劉雯潔，吳忻禹，劉碧涵，何 林，張陸成，黎永青

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究中心，廣西 南寧 530021；3.東莞理工學(xué)院電子工程與智能化學(xué)院，廣東 東莞 523808）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SAU）是一種革蘭陽(yáng)性球菌，是人類(lèi)和動(dòng)物微生物感染的重要病原體[1]，在全球范圍內(nèi)，每年在引起的不復(fù)雜的皮膚感染數(shù)量難以估計(jì)，可能有數(shù)十萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)例更嚴(yán)重的侵入性感染[2]，可以造成呼吸道以及創(chuàng)口的感染，心內(nèi)膜炎，引起菌血癥等[3]，食源性的SAU 可造成嘔吐、腹瀉等癥狀，而SAU 感染的治療通常是使用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，隨著抗生素的廣泛使用，逐漸出現(xiàn)了對(duì)抗生素耐藥的現(xiàn)象，甲氧西林等被開(kāi)發(fā)使用，而耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）就應(yīng)運(yùn)而生了[4]。細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥現(xiàn)象的日益凸顯，迫切需要尋找抗生素替代治療的藥物。

大蒜具有悠久的藥用歷史，具有廣泛的抗菌活性，直到1944 年才被確定大蒜中主要的抗菌活性成分為大蒜素[5]，同時(shí)還含有多種活性成分，包括乙烯基二硫磷脂（vinyldithiins）、阿霍烯（ajoenes）和diallyl polysulfides[6]。大蒜中的大蒜素不論是單獨(dú)使用還是聯(lián)合用藥均對(duì)細(xì)菌具有抑制效果[7]。為了進(jìn)一步了解其抑菌機(jī)制，我們使用拉曼光譜從單細(xì)胞層面來(lái)描述大蒜提取物對(duì)SAU 的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

使用金黃色葡萄球菌（ATCC25923），菌株保存在-80℃，復(fù)蘇使用；新鮮大蒜購(gòu)買(mǎi)自市場(chǎng)。LB 培養(yǎng)基以及LB 瓊脂培養(yǎng)基，活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒（MX4234-40T）。

所用儀器包括恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒THZ100），旋渦混勻器（上海滬析Vortex-1），超純水機(jī)（YYTIII-20L），超低溫冰箱（海爾DW-86L578J），培養(yǎng)箱（ZXDPA2160），醫(yī)用冷藏冰凍冰箱（海爾HYCD-282），生物安全柜（海爾HR40-IIA2），冰凍離心機(jī)（5840R），超聲波清洗機(jī)（舒美KQ-50TDE），拉曼光譜儀（Horiba LabRAM HR Evolution）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 從新鮮大蒜中獲得大蒜提取液

挑選外表完好、無(wú)發(fā)芽的大蒜碾碎后分裝8g 至50ml 的離心管中，隨后在40℃的水浴鍋30 分鐘孵育，隨后加入1ml 蒸餾水繼續(xù)孵育60 分鐘，最后高速離心取上清，并重復(fù)5 次，通過(guò)0.22um 的過(guò)濾器，獲得大蒜提取液。

1.2.2 測(cè)定SAU 在大蒜提取液的MIC 值

獲得的大蒜提取物的濃度記錄為100%，將細(xì)菌復(fù)蘇后，傳代三次，隨后使用試管法二倍稀釋大蒜提取物測(cè)定金黃色葡萄球菌在大蒜提取液中的MIC 值。

1.2.3 大蒜提取物對(duì)SAU 生物膜的清除作用

傳代三次后，將菌液稀釋?zhuān){(diào)整OD600=0.5，準(zhǔn)備96 孔板，每塊板實(shí)驗(yàn)分為三組，每組5 孔，一組為空白對(duì)照，僅加100ulLB 培養(yǎng)基，其余兩組均為100ul 的菌液。隨后37℃過(guò)夜培養(yǎng)，隨后棄掉上清，空白對(duì)照組加入LB 培養(yǎng)基，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入大蒜提取物濃度為0%以及 25%的LB 培養(yǎng)基，其余4 塊96 孔板重復(fù)上述操作，分別標(biāo)記為1h，3h，5h，9h，16h，隨后放入37℃培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)，使用結(jié)晶紫按照上述時(shí)間點(diǎn)對(duì)生物膜進(jìn)行濃度測(cè)試。

1.2.4 使用拉曼光譜表征大蒜提取液作用下的SAU的損傷程度

將傳代3 次的SAU 分別接種至不含有大蒜提取物以及濃度為25%的培養(yǎng)基中，并在不同時(shí)間點(diǎn)取100ul的菌液，然后從每個(gè)濃度和時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)測(cè)定30 個(gè)細(xì)胞的拉曼光譜，扣除背景并去基線以及平滑。

2 結(jié)果

2.1 大蒜提取物

使用蒸餾水作為溶劑，從新鮮大蒜中所獲得大蒜提取物為淡黃色澄清液體，具有大蒜的特殊氣味。

2.2 金黃色葡萄球菌在大蒜提取物中的MIC 值

使用二倍稀釋法測(cè)定其MIC 值，實(shí)驗(yàn)表明大蒜提取物對(duì)SAU 具有明顯的抑制作用，且存在濃度依賴(lài)性，濃度越高抑制作用越強(qiáng)，在大蒜提取物濃度為100%時(shí)，溶液澄清透亮，未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，其OD600 值處于低水平狀態(tài)，而提取物濃度為零時(shí)，試管溶液出現(xiàn)渾濁，當(dāng)大蒜提取物濃度在溶液中的濃度低于0.4%以后，出現(xiàn)了細(xì)菌的生長(zhǎng)，可以確定其MIC 值為0.4%。

2.3 大蒜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的清除作用

大蒜提取物能夠?qū)AU 所形成的生物膜起到明顯的清除作用，在沒(méi)有大蒜提取物作用的實(shí)驗(yàn)組中，從1h～16h 其OD570 保持在較高水平，生物膜濃度高，而在含有25%的大蒜提取物的實(shí)驗(yàn)組中，其吸光度值隨作用時(shí)間增加而下降，生物膜濃度呈現(xiàn)逐漸下降的現(xiàn)象，在3h～5h 間出現(xiàn)明顯下降，大蒜提取物對(duì)生物膜的清除作用隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，到了16h，其吸光度值降到了比較低的水平。（見(jiàn)圖1）

圖1 使用25%大蒜提取物作用于金黃色葡萄球菌的生物膜，持續(xù)作用16h，在3h 至5h 間出現(xiàn)生物膜濃度驟降的現(xiàn)象

2.4 拉曼光譜表征金黃色葡萄球菌的損傷

SAU 在含有不同濃度大蒜提取物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，使用單細(xì)胞拉曼光譜動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)大蒜提取物SAU 的作用效果，其單細(xì)胞拉曼光譜存在顯著差異，對(duì)比未添加大蒜提取物的實(shí)驗(yàn)組，在25%大蒜提取物作用以后，單細(xì)胞拉曼光譜中，其724cm-1、782cm-1和1573 cm-1出現(xiàn)明顯變化。

3 討論

SAU 為常見(jiàn)的食源性致病菌，可引起食物中毒事件，對(duì)機(jī)體健康帶來(lái)危害，其耐藥性是非常普遍的，尋找可替代的藥物是非常必要的。大蒜是常見(jiàn)的一種食材，可作為蔬菜或者調(diào)味劑，屬于百合科地下鱗莖的植物，來(lái)源非常廣泛，而且成本低廉，具有很好的藥用價(jià)值，是潛在的抗生素替代選擇或聯(lián)合用藥的參考。本研究首先使用蒸餾水提取大蒜提取物，能夠獲得淡黃色、液態(tài)、具有特殊氣味的大蒜提取物，隨后使其作用于SAU 以探索其抑菌效果，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，提取物對(duì)SUA 具有較明顯抑制作用，其MIC 值為0.4%。SAU 在生長(zhǎng)過(guò)程中容易形成生物膜，該膜是SAU 在96孔板中黏著、生長(zhǎng)所形成的具有獨(dú)特三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外的生物膜基質(zhì)，包含有多糖，蛋白質(zhì)以及DNA等物質(zhì)，通過(guò)感知外界環(huán)境調(diào)控基因的表達(dá)，從而改變生物膜的合成更好地適應(yīng)環(huán)境，當(dāng)使用抗生素進(jìn)行殺菌時(shí)，生物膜能夠阻礙抗生素與細(xì)菌的接觸，起到屏障作用，這也是導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗菌藥物耐藥的主要原因之一，于是出現(xiàn)反復(fù)感染以及感染難以清除等臨床常見(jiàn)的問(wèn)題。本次研究所獲得的大蒜提取物能夠有效清除生物膜，將大蒜提取物與其他抗菌藥物使用聯(lián)合使用，或許能夠取得更好的療效。

此外，從單細(xì)胞拉曼光譜的結(jié)果來(lái)看，在大蒜提取物的作用下，代表核酸的拉曼光譜波段724cm-1、780cm-1、1573cm-1的強(qiáng)度減弱[8]，可能的原因是大蒜提取物對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁發(fā)生作用，其致使通透性發(fā)生改變，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，通透性逐漸增大，細(xì)胞內(nèi)容物的流失也就更多了。

4 結(jié)語(yǔ)

SAU 作為院內(nèi)感染的主要病原菌，以及耐藥性的問(wèn)題日益嚴(yán)峻，是臨床上亟需解決的問(wèn)題。

第一，本研究使用蒸餾水作為溶劑提取到的大蒜提取物不同于甲醇或乙醇等化學(xué)試劑所獲得的，存在化學(xué)污染的可能性，該方法獲得的大蒜提取液具有安全無(wú)毒，無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)，且大蒜容易獲得，更有利于其藥用價(jià)值的推廣。

第二，本 實(shí)驗(yàn)明確了在該提取條件下，僅需0.4%的濃度即可達(dá)到MIC 值，在低濃度仍具有較好的抑制效果。

第三，本研究明確了大蒜提取物對(duì)SAU 生物膜的清除效果，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其清除效果是非常顯著的。

第四，本實(shí)驗(yàn)使用單細(xì)胞拉曼光譜動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)描述大蒜提取物對(duì)SAU 的殺傷效果，在大蒜提取物質(zhì)的作用下，代表核酸的拉曼峰強(qiáng)度下降，包括724cm-1、780cm-1以及1573cm-1。該實(shí)驗(yàn)方法不僅能夠無(wú)損傷無(wú)標(biāo)記在原位上來(lái)反映細(xì)菌的生化信息，更具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn)，能省去冗長(zhǎng)繁瑣的培養(yǎng)步驟，為研究工作提供便利。使用大蒜提取物能夠?qū)AU 產(chǎn)生抑制作用，為臨床上細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性提供新的參考，有助于尋找抗生素的替代療法，以及對(duì)于減少耐藥菌的產(chǎn)生均具有重要意義。