李博雅，李 彤，祖向陽，王 沖，秦 玲

（1.河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院，河南 洛陽，471003；2.河南科技學醫(yī)學技術與工程學院，河南 洛陽，471000；3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院血液內科，河南 鄭州，450052）

急 性 髓 系 白 血 ?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種異質性的惡性克隆性疾病，是成人最常見的血液癌之一［1］。其特征在于造血祖細胞遺傳改變的積累及正常自我更新機制、細胞增殖及分化的改變［2，3］?；颊哳A后差別較大，死亡率高。AML的診斷和預后主要基于形態(tài)學、免疫表型、染色體核型和分子特征等［4］。臨床和遺傳學的預后標志物在AML 患者的評估和指導治療中至關重要［3］。最近的發(fā)現(xiàn)也揭示了轉錄失調和表觀遺傳機制在AML 發(fā)病機制中的重要作用［4］。

CANX（calnexin），位于人類5 號染色體（5q35）上，作為一種內質網(wǎng)分子伴侶蛋白通過多種方式參與蛋白質折疊、細胞能量平衡及自噬等過程［5］。一些研究發(fā)現(xiàn)，包括CANX 在內的不同預后模型與AML、膠質瘤及腎透明細胞癌等患者危險分層及預后 相 關［6-8］。研 究 發(fā) 現(xiàn)，CANX 在 肺 癌［9］、口 腔 鱗癌［10］及乳腺癌［11］等疾病中表達上調，可能作為一種生物標志物用于疾病診斷及治療。然而，CANX 在AML 中的作用機制及預后價值仍不清楚。本研究通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)了CANX 基因表達與AML 患者預后及免疫細胞浸潤相關。為AML 提供了新的潛在生物標志物。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

從UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫（http：//xena.ucsc.edu/）下載151 例AML 樣本（TCGA-LAML）（實驗組）及337 例健康人全血樣本（GTEx）的原始RNA 表達譜及 相 應 臨 床 信 息［12］。從GEO 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載包含422 例AML樣本的GSE37642 數(shù)據(jù)集（驗證組）的RNA 表達譜、平臺文件（GPL96-57554）及臨床信息［13］。RNA 表達數(shù)據(jù)均進行l(wèi)og2（FPKM+1）歸一化處理。從CellMiner 數(shù) 據(jù) 庫［14］（https：//discover.nci.nih.gov/cellminer/）下載60 種癌細胞株的RNA 表達數(shù)據(jù)及751 種藥物及化合物的半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）。為了更好的預測AML 患者的藥物敏感性，僅納入6 種白血病細胞株進行藥物敏感性分析。

1.2 AML 中CANX 的 表 達 水 平

使用TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫（http：//timer.cistrome.org/）探索CANX 在所有TCGA 腫瘤及正常組織間的表達情況［15］。使用“l(fā)imma”R 包分別將實驗組及驗證組中的RNA 表達譜與GTEx 健康樣本中的RNA 表達譜進行合并，得到相應的RNA 表達矩陣。并從中提取出CANX 表達水平得到相應的CANX表達矩陣。利用“l(fā)imma”及“beeswarm”R 包進行差異表達分析發(fā)現(xiàn)AML 樣本及健康樣本間的CANX表達差異。

1.3 AML 患者的預后分析

排除無完整生存信息的樣本，將TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中132 例AML 樣本及GSE37642 數(shù)據(jù)集中417 例AML 樣本納入生存分析。利用“survival”R包繪制K-M 生存曲線探索CANX 表達與AML 患者生存的關系?；赥CGA-LAML 數(shù)據(jù)集中患者生存數(shù)據(jù)（死亡或復發(fā)），使用X-tile 3.6.1 軟件計算患者最佳總生存時間（overall survival，OS）閾值［16］。根據(jù)中位最佳OS 閾值將患者分為CANX 高表達組（n=40）及低表達組（n=92），以探討CANX 表達的臨床意義。利用“survival”R 包進行單因素及多因素COX 回歸分析發(fā)現(xiàn)AML 患者的獨立預后因素。P均＜0.05 的變量被認為是AML 患者預后的獨立危險因素。使用“readxl”R 包預測CANX 表達與藥物敏感性的關系。

1.4 CANX 與免疫細胞浸潤相關

從TCGA-LAML 的RNA 表達矩陣中提取出編碼mRNA 的基因及其表達量，得到mRNA 表達矩陣。去除在所有樣本中均不表達的基因，并對重復基因取均值，得到校正后mRNA 表達矩陣。以P＜0.05 為篩選標準，使用“e1071”、“parallel”及“preprocessCore”R 包通過CIBERSORT 算法［17］得到91例AML 樣本及335 例健康樣本的22 種免疫細胞相對組成矩陣。使用“vioplot”R 包繪制小提琴圖觀察22 種免疫細胞在正常及腫瘤樣本中的表達差異。使用“corrplot”R 包繪制相關性熱圖發(fā)現(xiàn)免疫細胞間的相互作用關系。根據(jù)免疫細胞的中位表達值將生存信息完整的81 例AML 樣本分為高表達組及低 表 達 組，使 用“survival”R 包 繪 制Kaplan-Meier（K-M）生存曲線發(fā)現(xiàn)免疫細胞表達及患者生存的關系。隨后，分析CANX 表達與生存相關免疫細胞的相關性。

1.5 統(tǒng)計學處理

R4.1.0 軟件用于本文中所有統(tǒng)計分析。P＜0.05 有統(tǒng)計學意義。采用Wilcoxon 檢驗進行差異表達分析。采用K-M 法及Log-Rank 檢驗評估CANX 及免疫細胞表達與患者生存的關系。采用χ2檢驗評估CANX 表達與臨床性狀間的相關性。采用Pearson 相關性分析預測CANX 表達與藥物敏感性、免疫細胞及免疫細胞間的關系。Cor＞0 表示二者呈正調控，Cor＜0 表示二者呈負調控。

2 結果

2.1 CANX 在AML 中 高 表 達

使用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析了CANX 在多種腫瘤中的表達情況。結果顯示，CANX 在膽管癌［18］、結腸腺癌（COAD）、食管癌（ESCA）、頭頸部鱗狀細胞癌（HNSC）及腎透明細胞癌（KIRC）等13 種腫瘤及正常組織間的差異表達具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1A）。為了探索CANX 在AML 及健康樣本中的表達差異，對實驗組（TCGA-LAML）中的CANX表達矩陣進行差異表達分析。發(fā)現(xiàn)CANX 在AML樣本的表達水平高于健康樣本（F=0.1057；P=1.993e-13）（圖1B）。此外，使用驗證組（GSE37642數(shù)據(jù)集）進行差異分析得到同樣的結論（F=2.0904；P=4.109e-124）（圖1C）。

圖1 CANX 在AML 中高表達Fig 1 High expression of CANX in AML

2.2 CANX 高表達與AML 患者預后良好相關

分別對實驗組（圖2A）及驗證組（圖2B）中的CANX 高表達及低表達組進行患者生存期比較。繪制K-M 生存曲線發(fā)現(xiàn)，CANX 高表達組均有更好的生存率（TCGA-LAML：P=0.012；GSE37642：P=0.016），表明CANX 高表達與患者預后良好相關。

圖2 CANX 高表達與患者預后良好相關Fig 2 High expression of CANX was associated with favorable prognosis

2.3 CANX 表達與臨床性狀相關性

為了探討CANX 表達的臨床意義，基于TCGA-LAML 數(shù)據(jù)集分析了CANX 高表達組及低表達組間臨床性狀的差異（表1）。結果顯示，兩組間的年齡（P=0.005）、生存狀態(tài)（P=0.016）、FAB分期（P=0.001）及染色體核型（P=5.77e-05）均具有顯著統(tǒng)計學差異，表明CANX 表達與以上臨床性狀相關。

表1 TCGA-LAML 中132 例AML 患者CANX 表達及臨床性狀的關系Tab 1 Association between CANX expression and the clinical characteristics in 132 AML patients in TCGA-LAML

2.4 AML 患者的獨立預后分析

進一步對TCGA 數(shù)據(jù)集中132 例AML 樣本進行獨立預后分析，通過單因素（圖3A）及多因素（圖3B）COX 回歸分析繪制森林圖。單因素COX 回歸分 析 顯 示 年 齡（P＜0.001；HR：1.035；95%CI：1.019-1.051）、核 型（P＜0.001；HR：1.962；95%CI：1.410-2.731）、白 細 胞 表 達 量（P=0.026；HR：1.005；95%CI：1.001-1.010）及CANX 表達量（P=0.002；HR：0.601；95%CI：0.439-0.824）與患者預后相關。多因素COX 回歸分析顯示年齡（P＜0.001；HR：1.037；95%CI：1.019-1.055）、核 型（P=0.007；HR：1.716；95%CI：1.159- 2.541）及CANX 表 達 量（P=0.003；HR：0.794；95%CI：0.646-0.157）與患者預后相關。推測年齡、染色體核型及CANX 表達量均為AML 患者獨立預后因素（P＜0.05）。CANX 表達量的置信區(qū)間在無效線的左側，說明CANX 的高表達是一種保護因子。這一結論與K-M 生存分析一致（圖2A、2B）。將AML 患者根據(jù)不同年齡（圖3C）和染色體核型分組（圖3D）進行K-M 生存分析發(fā)現(xiàn)，低齡和良好染色體核型患者擁有更好的生存率（P＜0.001）。

圖3 TCGA-LAML 患者的獨立預后分析Fig 3 Independent prognostic analysis in TCGA-LAML

2.5 藥物敏感性分析

基于CellMiner 數(shù)據(jù)庫中6 種白血病細胞株的RNA 表達數(shù)據(jù)和751 種藥物IC50數(shù)據(jù)，分析CANX表達與藥物療效的關系（圖4）。結果顯示，CANX表達增加可能使患者對司美替尼（selumetinib，Cor=0.885；P=0.030）等藥物耐藥，但對馱瑞塞爾（temsirolimus，Cor=-0.901；P=0.014）、奧沙利鉑（oxaliplatin，Cor=-0.864；P=0.027）、長春新堿（vincristine，Cor=-0.856；P=0.030）及拉帕替尼（lapatinib，Cor=-0.817；P=0.047）等藥物敏感性增加。

圖4 CANX 表達與藥物敏感性的關系Fig 4 Relationship between CANX expression and drug sensitivity

2.6 CANX 與免疫細胞浸潤相關

根據(jù)22 種免疫細胞的相對組成繪制小提琴圖觀察免疫細胞在腫瘤及健康樣本中的表達差異（紅色代表腫瘤樣本，藍色代表健康樣本）（圖5A）。其中，17 種免疫細胞在腫瘤及健康樣本中的差異表達具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。繪制22 種免疫細胞的相關性熱圖，發(fā)現(xiàn)22 種免疫細胞間存在不同程度的相關性。其中，CD8 T 細胞與未活化的自然殺傷細胞呈顯著正相關（Cor=0.62），與初始CD4 T 細胞呈顯著負相關（Cor=-0.53）（圖5B）。對17 種差異表達的免疫細胞進行K-M 生存分析，發(fā)現(xiàn)M1 巨噬細胞（P＜0.001）、濾泡輔助性T 細胞（P=0.023）及CD8 T 細胞（P=0.044）表達增加與AML 患者預后良好相關（圖5C-5E）。最后，通過Pearson 相關性分析發(fā)現(xiàn)CANX 表達與M1 巨噬細胞（Cor=0.328；P=0.003）及CD8 T 細 胞（Cor=0.287；P=0.013）表達呈正相關（圖5F～5G）。

圖5 免疫細胞浸潤分析Fig 5 Analysis of immune cell infiltration

3 討論

AML 是一種原始造血干細胞或祖細胞克隆性增殖的異質性疾?。?8］。主要表現(xiàn)為髓系原始細胞異常增生，抑制正常骨髓造血功能，出現(xiàn)血細胞減少相關癥狀及白血病細胞增殖浸潤的表現(xiàn)。AML的臨床和基因組多樣性使復發(fā)/難治性AML 治療標準的建立面臨許多困難［19］。分子靶向藥物將是AML 誘導和鞏固治療的標準方法，并作為鞏固治療后的維持治療［20］。分子檢測作為診斷檢查的一部分在AML 診療過程中起重要作用［21］。

本研究中分析了AML 患者CANX 的表達及其與臨床性狀和預后的關系。通過TIMER 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CANX 在多種腫瘤中表達高于臨近正常組織（圖1A）。使 用R 語 言 對TCGA-LAML 及GSE37642 數(shù) 據(jù) 集 進 行 分 析，發(fā) 現(xiàn)CANX 在AML 組中高表達，且其高表達與患者預后良好相關（圖1B-1C，圖2）。基于TCGA-LAML 數(shù)據(jù)集分析了CANX 表達與患者臨床性狀的相關性，發(fā)現(xiàn)CANX表達與患者年齡、生存狀態(tài)、FAB 分期及染色體核型均相關（表1）。一些研究已使用相同的方法探索基因與患者臨床性狀的相關性［22］。對AML 患者的獨立預后分析發(fā)現(xiàn)，CANX 高表達、低齡及染色體良好核型是患者預后良好的獨立預測因素（圖3）。本研究表明，CANX 可能作為一種抑癌基因與患者預后良好相關（圖2-3A-3B）。藥物敏感性分析發(fā)現(xiàn)CANX 表達使AML 患者對多種藥物增敏或耐藥，未來有可能用于提升患者的藥物療效。在免疫細胞浸潤分析中，CANX 的表達與M1 巨噬細胞及CD8+T 細胞表達正相關。CANX 與M1 巨噬細胞及CD8+T 細胞間的關系仍不十分清楚，值得我們進一步探索。這些結果證明CANX 可能作為AML的潛在生物標志物，有助于AML 患者的精確預后和分層并指導AML 患者的精準診療。

當前，CANX 在白血病中的作用機制尚不清楚。Azuma 等［23］發(fā) 現(xiàn)，CANX 和CRT 可 以 在 凋 亡等細胞應激及米托蒽醌等化療藥物刺激下易位到細胞表面，其在細胞表面表達增加可作為化療后吞噬細胞清除死亡細胞的信號。研究發(fā)現(xiàn)CANX 作為參與主要組織相容性復合體-Ⅰ（major histocompatibility complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ）抗原提呈的重要組分之一，影響MHC-Ⅰ的組裝和表達。MHC-Ⅰ在腫瘤細胞表面低表達有助于腫瘤細胞逃避T 細胞的識別及破壞，參與腫瘤免疫逃逸的發(fā)生［24］。Zheng 等［25］研 究 發(fā) 現(xiàn) 抑 制miR-148a-3p 可 以 恢 復 結直腸癌細胞表面MHC-Ⅰ水平，并通過促進CANX表達顯著增強CD8+T 細胞介導的免疫攻擊作用。miR-148a-3p 可能通過靶向CANX/MHC-Ⅰ軸促進疾病進展。表明靶向 miR-148a-3p/CANX/MHC-Ⅰ通路可能作為結直腸癌患者的一種免疫治療方法。與之相反的是，Jung 等［26］發(fā)現(xiàn)CANX 在口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中表達上調與腫瘤組織中T 細胞浸潤的抑制有關，并與患者預后不良有關。CANX 可以抑制CD4+及CD8+T 細胞的增殖，并抑制這些細胞中IFNγ、TNFα 及IL2 的分泌。在黑色素瘤模型中，敲除CANX 增強了T 細胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤和效應功能，并能更好地控制腫瘤的生長。此外，CANX 通過抑制PD-1 啟動子中CpG 島的DNA 甲基化狀態(tài)來增強CD4+及CD8+T 細胞上PD-1 的表達。表明CANX 可能作為抗腫瘤免疫治療的潛在靶點。這為未來CANX 發(fā)展為AML 可能的免疫治療靶點提供理論依據(jù)。當前，化療仍是AML 患者治療的主要方法，僅不到三分之一的AML 患者可獲得長期緩解。復發(fā)和耐藥仍是當前AML 患者治療失敗和死亡的主要原因［27］。免疫治療有望根除化療耐藥性，使疾病得到長期緩解。當前AML 的免疫治療方法主要有抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC）、嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor-modified T cells，CAR-T）療法、免疫 檢 查 點 抑 制 劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）及免疫調節(jié)劑等［28］。當前，免疫療法已應用于多種惡性腫瘤的治療。然而，目前只有抗CD33 ADC 吉妥珠單抗奧唑米星（gemtuzumab ozogamicin，GO）被批準用于AML 患者［29］。這促使繼續(xù)深入研究免疫治療，本研究為發(fā)現(xiàn)AML 新的生物標志物提供證據(jù)。

在本研究中重點關注了CANX 的預后價值，通過整合基因表達、生存、藥物療效及免疫細胞浸潤等數(shù)據(jù)探索基因表達與AML 患者預后間的關系，首次發(fā)現(xiàn)并報道了CANX 高表達預示AML 患者預后良好的現(xiàn)象。本研究的主要局限性在于樣本量較小，為了確保研究結果和假設的可靠性和代表性，未來應擴大樣本進行進一步研究。也對其潛在的生物學機制很感興趣，正在準備相關的實驗及臨床驗證CANX 的生物學功能及其預后價值。

作者貢獻度說明：

李博雅：構思和設計研究；李博雅、李彤：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析及撰寫稿件；祖向陽、王沖：修改稿件。秦玲：構思和設計研究，并對稿件進行指導和審核。所有作者均閱讀并同意稿件發(fā)表。