王姝昊，常肖璐，趙 磊，孫紫洋，樸俊杰，林貞花，金愛(ài)花

結(jié)腸癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是全球癌癥死亡的主要原因[1]，其發(fā)病率在全球位居第3位，病死率位居第2位[2]，且其發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)[3]。預(yù)計(jì)2030年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)將超過(guò)220萬(wàn)，死亡例數(shù)將達(dá)110萬(wàn)[4]。隨著醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的普查、診斷、預(yù)后評(píng)估和評(píng)價(jià)療效等起重要作用。CA19-9、AFP、CEA等是應(yīng)用較為廣泛的腫瘤血清標(biāo)志物，由于結(jié)腸癌組織的異質(zhì)性和復(fù)雜性，目前尚未發(fā)現(xiàn)特異性較高的結(jié)腸癌標(biāo)志物。因此，篩選可應(yīng)用于臨床的高特異性結(jié)腸癌標(biāo)志物是當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題。

富含絲氨酸/精氨酸剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1, SRSF1)又稱為SF2/ASF，屬于典型的SR蛋白家族成員[5]，其主要功能是參與細(xì)胞內(nèi)mRNA的剪接作用。研究顯示SRSF1可通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的剪接過(guò)程，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。已有研究證實(shí)SRSF1高表達(dá)普遍存在于乳腺癌[7]、肺癌[8]、胃癌[9]等多種惡性腫瘤中，被認(rèn)為是一種重要的原癌蛋白[10]。目前，關(guān)于SRSF1蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少。因此，本文擬通過(guò)分析SRSF1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，旨在為結(jié)腸癌的診斷提供潛在的分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料結(jié)腸癌組織芯片(HColA180Su19)購(gòu)自上海芯超公司，其中結(jié)腸癌組織94例，結(jié)腸癌癌旁正常組織86例，合計(jì)180點(diǎn)位。94例患者中男性48例，女性46例；年齡27～90歲，中位年齡65歲。隨訪截至2015年7月，患者生存期最長(zhǎng)為78個(gè)月，最短為11天，中位生存期為70(23,75)個(gè)月。臨床病理分期采用AJCC第七版癌癥分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)分析應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索SRSF1 mRNA在33種腫瘤組織中的表達(dá)，通過(guò)TCGA官方數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站下載結(jié)腸癌STAR-Counts基因表達(dá)數(shù)據(jù)，整理獲得mRNA差異表達(dá)矩陣，分析結(jié)腸癌與癌旁正常組織中SRSF1 mRNA表達(dá)水平的差異。應(yīng)用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)腸癌與癌旁正常組織中SRSF1 mRNA表達(dá)水平的差異。

1.3 免疫組化采用免疫組化SP法染色，切片常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)，加入一抗SRSF1(1 ∶50稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜；次日滴加二抗，DAB顯色，Mayer蘇木精對(duì)比染色，中性樹(shù)膠封固。免疫組化檢測(cè)SRSF1蛋白抗體的特異性，用已知陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷SRSF1定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中呈棕褐色為陽(yáng)性，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行判斷。(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；黃褐色為3分。(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0～5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。將上述兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～3分為(-)，4～6分為(+)，7～9分為()，10～12分為()。其中，將()和()定義為SRSF1高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)方法，運(yùn)用Kaplan-Meier法和Cox回歸模型進(jìn)行生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌中SRSF1 mRNA的表達(dá)通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索SRSF1基因在不同腫瘤中的表達(dá)，結(jié)果顯示：SRSF1 mRNA在多種腫瘤組織(膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤(rùn)癌、食管癌、結(jié)腸癌等)中表達(dá)增高；而在腎嫌色細(xì)胞癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤中表達(dá)降低(圖1A)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)還顯示SRSF1 mRNA在473例結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于41例正常結(jié)腸組織(P<0.01，圖1B)；GEO檢索顯示GSE74604數(shù)據(jù)集中SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平為(7 369.9±1 328.7)TPM，顯著高于癌旁正常組織的(4 006.5±801.8)TPM(P<0.01,圖1C)；GES10972數(shù)據(jù)集同樣顯示SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平為(0.29±0.36)TPM，顯著高于癌旁正常組織的(-0.40±0.33)TPM(P<0.01，圖1D)。

圖1 SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性：A.SRSF1 mRNA在多種腫瘤中的表達(dá)(TCGA)；B.SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)(TCGA)；C.SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)(GSE74604數(shù)據(jù)集)；D.SRSF1 mRNA在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)(GES10972數(shù)據(jù)集)；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.2 結(jié)腸癌中SRSF1蛋白的表達(dá)本組對(duì)94例結(jié)腸癌組織及86例癌旁正常組織進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示：SRSF1主要表達(dá)于結(jié)腸癌細(xì)胞胞核與胞質(zhì)內(nèi)(圖2)。SRSF1蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性率和高表達(dá)率分別為92.6%(87/94)和67.0%(63/94)；在癌旁正常組織中的陽(yáng)性率和高表達(dá)率分別為57.0%(49/86)、11.6%(10/86)。結(jié)腸癌組織中SRSF1蛋白表達(dá)與癌旁正常組織中相比，其在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

ABCD

表1 結(jié)腸癌、癌旁正常組織中SRSF1蛋白的表達(dá)

2.3 結(jié)腸癌中SRSF1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系SRSF1蛋白高表達(dá)與患者臨床分期(χ2=4.835，P=0.028)密切相關(guān)，與患者性別(χ2=0.133，P=0.716)、年齡(χ2=1.178，P=0.278)、腫瘤大小(χ2=0.417，P=0.519)、分化程度(χ2=2.153，P=0.142)、原發(fā)腫瘤(T)分期(χ2=1.234，P=0.267)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=3.700，P=0.054)無(wú)關(guān)(表2)。在臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者中SRSF1蛋白的高表達(dá)率為80.6%(29/36)，顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(58.6%，34/58，P<0.05，表2)。

表2 結(jié)腸癌中SRSF1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 結(jié)腸癌中SRSF1蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：SRSF1蛋白高表達(dá)結(jié)腸癌患者的總生存期顯著低于SRSF1蛋白低表達(dá)者(P=0.040，圖3A)。為進(jìn)一步分析SRSF1蛋白表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響，分別將結(jié)腸癌患者按分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、原發(fā)腫瘤(T)分期及腫瘤大小分成亞組進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示：在pT為3～4及腫瘤最大徑>5 cm的亞組中，SRSF1蛋白高表達(dá)患者預(yù)后較差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3B、C)。Cox單因素回歸分析顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR：3.638，95%CI=1.913～6.917，P<0.001)、高臨床腫瘤分期(HR：4.313，95%CI=2.228～8.348，P<0.001)及SRSF1蛋白高表達(dá)(HR：2.130，95%CI=1.010～4.492，P=0.047)是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(圖4)。

圖3 結(jié)腸癌中SRSF1蛋白表達(dá)與患者生存期的關(guān)系：A.SRSF1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者總生存期的關(guān)系；B.SRSF1表達(dá)水平與pT為3～4的結(jié)腸癌患者生存期的關(guān)系；C.SRSF1表達(dá)水平與腫瘤最大徑>5 cm的結(jié)腸癌患者生存期的關(guān)系

圖4 Cox單因素回歸分析結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素：SRSF1蛋白高表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床腫瘤分期高是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷提高，人類的平均壽命得以延長(zhǎng)，然而惡性腫瘤的發(fā)生率卻不斷攀升，其中結(jié)腸癌已經(jīng)成為影響人類生命健康的重要危險(xiǎn)因素[11]。根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)GLOBOCAN 2020數(shù)據(jù)顯示，全球約94萬(wàn)人死于結(jié)腸癌[12]。由于結(jié)腸癌發(fā)病具有極強(qiáng)的隱匿性，早期診斷率較低，大多數(shù)患者在確診時(shí)已為中晚期[13]。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展受許多因子共同調(diào)控，這些調(diào)節(jié)因子可以調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤進(jìn)展的作用[14]。剪接因子SRSF1是一種多功能蛋白質(zhì)，參與調(diào)節(jié)選擇性剪接與RNA代謝相關(guān)的過(guò)程。通常在癌癥中可以觀察到SRSF1表達(dá)的改變，包括選擇性剪接、mRNA穩(wěn)定性以及癌基因和腫瘤抑制因子的翻譯紊亂。由于SRSF1在腫瘤進(jìn)展中的重要作用，其有望成為抗癌治療的靶點(diǎn)[15]。SRSF1位于染色體17q23上，該位點(diǎn)在某些腫瘤中通常被擴(kuò)增且與不良預(yù)后相關(guān)[16-17]。Gout等[18]發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，非小細(xì)胞肺癌中這些剪接調(diào)節(jié)因子的整體過(guò)度表達(dá)與腺癌更具侵襲性的臨床病理特征相關(guān)。Gout等提供的證據(jù)表明，人肺腺癌細(xì)胞模型中SRSF1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致p42/44MAPK和AKT信號(hào)通路的激活，軟瓊脂中菌落形成增加，上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，以及對(duì)卡鉑和紫杉醇的耐藥性，從而導(dǎo)致更具攻擊性的表型。

目前，已有研究顯示SRSF1的異常表達(dá)發(fā)生在不同的腫瘤中。祝興旺等[19]發(fā)現(xiàn)SRSF1在膀胱尿路上皮細(xì)胞癌中高表達(dá)，并且與腫瘤的初發(fā)和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Du等[20]采用免疫組化染色法和qRT-PCR分析證實(shí)：與正常組織相比，腫瘤組織中SRSF1在蛋白和mRNA水平顯著均上調(diào)。Sheng等[21]通過(guò)KEGG分析發(fā)現(xiàn)，SRSF1的相關(guān)基因主要富集于細(xì)胞周期、腫瘤相關(guān)信號(hào)通路以及結(jié)腸癌相關(guān)信號(hào)通路，但尚未對(duì)結(jié)腸癌組織中SRSF1蛋白的表達(dá)及其臨床意義進(jìn)行深入分析。本組對(duì)94例結(jié)腸癌和86例癌旁正常組織進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)SRSF1在結(jié)腸癌組織中顯著高表達(dá)，且其高表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床分期密切相關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明SRSF1在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

有研究顯示，SRSF1蛋白是多種腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物。Liu等[22]通過(guò)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，SRSF1細(xì)胞核表達(dá)較高的患者總生存率較低。盛俊秀等[23]收集60例肺癌患者的臨床數(shù)據(jù)，分析SRSF1在肺癌組織中的表達(dá)與生存率的相關(guān)性，結(jié)果表明SRSF1高表達(dá)患者的生存率明顯低于SRSF1低表達(dá)患者。本組結(jié)果顯示：隨著SRSF1表達(dá)水平越高，結(jié)腸癌患者的生存期越短、預(yù)后越差，提示SRSF1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)可作為潛在的腫瘤標(biāo)志物，其對(duì)臨床診療中的預(yù)后判斷具有重要指導(dǎo)意義。此外，SRSF1作為結(jié)腸癌患者的預(yù)后獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，或許可以通過(guò)降低SRSF1表達(dá)水平干預(yù)結(jié)腸癌的進(jìn)展，促進(jìn)患者預(yù)后。由于SRSF1在結(jié)腸癌中的分子作用機(jī)制尚未完全明確，還需積累更多病例進(jìn)一步分析。