上指標(biāo)均低于不精密度標(biāo)準(zhǔn)，酶聯(lián)免疫捕獲法檢測的精密度可滿足臨床應(yīng)用。見表1。

表1 酶聯(lián)免疫捕獲法檢測的精密度

2.2 靈敏度比較

6 種過敏原的LOQ 值均＜0.35 KU/L，均為陰性。見表2。

表2 酶聯(lián)免疫捕獲法檢測的靈敏度（%）

2.3 線性范圍比較

粉塵螨、戶塵螨、狗毛屑、貓毛屑、艾蒿花粉、鏈格孢的樣品范圍濃度依次分別為：0.37 ～94.34 kU/L，0.35 ～89.43 kU/L，0.36 ～91.23 kU/L，0.35 ～93.35 kU/L，0.33 ～95.32 kU/L，0.36 ～85.64 kU/L，檢測結(jié)果均無明顯離群值。粉塵螨的相關(guān)系數(shù)為0.998，戶塵螨的相關(guān)系數(shù)為0.999，狗毛屑的相關(guān)系數(shù)為0.986，貓毛屑的相關(guān)系數(shù)為0.991，艾蒿花粉的相關(guān)系數(shù)為0.990，鏈格孢的相關(guān)系數(shù)為0.989，均大于產(chǎn)品說明書的閾值0.975，線性范圍良好。

2.4 兩種檢測方法比較

2.4.1 定量結(jié)果比較

不同過敏原的回歸方程斜率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩系統(tǒng)定量檢測結(jié)果相關(guān)性較強(qiáng)。見表3。

表3 兩種檢測方法定量結(jié)果比較

2.4.2 定性結(jié)果比較

兩種檢測方法的定性結(jié)果顯示，陽性符合率均低于90%，其中以粉塵螨的陽性符合率最高，為86.00%，粉塵螨、貓毛屑和艾蒿花粉的陰性符合率并列第一，均為100%。綜合來看，兩種檢測方法的陽性符合率為77.33%，陰性符合率為98.67%，Kappa 值為0.833，P＜0.05。見表4。

表4 兩種檢測方法定性結(jié)果比較

3 討論

IgE 是一種特異的變應(yīng)原診斷指標(biāo)。長期以來，我國對過敏性原 sIgE 的測定大都是半定量的，不僅不能全面、準(zhǔn)確地給出準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，而且大部分都是人工進(jìn)行的；由于難以進(jìn)行品質(zhì)控制，難以確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[7]。Immuno CAP 是目前世界上對過敏性原 sIgE 定量測定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，國內(nèi)20 多年前就引進(jìn)了 Immuno CAP，本系統(tǒng)應(yīng)用ELISA 技術(shù)，是目前世界上對變應(yīng)原sIgE 的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是，由于采用的是進(jìn)口設(shè)備，價格昂貴，難以在我國大規(guī)模推廣。因此，在臨床上，急需一種低成本的全自動定量分析方法[8]。酶聯(lián)免疫捕獲法是一種能夠國產(chǎn)的全自動、全定量變應(yīng)性 IgE 檢測系統(tǒng)，同樣采用 ELISA 技術(shù)，與傳統(tǒng)的固相包被致過敏原不同，它首先將血清中的 IgE抗體被包覆于固相載體上的抗IgE 抗體捕獲，在此基礎(chǔ)上，添加了液相的變應(yīng)原，以消除非 IgE 抗體的干擾，提高了檢測的敏感性，以微孔板為固相載體，將抗人 IgE抗體引入到受檢者的體內(nèi)；充分捕獲檢測血清中 IgE 抗體，清除游離抗體，如 IgG，防止其他抗體與變應(yīng)原發(fā)生競爭；然后，在液體中添加生物素變態(tài)反應(yīng)源，將其與固定載體上的 sIgE 結(jié)合，形成“抗人IgE-sIgE-過敏原”這類免疫復(fù)合物，最后添加到鏈霉親和素化的辣根過氧化物酶，并與底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。結(jié)果表明，樣品中 sIgE 水平較高[9]。采用捕捉技術(shù)，不僅能有效地消除非 IgE 的干擾，而且能減少變態(tài)反應(yīng)的用量，降低試劑的費(fèi)用；利用生物素親和素體系，可以有效地提高檢測的敏感性[10]。

本研究對酶聯(lián)免疫捕獲法的性能進(jìn)行了初步評價。對于6 種常見吸入物過敏原，低、中、高值樣本的批內(nèi)和總CV%均低于試劑盒標(biāo)示不精密度。各種過敏原的定量測定下限不等，但均低于分析下限0.35 kU/L，符合廠商標(biāo)示靈敏度。粉塵螨、戶塵螨、狗毛屑、貓毛屑、艾蒿花粉、鏈格孢過敏原的相關(guān)系數(shù)均大于0.975，說明線性范圍良好。

國際上對 sIgE 的定性標(biāo)準(zhǔn)是0.35 kU/L，在此數(shù)值以下時敏感性高于90%，但特異性卻相對較低[11]。血清中 sIgE值＞0.35 kU/L，說明患者對變應(yīng)原的耐受性降低，暴露于變應(yīng)原的發(fā)生率也會增加。本研究結(jié)果表明，6 個變應(yīng)原的陰性符合率均大于陽性符合率，其中粉塵螨、貓毛屑和艾蒿花粉的陰性符合率并列第一，均為100%。陽性符合率粉塵螨最高，為86.00%；狗毛屑最低，為58.00%。

以上結(jié)果表明，Immuno CAP 與酶聯(lián)免疫捕獲法的預(yù)測值具有較好的相關(guān)性，但也存在一些差異。國外也有一些關(guān)于不同檢測體系的 sIgE 測試結(jié)果的一致性，分析表明，主要是因過敏原原料的差異引起的[12]。過敏原的主要成分是過敏性提取物，主要由各種致敏性的蛋白質(zhì)組成。筆者認(rèn)為，在過敏原的選用上以主要致敏蛋白為主，其次是次要致敏蛋白；所有敏感蛋白均無組分丟失，并以合適的濃度保證了所有過敏患者的檢測，并且量化的結(jié)果具備一定的臨床相關(guān)性[13]。但由于植物、動物、微生物等來源因素的影響，其致敏性成分的含量和活性也因地理位置的不同與自然環(huán)境的改變而發(fā)生改變。目前，國內(nèi)尚無完全變態(tài)反應(yīng)原的標(biāo)準(zhǔn)，所有的原材料及診斷試劑制造商，均依靠自己的實(shí)驗(yàn)室對照品來進(jìn)行品質(zhì)管理。因此，不同的過敏原sIgE 檢測體系難以取得完全一致的結(jié)果，需要臨床醫(yī)生對自己的測試體系有足夠的認(rèn)識，并根據(jù)臨床情況做出適當(dāng)?shù)慕忉孾14-15]。

綜上所述，酶聯(lián)免疫捕獲法檢測對耳鼻喉科患兒血清過敏原特異性IgE 水平的評價效能，具有較好的精密度與靈敏度，且與Immuno CAP 系統(tǒng)的相關(guān)性較好，作為一種自動化全定量檢測手段，能夠滿足臨床耳鼻喉科常見過敏原檢驗(yàn)的要求，具有使用價值。此文的研究結(jié)果為兒童耳鼻喉科常見過敏性疾病的診斷和鑒別診斷后期標(biāo)準(zhǔn)制定提供了借鑒內(nèi)容。