陳子奇，孫治琪，黃渤皓，趙凡瑩，劉子旺

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100029）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）早期出現(xiàn)記憶力下降，隨著病情進(jìn)展，認(rèn)知困難逐漸加重，后期可能出現(xiàn)行為障礙、幻覺等嚴(yán)重癥狀，最終喪失基本生活能力［1］。國內(nèi)外研究證實(shí)β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉淀是AD 起病及進(jìn)展的的重要原因［2，3］，而Wnt/β- catenin 信號(hào)通路的傳導(dǎo)受阻與Aβ 的聚集所致的神經(jīng)毒性 有很大關(guān)系［4，5］。Wnt/β-catenin 通路主要由β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等關(guān)鍵蛋白構(gòu)成［6］。其中β-catenin 是該信號(hào)通路的重要下游因子，負(fù)責(zé)將信號(hào)傳遞到細(xì)胞中，在通路的激活過程中起著關(guān)鍵作用，而GSK-3β則是促進(jìn)β-catenin 磷酸化、加速其水解的關(guān)鍵蛋白，主要與通路的抑制相關(guān)［7］。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活能夠降低Aβ 沉積，進(jìn)而緩解神經(jīng)元損傷［8，9］。電針作為一種將針身固定在相應(yīng)穴位上并結(jié)合不同頻率的電流刺激以達(dá)到治療效果的新型針刺方法，能夠延緩神經(jīng)元衰老，更加安全有效的抑制AD 的發(fā)展，提高患者或模型鼠的記憶能力［10，11］。但電針對于海馬區(qū)Aβ 沉積的影響以及相關(guān)的作用機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察電針刺激百會(huì)、腎俞穴對小鼠認(rèn)知功能的作用及其腦組織內(nèi)GSK-3β、β-catenin 蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而深入探究電針改善AD 的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供24 只4 月齡，雄性，體重（30±5）g 的APP/PS1 癡呆小鼠和8 只4 月齡，雄性，體重（30±5）g 的C57BL/6 小鼠，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0001。小鼠在實(shí)驗(yàn)前一周統(tǒng)一購入，在溫度（22±2）℃、濕度（55±5）%以及光照明暗各12 h 的環(huán)境中，用標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。使用隨機(jī)數(shù)字表法將24 只APP/PS1 小鼠分為3 組：模型組、電針組、西藥組，另設(shè)同齡C57BL/6J 小鼠為空白組（8只）。已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：BUCM-4-2019-092402-3070），符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求，并在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格善待動(dòng)物。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸多奈哌齊片（衛(wèi)材中國藥業(yè)有限公司）；無水乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；蘇木素染色液（貝索細(xì)胞科學(xué)技術(shù)有限公司）；伊紅染色液（索萊寶科技有限公司）；Anti-GSK-3β antibody（proteintech，中國）；Anti-β-catenin antibody（proteintech，中國）；Anti-GAPDH antibody（abcam，美國）。

華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)）；Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置，離心機(jī)（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院提供）；華佗電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司）；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（Leica Biosystems 公司，德國，型號(hào)：RM2255）；研究型顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號(hào)：DP72），酶標(biāo)儀（Bio-tek，美國）等。

1.3 干預(yù)方法

空白組和模型組：只取穴，不予以針刺，同時(shí)給予2 mL 生理鹽水灌胃，每天1 次，共計(jì)21 d。

電針組：據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》定位百會(huì)穴及腎俞穴，先后針刺百會(huì)穴（平刺2 mm）、雙側(cè)腎俞穴（直刺1 mm），連接電針儀，設(shè)置頻率2 Hz，電流1～2 mA，每次針刺時(shí)間為15 min，每日1 次，共計(jì)21 d。

西 藥 組：選 擇 鹽 酸 多 奈 哌 齊2 mg·kg-1·d-1）灌胃，每天1 次，共計(jì)21 d。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 Morris 水迷宮測試記憶力和學(xué)習(xí)能力 Morris 水迷宮法用來評估小鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶力，其主要由兩部分組成：第一部分為定位航行實(shí)驗(yàn)，第二部分為空間探索實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)總共歷時(shí)5 d，首先在第1 象限水下1 cm 處放置平臺(tái)。連續(xù)進(jìn)行4 d 的定位航行訓(xùn)練，將小鼠隨機(jī)從其余3 個(gè)象限放入水池中，重復(fù)此訓(xùn)練并跟蹤小鼠的游泳路線，記錄它發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的時(shí)間（即逃避潛伏期）。在定位航行試驗(yàn)完成24 h 后，將水底平臺(tái)拆除，并將小鼠從原來平臺(tái)象限的對側(cè)（即第3 象限）面向池壁放到水下，期間觀察并記錄小鼠60 s 內(nèi)跨越平臺(tái)的次數(shù)和其在目標(biāo)象限停留的時(shí)間。

1.4.2 HE 染色觀察小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu) 行為學(xué)檢測結(jié)束后立即將小鼠麻醉，斷頭取腦，在冰盤上取出腦組織，對樣本進(jìn)行預(yù)冷、固定、洗滌、脫水、埋蠟等處理，制作厚度為5 μm 的樣本切片。隨后對切片脫蠟處理，再用無水乙醇充分水化，清洗，用蘇木素染色，5 min 后沖洗再浸入伊紅染色液，再次清洗后封片在×200 倍鏡下對小鼠腦組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察。

1.4.3 Western Blot 法檢測小鼠腦組織內(nèi)GSK-3β、β-catenin 蛋白含量 取出剩余的50 mg 海馬組織，加入RIPA 裂解液進(jìn)行勻漿、裂解、離心處理，按照BCA 法測定樣品蛋白的含量，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h。加入一抗（GSK-3β 1∶1 000、β-catenin 1∶1 000），4 ℃搖動(dòng)作用過夜；TBST 溶液中搖動(dòng)漂洗，加入二抗（羊抗兔IgG 抗體 1∶1 000），室溫孵育1.5 h 后漂洗，進(jìn)行顯色、成像處理，并分析各組蛋白條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示，組間比較采用單因素ANOVA 檢驗(yàn)。若P＜0.05，則提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對小鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力的影響

在前4 d 的定位航行實(shí)驗(yàn)中，第1 天是小鼠的適應(yīng)性培養(yǎng)。與空白組比，模型組小鼠在訓(xùn)練期間的逃避潛伏期時(shí)間顯著增加，提示APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠存在明顯的認(rèn)知能力下降；從第2 天起，電針組和西藥組逃避潛伏期的時(shí)間均低于模型組（P＜0.05），且隨著訓(xùn)練天數(shù)增加均呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。從游泳軌跡圖來看，與模型組相比，各治療組小鼠軌跡總路程均變短、目的性增強(qiáng)。見表1及圖1）。

圖1 干預(yù)后小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)游泳軌跡圖Fig 1 The swimming track map of mice was located in navigation experiment after the intervention

表1 干預(yù)后小鼠逃避潛伏期的變化（n=8，s，±s）Tab 1 Mice escaped the change of incubation period after intervention（n=8，s，±s）

表1 干預(yù)后小鼠逃避潛伏期的變化（n=8，s，±s）Tab 1 Mice escaped the change of incubation period after intervention（n=8，s，±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05。

組別空白組模型組電針組西藥組4 d 24.75±4.87 52.94±5.48*30.03±15.78*#31.59±47.15*#35.726＜0.001FP2 d 39.35±5.58 56.44±14.19*43.25±7.42*#47.51±46.40*#12.009＜0.001 3 d 31.88±4.82 51.03±16.33*39.22±6.11*#41.09±46.42*#14.064＜0.001

在第5 天的空間探索試驗(yàn)中，與空白組比，模型組小鼠的目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，提示APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠存在記憶障礙；與模型組比較，電針組和西藥組的目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長、穿越平臺(tái)次數(shù)增多（P＜0.05）。從游泳軌跡圖來看，與模型組相比，各治療組小鼠多在原平臺(tái)位置及附近處游動(dòng)，目的性較大，目標(biāo)象限內(nèi)軌跡較為密集。見表2 及圖2）。

圖2 干預(yù)后小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)游泳軌跡圖Fig 2 Swimming trajectories of mice in space exploration experiment after intervention

表2 小鼠干預(yù)后目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)的變化（±s）Tab 2 Changes of residence time in the target quadrant and times of crossing the platform in mice after intervention（±s）

表2 小鼠干預(yù)后目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)的變化（±s）Tab 2 Changes of residence time in the target quadrant and times of crossing the platform in mice after intervention（±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05。

穿越平臺(tái)次數(shù)（次)5.50+0.93 2.00±1.07*4.00±1.07*#3.75±1.04*#15.621＜0.001組別空白組模型組電針組西藥組FP目標(biāo)象限停留時(shí)間(s)27.63±3.45 12.28±5.28*21.28±4.67*#20.19±7.78*#10.394＜0.001

2.2 電針對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響

小鼠海馬HE 染色結(jié)果顯示，空白組小鼠的神經(jīng)元分布均勻整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰。模型組小鼠神經(jīng)細(xì)胞分布紊亂不均勻，細(xì)胞核明顯縮小，細(xì)胞間隙明顯存在；與模型組相比，電針組和西藥組可見小鼠神經(jīng)元形態(tài)基本接近正常，結(jié)構(gòu)較清晰。見圖3。

圖3 各組小鼠干預(yù)后海馬組織病理形態(tài)（HE 染色）Fig 3 Hippocampal histological morphology of mice in each group after intervention（HE staining）

2.3 電 針 對 小 鼠 腦 組 織 內(nèi)GSK-3β、β-catenin 的影響

與空白組相比，模型組小鼠中的β-catenin 蛋白水平減少（P＜0.01），GSK-3β 蛋白水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，電針組、西藥組中的β-catenin蛋白表達(dá)顯著上升（P＜0.01），GSK-3β 蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。見圖4。

圖4 小鼠海馬β-catenin、GSK-3β 蛋白表達(dá)比較Fig 4 Comparison of β-catenin and GSK-3β protein expression in mouse hippocampus

3 討論

Aβ 沉積是AD 的重要病因，其沉積所產(chǎn)生的老年斑也是AD 的主要病理變化。Aβ 是由于淀粉樣前體蛋白在β 分泌酶和γ 分泌酶作用下水解而形成的一種蛋白，其難以溶解，易在突觸間隙內(nèi)大量聚集而導(dǎo)致老年斑的形成，老年斑一旦形成則會(huì)募集大量小膠質(zhì)細(xì)胞而產(chǎn)生神經(jīng)毒性［12］。正常情況下Aβ 始終保持一種動(dòng)態(tài)的平衡，當(dāng)Wnt/β-catenin 通路阻斷則會(huì)導(dǎo)致Aβ 失衡而大量沉積，沉積的Aβ 會(huì)通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元損害進(jìn)而加速AD 的發(fā)展［13，14］。

中醫(yī)認(rèn)為AD 與“癡呆”、“呆病”屬于同一范疇，其病機(jī)復(fù)雜，既有心血虧虛、脾氣虛衰、腎精不足等虛邪內(nèi)耗，也有痰濁瘀血等實(shí)邪蒙竅，其中腎精不足，髓海虧虛為根本病機(jī)。腎為封藏之本，內(nèi)藏腎精，腦髓的生成源于腎精，隨著年齡的增長，腎精逐漸虧損，腦海失充而影響腦的記憶功能，出現(xiàn)記憶力下降、呆傻愚鈍的表現(xiàn)，臨床治療上亦多從補(bǔ)腎益智出發(fā)?！鹅`樞·海論》中記載：“督脈貫脊……入屬于腦”，可見督脈直接溝通了腦絡(luò)，并與腎相連，百會(huì)穴作為督脈的要穴，位于巔頂，具有益智醒神之效；膀胱經(jīng)與腦相連，入腰中絡(luò)腎，可使氣血通暢，陰陽調(diào)和，腎俞位于膀胱經(jīng)，是腎精聚集之處，針刺腎俞能使腎生髓。因此本實(shí)驗(yàn)選取百會(huì)、腎俞兩穴位相配充分體現(xiàn)了補(bǔ)腎填精，醒神益智的中醫(yī)整體觀念。

傳統(tǒng)毫針針刺的刺激量決定機(jī)體是否得氣，且與療效密切相關(guān)，電針將針刺的刺激量量化及標(biāo)準(zhǔn)化，具有較好的治療效果［15］。鹽酸多奈哌齊［16］已被證實(shí)能夠緩解AD 的發(fā)展，但其長期口服存在一定副作用，且成本較高，而電針與其相比具有價(jià)格低廉，安全性較高的優(yōu)勢，且有研究發(fā)現(xiàn)［17，18］電針能夠通過影響突觸可塑性、降低腦部炎性反應(yīng)而改善小鼠認(rèn)知障礙，在臨床上有著良好的應(yīng)用前景。但對于電針降低Aβ 沉積的研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)擬從緩解Aβ 沉積造成的神經(jīng)元損傷角度出發(fā)，探討電針治療AD 的機(jī)制。

Wnt/β-catenin 信號(hào)途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用。Wnt 蛋白作為始動(dòng)因子與其它蛋白（如 Frizzled）等充分結(jié)合，從而降低GSK-3β 蛋白的活性，使β-catenin 蛋白快速累積，從而調(diào)節(jié)下游目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，最終啟動(dòng)該信號(hào)途徑的傳導(dǎo)［19］。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路受到抑制已被確認(rèn)與加速Aβ 沉積相關(guān)，其對神經(jīng)系統(tǒng)的損害表現(xiàn)在加重神經(jīng)毒性從而導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)元損害［20］。β-catenin 蛋白是Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)通路主要的正向調(diào)節(jié)因子，其過度磷酸化則不能激活下游基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制該通路，從而使Aβ 在腦內(nèi)積聚而形成老年斑，產(chǎn)生神經(jīng)毒性［21］。GSK-3β 作為決定降解β-Catenin 的重要負(fù)向調(diào)節(jié)激酶，其活性增強(qiáng)直接導(dǎo)致β-Catenin 磷酸化速度加快，使其被大量降解，從而阻斷Wnt/β-catenin 信號(hào)通路；此外GSK-3β 也會(huì)直接參與到β淀粉樣前體蛋白的酶解過程，其活性增強(qiáng)也會(huì)加速Aβ 的生成和沉積，反之沉積的Aβ 會(huì)造成GSK-3β過表達(dá)，從而過度降解β-catenin，進(jìn)一步阻斷信號(hào)通路，加重神經(jīng)元的損傷，促進(jìn)AD 的進(jìn)展［5，22］。由此可見，下調(diào)GSK-3β 表達(dá)，不僅可以直接加速Aβ 的清除，還可以減少β-catenin 蛋白的過度降解，促進(jìn)其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)而啟動(dòng)Wnt/β-catenin 信號(hào)途徑，降低Aβ 沉淀，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針、西藥處理均能改善小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。且電針干預(yù)后的HE 染色結(jié)果也表明小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列基本接近正常，表明電針能夠明顯改善AD 的認(rèn)知障礙。AD 的病理改變與腦中Aβ 的聚集有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)能夠降低與Aβ 沉積相關(guān)的GSK-3β 蛋白，并增加β-catenin蛋白的表達(dá)，提示電針對AD 小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的改善作用可能與 Aβ 聚集的減少有關(guān)。

綜上，電針干預(yù)可下調(diào)AD 小鼠海馬的GSK-3β表達(dá)，并上調(diào)β-catenin 表達(dá)，激活Wnt 信號(hào)通路，降低Aβ 的沉積，從而減少神經(jīng)元損傷。這為降低患者長期口服藥物存在的副作用以及經(jīng)濟(jì)壓力提供了新的輔助治療思路，也為深入研究不同頻率的電針改善小鼠認(rèn)知障礙的具體機(jī)制提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

陳子奇：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、數(shù)據(jù)處理與分析、撰寫論文；孫治琪：參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施；黃渤皓：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集；趙凡瑩：數(shù)據(jù)分析技術(shù)指導(dǎo)；劉子旺：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容統(tǒng)籌與規(guī)劃、技術(shù)指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。