姜晨霞，章小霞，張 曙，王 燕

肝癌是人類常見的腫瘤，全球每年新增病例超過84萬例，死亡超過8萬例[1]。其中75%～80%的患者屬于肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，其破壞力強，5年總生存率低[2]。目前，HCC主要的治療方式仍為手術(shù)切除，術(shù)后的轉(zhuǎn)移率及復(fù)發(fā)率較高[3]。信號素(semaphorin, SEMA)也稱為神經(jīng)引導(dǎo)分子，可調(diào)節(jié)軸突的功能活動。SEMA5A作為SEMA家族的成員之一，在多種病理、生理過程中發(fā)揮重要作用[4]，既可控制細胞遷移、導(dǎo)向軸突生長錐，還在機體免疫、血管生成及腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮作用[5]。研究表明，SEMA5A在多種腫瘤中具有促進和抑制腫瘤的雙重作用[6]。文獻報道肝臟中SEMA5A、TNNT3和HOXA5等被歸類為差異甲基化基因，有望成為肝組織特異性的生物學(xué)標志物[7]。目前，SEMA5A在人HCC中的表達、Ki-67的關(guān)系及其臨床意義國內(nèi)尚未有報道。本文檢測神經(jīng)導(dǎo)向分子SEMA5A及Ki-67在HCC中的表達，探討兩者的相關(guān)性及其對HCC惡性生物學(xué)行為及患者預(yù)后的影響，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2009年8月～2012年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院收治的168例HCC組織及相應(yīng)癌旁正常組織(癌旁>2 cm)，其中男性128例，女性40例；年齡26～81歲，平均(55.25±11.07)歲。納入標準：病理均證實為HCC；均未伴發(fā)其他惡性腫瘤及嚴重的基礎(chǔ)性疾?。恍g(shù)前未行任何抗腫瘤治療等?；颊叩呐R床及病理資料均完整，可經(jīng)電話等追蹤隨訪，無失訪(截至日期2017年12月31日)。TNM分期采用國際癌癥控制聯(lián)盟(UICC)以及美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)推薦的第8版TNM分類。本實驗經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 生物信息學(xué)分析利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)中的“TGCA Gene analysis”，分析SEMA5A基因在HCC中的表達，利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)分析其表達與HCC患者總生存率的關(guān)系。

1.3 免疫組化標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)4 μm厚連續(xù)切片，附于載玻片上，經(jīng)65 ℃烤片1.5 h。鼠抗人SEMA5A、Ki-67一抗及HRP標記二抗，均購自美國Invitrogen公司。免疫組化EnVision法試劑盒，購自北京中杉金橋公司。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷SEMA5A蛋白定位于細胞質(zhì)和(或)細胞膜，Ki-67蛋白定位于細胞核，以呈棕黃色或黃褐色顆粒為陽性。兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進行判斷。SEMA5A蛋白的判讀標準：隨機選取熱點區(qū)5個高倍視野(×400)，根據(jù)陽性細胞染色程度和陽性細胞百分比進行評分。(1)根據(jù)陽性細胞染色程度計分：未著色為0分、淺黃色為1分、淺褐色為2分、褐色為3分；(2)根據(jù)陽性細胞百分比計分：陽性細胞數(shù)<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、>50%為3分。將兩項評分相加：0～3分為低或不表達，4～6為高表達。Ki-67蛋白判讀標準：高倍鏡下隨機選取10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞占鏡下細胞的百分比，陽性細胞數(shù)≥10%為高表達，﹤10%為低或不表達。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析UALCAN數(shù)據(jù)庫分析顯示：HCC(n=371)中SEMA5A 基因表達量低于正常肝組織(n=50)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=4.875500E-02，圖1A)。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析顯示：SEMA5A高表達組患者的總生存率高于低或不表達組患者(HR=0.64，P=0.01，圖1B)。上述結(jié)果提示SEMA5A在HCC中表達量低，且與患者的生存率呈正相關(guān)。

圖1 SEMA5A在肝細胞癌中的生物信息學(xué)分析：A.UALCAN數(shù)據(jù)庫分析SEMA5A基因在肝細胞癌中的表達；B.Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析SEMA5A表達與肝細胞癌患者的關(guān)系

2.2 HCC、癌旁正常組織中SEMA5A、Ki-67的蛋白表達HCC的病理切片鏡下顯示：正常的肝組織結(jié)構(gòu)破壞，癌細胞為圓形或多角形，呈巢狀或者條索狀排列，索間有豐富的血竇，細胞核大、深染，核仁明顯(圖2A)。癌旁肝組織結(jié)構(gòu)正常，細胞未見明顯異型(圖2B)。

免疫組化顯示：在HCC組織中SEMA5A蛋白表達降低，Ki-67表達增高(圖3)。HCC中SEMA5A蛋白的高表達率為44.6%(75/168)，低于癌旁正常組織(70.2%，118/168)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.510，P<0.001，表1)。Ki-67在HCC中的高表達率為72.0%(121/168)，高于癌旁正常組織(40.5%，68/168)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.971，P<0.001，表1)。

表1 肝細胞癌、癌旁正常肝組織中SEMA5A蛋白的表達[n(%)]

②A②B③A③B③C③D

2.3 HCC中SEMA5A蛋白表達與Ki-67蛋白表達的相關(guān)性HCC中Ki-67低或不表達組中SEMA5A高表達率為75.4%，Ki-67高表達組中SEMA5A高表達率為33.1%。Spearman相關(guān)分析顯示，SEMA5A與Ki-67表達呈負相關(guān)(r=-0.374，P<0.001，表2)。

表2 肝細胞癌中SEMA5A與Ki-67蛋白表達的相關(guān)性分析[n(%)]

2.4 HCC中SEMA5A、Ki-67蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系HCC患者中SEMA5A蛋白高表達率在腫瘤大小(χ2=6.744，P=0.009)、腫瘤數(shù)目(χ2=4.895，P=0.027)、分化程度(χ2=7.332，P=0.026)及TNM分期(χ2=14.809，P=0.001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Ki-67蛋白高表達率在腫瘤分化程度(χ2=39.072，P<0.001)及TNM分期(χ2=7.991，P=0.018，表3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 SEMA5A、Ki-67蛋白表達與HCC患者生存和預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線顯示：SEMA5A高表達組患者的總生存率高于低或不表達組(χ2=74.244，P<0.001，圖4A)，Ki-67高表達組患者的總生存率低于低或不表達組(χ2=52.710，P<0.001，圖4B)，HCC患者的總生存率隨著TNM分期增高而降低(χ2=32.381，P<0.001，圖4C)。

Cox單因素、多因素比例風險回歸分析顯示：SEMA5A高表達、Ki-67低或不表達及TNM低分期顯著降低患者的死亡風險，可作為HCC患者獨立的預(yù)后因子(表4)。

3 討論

肝癌是肝硬化患者死亡的主要原因[8]，5年生存率僅為18%[9]，其發(fā)生、發(fā)展的分子機制仍不清楚[10]。目前，晚期HCC的主要治療是藥物靶向治療，療效不理想，且耐藥性與不良反應(yīng)對藥物的持續(xù)使用有所限制[11]。因此，尋找HCC分子靶點及預(yù)測靶向治療效果的臨床研究勢在必行。

圖4 Kaplan-Meier生存曲線：A.SEMA5A蛋白表達與肝細胞癌患者總生存期的關(guān)系；B.Ki-67蛋白表達與肝細胞癌患者總生存期的關(guān)系；C.TNM分期與肝細胞癌患者總生存期的關(guān)系

表3 肝細胞癌中SEMA5A、Ki-67蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表4 Cox單因素和多因素分析SEMA5A、Ki-67蛋白表達與預(yù)后的關(guān)系

SEMA5A是Semaphorin家族的V類，定位于人染色體5p15.2上，全長51.8 kb，是一種完整的膜蛋白，包含1個SEMA結(jié)構(gòu)域、1個特征性結(jié)構(gòu)域“TSP-1”和1個短胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，TSP-1可激活TGF-β1，而TGF-β1的表達與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后密切相關(guān)[12]，其膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解的胞外結(jié)構(gòu)域在腫瘤中可能發(fā)揮不同作用[13]。

SEMA5A可驅(qū)動先天性和獲得性免疫反應(yīng)，慢性自發(fā)性蕁麻疹中IL-17的表達與SEMA5A的表達量有關(guān)[14]，SEMA5A可參與APC引起的抗原呈遞作用，下調(diào)受體plexinB3的表達，參與Th1極化[15]。SEMA5A也可作為促血管生成因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、遷移，抑制凋亡，是細胞遷移和癌癥器官特異性歸巢細胞轉(zhuǎn)移過程中的必要分子[4]，但其在不同的細胞及功能的不同階段發(fā)揮作用并不相同[5]。SEMA5A在不同類型的癌癥中作用相反[16]，SEMA5A可通過調(diào)節(jié)GFAP的表達及干擾素信號通路發(fā)揮抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]和肺腺癌[13,16]的作用，而對胰腺癌[6]、胃癌[17-18]、膀胱癌[19]、多發(fā)性骨髓瘤[20]、子宮內(nèi)膜癌[21]及黑色素瘤[22]SEMA5A則起促進作用，該作用可能與TGF-β1及PI3K/Akt通路在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移上的作用密切相關(guān)。對慢性丙型肝炎患者的血清研究發(fā)現(xiàn)，SEMA5A可視為慢性丙型肝炎肝損傷的標志物之一，但其在HCC中的表達水平及具體的作用尚不清楚。

本組生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SEMA5A在HCC中表達量降低，且與癌癥患者的術(shù)后總生存率密切相關(guān)。由此，我們推測SEMA5A的表達水平的高低可能與HCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Ki-67是一種核蛋白，已作為增殖細胞標志物廣泛應(yīng)用于臨床，其表達高低與腫瘤細胞的增殖活躍程度、分化程度、惡性程度(浸潤、轉(zhuǎn)移)及患者預(yù)后密切相關(guān)[23]。為了進一步驗證SEMA5A在HCC中的作用，本組采用免疫組化檢測168例HCC患者中SEMA5A蛋白的表達及與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示SEMA5A蛋白在HCC中的高表達率低，且與Ki-67蛋白的表達呈負相關(guān)，SEMA5A蛋白的高表達率在腫瘤的大小、數(shù)目、分化程度及TNM分期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Kaplan-Meier生存分析及預(yù)后分析顯示：SEMA5A蛋白的表達水平與HCC患者的生存及預(yù)后顯著相關(guān)，可獨立作為患者預(yù)后的預(yù)測因子。根據(jù)以上結(jié)果，我們推測SEMA5A可能通過抑制HCC癌細胞的分裂和增殖，抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，最終影響患者的生存和預(yù)后。

綜上所述，SEMA5A在HCC中的低或不表達，其可評估HCC的惡性生物學(xué)行為及患者的預(yù)后，但具體的作用及分子機制需要在細胞學(xué)及分子生物學(xué)水平進一步分析。