王小春 陳慧玲 李小麗 張德奎 （蘭州大學第二醫(yī)院院級重點實驗室，蘭州 730030）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）包括克羅恩?。–rohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC），其特征為腸黏膜的慢性和間歇性炎癥。反復(fù)發(fā)作的炎癥和黏膜愈合導(dǎo)致細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積，逐步引起結(jié)構(gòu)性纖維化。據(jù)報道，約30%～50%的CD 患者形成狹窄，約80%的狹窄患者最終需要手術(shù)治療［1-2］。關(guān)于UC 發(fā)生纖維化的報道很少，在一項1 156 例UC患者的回顧性研究中，通過放射性檢查手段或者內(nèi)鏡檢查或者手術(shù)的方式發(fā)現(xiàn)，UC出現(xiàn)纖維化狹窄的發(fā)生率是5.1%［3］。然而，在YAMAGATA 等［4］的研究中采用嚴格的診斷標準：如結(jié)腸管腔直徑＜50%，內(nèi)鏡通過困難，僅有1.5%的UC 患者診斷為纖維性狹窄。預(yù)防或逆轉(zhuǎn)IBD 中的ECM 沉積是一項重大難題。盡管纖維化是由復(fù)發(fā)性炎癥引起和發(fā)展的，但是抑制炎癥并不能阻止這種疾病的發(fā)展，也不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的纖維化。炎癥誘導(dǎo)的免疫學異?？赡苁抢w維化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。目前人們對腸纖維化的病理生理過程的理解明顯落后于其他器官疾病纖維化的進展，如慢性腎臟疾病、肝臟疾病和心臟疾病。這一領(lǐng)域的研究一直受到腸纖維化檢測和分級難以實現(xiàn)的困惑，進展緩慢，大大阻礙了早期纖維化的研究。隨著多種新的和/或改良的腸纖維化動物模型的出現(xiàn)，現(xiàn)在可以通過各種機制研究不同階段腸纖維化的發(fā)生［5］。本文將從以下6 種腸纖維化動物模型進行綜述：化學劑誘導(dǎo)的模型、微生物誘導(dǎo)的模型、免疫介導(dǎo)的模型、基因修飾模型、自發(fā)性結(jié)腸炎模型、小腸異位移植模型，為研究腸纖維化發(fā)病機制和臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 化學劑誘導(dǎo)的模型

化學劑誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥模型是最常用的方法之一，因為其相對容易操作，炎癥的發(fā)生、持續(xù)時間和嚴重程度是即時、可控的，且在很大程度上可以復(fù)制。右旋糖酐硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）和三硝基苯磺酸（trinitrobenzen sulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型是公認的黏膜炎癥動物模型，在IBD 發(fā)病機制的研究中已經(jīng)使用了20 余年［6-8］。這些模型在評估先天性免疫系統(tǒng)的作用方面特別有用，尤其是在研究上皮細胞損傷后的炎癥反應(yīng)方面很重要，包括急性炎癥和慢性炎癥。雖然這些經(jīng)典的模型不會引起明顯的腸纖維化，但重復(fù)誘導(dǎo)慢性炎癥造模的方案可以成功誘導(dǎo)纖維化的形成。

1.1 DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸纖維化模型 1990 年，OKAYASU 等［9］讓小鼠口服DSS，該動物模型已作為分析IBD的免疫應(yīng)答和開發(fā)新的治療方法的標準動物模型。通過改變DSS 的濃度和給藥頻率，可以建立急性、慢性和腸纖維化模型［10］。急性結(jié)腸炎通過給小鼠DSS 灌胃6～10 d（平均7 d）誘發(fā)。慢性結(jié)腸炎是給予不同濃度的DSS 1 周，然后給予無菌水7～14 d，重復(fù)4～5個周期引起的［9，11-13］。反復(fù)的炎癥刺激驅(qū)動轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-beta，TGF-β）等纖維化因子，這些纖維化因子刺激腸壁上ECM 蛋白表達紊亂，并進一步引起腸腔狹窄，最終形成纖維化，用PCR 法檢測后發(fā)現(xiàn)，DSS 造模組TGF-β1、CollagenⅠ、α-SMA 表達明顯上升［14-16］。該模型適合研究急性損傷后黏膜結(jié)構(gòu)的恢復(fù)過程，與人類IBD中的UC在組織病理學、發(fā)病機制和對傳統(tǒng)藥物治療的反應(yīng)方面有一定的相似性。該模型技術(shù)簡單、重復(fù)性好、成本相對較低，主要用于研究先天免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥［17］。該模型的缺點是腸纖維化程度輕，且回腸末端無纖維化。

1.2 TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸纖維化模型 KOON 等［18］將含有TNBS 溶液的30%乙醇注入麻醉后的小鼠結(jié)腸，總量50 μl，導(dǎo)管進入結(jié)腸深度約4～8 cm，然后將小鼠頭朝下保持幾分鐘，避免液體流出，并確保藥物的均勻分布，每周灌腸1次，連續(xù)5周。采用Masson染色后觀察發(fā)現(xiàn)，TNBS 造模組黏膜和黏膜下層的膠原沉積增加，波形蛋白陽性細胞數(shù)量增加。伏桂香等［19］用TNBS 造模后發(fā)現(xiàn)，模型組COLIα2、COL Ⅲ、TGF-β1 水平與對照組相比明顯升高。譚琰等［20］用TNBS/乙醇與免疫復(fù)合物聯(lián)合誘導(dǎo)結(jié)腸炎動物模型的建立后發(fā)現(xiàn)，TNBS/乙醇與免疫復(fù)合物聯(lián)合誘導(dǎo)組外周血中的IgG 含量及外周血和腸道固有層中的CD4+T 細胞數(shù)量顯著高于TNBS/乙醇誘導(dǎo)組，說明在細胞免疫水平及體液免疫水平聯(lián)合誘導(dǎo)組較目前的TNBS/乙醇誘導(dǎo)組模型可能更為理想。DILLMAN等［21］用TNBS 造模后采用超聲彈性成像衍生的腸壁剪切波速度鑒別腸壁的急性炎癥與腸壁纖維化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種無創(chuàng)檢查手段診斷腸纖維化的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值均為100%，這將為臨床上早期發(fā)現(xiàn)腸纖維化提供新的思路。ZHU 等［22］在TNBS 模型中采用光譜光聲影像學檢查方法檢測腸道炎癥與纖維化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在單個分子的波長處獲得的光聲信號量和衍生的功能信息顯示炎癥和纖維化狹窄之間存在顯著差異，這與組織學炎癥和纖維化是一致的。盡管TNBS 模型在誘導(dǎo)腸纖維化方面被廣泛應(yīng)用，但該模型需要反復(fù)灌腸才能誘導(dǎo)腸纖維化，腸纖維化程度與TNBS 的來源及劑量有關(guān)，而且不同的動物種類出現(xiàn)的炎癥強度也會不同。

2 微生物誘導(dǎo)的結(jié)腸纖維化模型

由于全基因組關(guān)聯(lián)研究的結(jié)果反復(fù)強調(diào)先天免疫、黏膜屏障完整性和對細菌敏感的基因，因此，微生物在IBD發(fā)病機制中的作用已成為人們關(guān)注的一個關(guān)鍵領(lǐng)域［23］。本綜述中討論的幾乎所有動物模型以及人類CD 中，腸道炎癥在無菌條件下或在抗生素治療后都有所改善或消失，突出了宿主-微生物相互作用在炎癥和纖維化發(fā)病機制中的中心作用［24］。因此，許多IBD 動物模型利用特定的微生物或微生物成分產(chǎn)生炎癥和纖維化。

2.1 肽聚糖多糖注射液 SARTOR 等［25］于1985 年用Lewis 大鼠建立PG-PS 模型。PG-PS 模型建立方法也適用于小鼠。先麻醉小鼠，用無菌技術(shù)剖腹暴露腸道，將PG-PS 注入小鼠腸壁的7 個部位［2 個遠端派爾氏斑、回腸遠端腸系膜（2 次注射）、盲腸尖部、盲腸壁（2 次注射）］。最初的損傷表現(xiàn)為強烈的跨壁炎癥和急性炎癥細胞的大量浸潤。數(shù)周后，急性炎癥反應(yīng)演變?yōu)槁匀庋磕[性炎癥，呈斑片狀發(fā)展，與CD 中的慢性炎癥相似，并出現(xiàn)腸壁變厚，腹腔黏連，肉芽腫性炎癥區(qū)域表達膠原-α1（COL1A1）、TGF-β1和IL-6的mRNA 水平提高，肉芽腫周圍可見明顯的纖維化和豐富的間充質(zhì)細胞，這些間充質(zhì)細胞的形態(tài)和免疫染色模式與腸纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)細胞肌成纖維細胞一致［26-27］。PG-PS模型表明，非活性細菌成分滲入腸壁足以引發(fā)炎癥和腸纖維化，而這可以由正常存在于健康腸腔中的細菌成分實現(xiàn)。PG-PS模型可以研究小腸和結(jié)腸的急性和慢性炎癥的不同階段。但是這項技術(shù)耗時且難度高，需要開腹手術(shù)。重要的是，盡管一些研究小組報告了部分進展，但不可能輕易地在小鼠身上復(fù)制該方案，從而大大限制了其在基因修飾小鼠中的應(yīng)用［28］。

2.2 慢性沙門氏菌感染 小鼠經(jīng)口感染鼠傷寒沙門氏菌后，主要定植于脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，在胃腸道中定植數(shù)量少［29］。然而，鏈霉素預(yù)處理后通過降低正常微生物群的宿主保護作用，提高了沙門氏菌在腸道的定植效率［30］。在感染前1 d，將0.5 g鏈霉素溶于2.5 ml水中制備抗生素，給小鼠灌胃100 μl。感染當天用稀釋后的沙門氏菌培養(yǎng)物給每只小鼠灌胃100 μl。結(jié)果表明，用鏈霉素預(yù)處理后口服鼠傷寒沙門菌可導(dǎo)致腸道炎癥和纖維化，尤其是盲腸。對盲腸進行皮羅西亞斯紅染色后發(fā)現(xiàn)，感染后21 d 腸纖維化達到峰值，第42 天纖維化明顯減輕，膠原在腸黏膜下層沉積最為明顯，而黏膜層的纖維化程度較輕［31］。該模型簡單、高效、易于復(fù)制，也可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小鼠，但其與人類疾病的相關(guān)性有限，因為包括沙門氏菌在內(nèi)的人類細菌感染不會導(dǎo)致腸纖維化，此外，回腸末端在這個模型中不形成纖維化，和臨床情況不符，這可能是該模型的局限性之一。

2.3 糞便混懸液 將過濾的糞便懸浮液注射到左半結(jié)腸的腸壁中，檢測黏膜和血清中TGF-β1 水平均顯著升高，并有明顯的膠原沉積，使用抗TGF-β1抗體可顯著消除膠原沉積［32］。雖然糞便注射可以導(dǎo)致局灶性和侵襲性結(jié)腸炎，并伴有嚴重的跨壁纖維化、膠原水平升高和結(jié)腸狹窄，但由于該模型技術(shù)難度高而受到限制。

2.4 黏附性侵襲性大腸桿菌感染 在CD 中，黏附性侵襲性大腸桿菌（adherent invasive escherichia coli，AIEC）是一種常見的黏膜相關(guān)性細菌，能夠黏附并侵入腸黏膜上皮細胞，誘導(dǎo)炎癥前狀態(tài)，表明其可能參與了具有免疫學基礎(chǔ)的慢性疾病過程。慢性AIEC 小鼠模型是近年來出現(xiàn)的一種新的腸道炎癥和纖維化模型。小鼠在感染NRG857c（CD 患者的AIEC分離物）前24 h口服鏈霉素20 mg，然后分別給予兩組小鼠灌胃AIEC 的兩種菌株NRG857c 和LF82，監(jiān)測糞便中的細菌數(shù)量。Masson 染色和PSR染色觀察發(fā)現(xiàn)，感染AIEC 的小鼠在第7天便能發(fā)現(xiàn)盲腸組織有廣泛的ECM 沉積，在隨后的時間點，所有小鼠均存在明顯纖維化，感染后第63 天，小鼠整個盲腸壁均存在纖維化，表明慢性AIEC 感染能導(dǎo)致進行性的跨壁盲腸纖維化［33］。該模型與CD 有顯著的相似性，與鼠傷寒沙門氏菌模型不同，該模型使用了一種與人類致病因素相關(guān)的細菌。在該實驗中，雖然從一些小鼠中觀察到回腸炎，但明顯比結(jié)腸炎癥程度輕，且不會導(dǎo)致纖維化。

3 免疫介導(dǎo)的模型

適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在IBD發(fā)病機制中的作用已被證實，越來越多的證據(jù)表明其在腸纖維化中的重要性，尤其是Th2 和Th17 免疫應(yīng)答［34-35］。T 細胞過繼轉(zhuǎn)移模型用于研究結(jié)腸炎的特異性適應(yīng)性T細胞依賴性免疫應(yīng)答。

3.1 T 細胞適應(yīng)性轉(zhuǎn)移模型 該模型的基本原理是將特定的CD4+T細胞亞群轉(zhuǎn)移到同種異體（裸體）動物體內(nèi)，誘發(fā)自身免疫性疾病。具體地說，將CD4+CD45RB 高T 細胞注射到SCID 小鼠體內(nèi)導(dǎo)致 一種消耗性疾病和結(jié)腸炎，與接受CD4+CD45RB 低 T 細胞或普通CD4+T 細胞的小鼠相比，其特征是出現(xiàn)顯著的上皮和隱窩增生［36-37］。相反，將CD4+CD25+TR細胞移植到有結(jié)腸炎癥狀的免疫缺陷小鼠體內(nèi)，可在移植2周后逆轉(zhuǎn)疾?。?8］。這種模型的病理特征與人類IBD非常相似，如病變主要局限于結(jié)腸，呈彌漫性分布、隱窩延伸、黏蛋白耗竭。盡管與IBD有這些相似之處，但在這個模型中很難觀察到潰瘍伴纖維化、隱窩膿腫、隱窩丟失和肉芽腫性炎癥，而且該模型是人工的，費時費力，腸纖維化與炎癥的嚴重程度或持續(xù)時間的相關(guān)性尚不清楚［39］。

4 基因修飾模型

通過修飾選定的炎癥相關(guān)基因?qū)е履c纖維化是一種直接的方法，可以確定哪些特定的免疫異常會導(dǎo)致腸纖維化。

4.1 TGF-β1過表達 VALLANCE等［40］將含有TNBS的50%乙醇100 μl 給麻醉后的小鼠灌腸，待小鼠蘇醒24 h 后再次麻醉，將100 μl 含腺病毒Ad TGF-β1的PBS 進行灌腸。第14～28 天，Ad TGF-β1 基因轉(zhuǎn)染的小鼠出現(xiàn)腸梗阻，近端腸擴張，處死小鼠后對擴張結(jié)腸的縱向解剖顯示遠端結(jié)腸壁增厚，質(zhì)硬，Masson 染色顯示這些組織中存在明顯的纖維化。但是結(jié)腸纖維化并不均勻，而是節(jié)段性的。該模型模仿了CD 誘導(dǎo)腸纖維化的許多特征，包括腸梗阻的發(fā)展，可以幫助闡明導(dǎo)致腸纖維化的機制，也驗證了腸道基因轉(zhuǎn)移在模擬胃腸道病理事件中的作用，證實了平滑肌細胞和肌成纖維細胞可能是導(dǎo)致該模型腸纖維化的因素，但該模型最大的缺點是纖維化不均勻，只局限于藥物注射的部位。

4.2 巨噬細胞趨化蛋白過度表達 巨噬細胞趨化蛋白（MCP-1）被認為是器官纖維化的關(guān)鍵因子，如肺、腎臟、肝臟和胰腺［41-46］。MOTOMURA 等［47］用小鼠MCP-1 的cDNA 插入含有人巨細胞病毒即刻早期啟動子和SV40 多聚腺苷酸信號的Ad5 的E1 區(qū)上，建立表達小鼠MCP-1（AdMCP-1）的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，然后將AdMCP-1 或相同濃度的AdLacZ 或AdDL70 給小鼠灌腸。在不同時間點處死小鼠，收集腸組織進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與AdDL70 相比，AdMCP-1處理的小鼠直腸變硬變厚，從第3～21天結(jié)腸黏膜下層及固有肌層中膠原沉積增加，到第42天MCP-1表達顯著升高［47］。該模型為MCP-1在IBD 的病理生理學和狹窄形成的發(fā)病機制中的作用提供了一些依據(jù)，但該模型的缺點是纖維化局限于藥物注射部位，且需要轉(zhuǎn)染產(chǎn)生生物活性MCP-1 的腺病毒載體。

4.3 IL-10 缺乏 IL-10 是一種Th2 細胞因子，作為淋巴和髓系細胞的重要調(diào)節(jié)因子，具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，IL-10-/-小鼠會發(fā)生小腸結(jié)腸炎［48-49］。當在常規(guī)條件下飼養(yǎng)時，IL-10-/-小鼠會出現(xiàn)不連續(xù)的腸道跨壁炎癥，病變累及上消化道和下消化道，伴有腸上皮增生、黏蛋白耗竭、隱窩膿腫、潰瘍和腸壁增厚，其病變的分布和嚴重程度取決于宿主腸道的刺激程度［49-51］。但在特定的無病原體條件下飼養(yǎng)的小鼠會出現(xiàn)輕到中度的炎癥，幾乎完全局限于結(jié)腸，系統(tǒng)并發(fā)癥較少且出現(xiàn)較遲［49］。IL-10-/-小鼠的小腸結(jié)腸炎是由CD4+T 細胞介導(dǎo)的，當CD4+T 細胞轉(zhuǎn)移到缺乏成熟T 和B 細胞的RAG2-/-小鼠體內(nèi)時，會誘發(fā)結(jié)腸炎［52］。該模型的優(yōu)點是IL-10 具有公認的免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性的細胞因子，其缺乏導(dǎo)致的炎癥機制也很明確。缺點是該模型需要基因修飾的動物，炎癥的外觀和嚴重程度以及由此導(dǎo)致的纖維化是可變的，這些都取決于小鼠生活的條件。

4.4 腫瘤壞死因子樣細胞因子1A（TL1A）過表達 SHIH 等［53］首次報道TL1A 過表達會導(dǎo)致TL1A Tg小鼠小腸和結(jié)腸膠原沉積增加。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，髓系、淋巴系或兩個譜系組中特異性TL1A 過度表達也可誘導(dǎo)Tg小鼠結(jié)腸中膠原沉積和明顯的纖維化，COL2A1 和TGF-β mRNA 水平升高［54］。對淋巴或髓系特異性TL1A Tg 小鼠進行DSS 誘導(dǎo)或T 細胞轉(zhuǎn)移性結(jié)腸炎會加劇腸道炎癥以及小腸和大腸纖維狹窄，有趣的是，這與IL-13 水平升高無關(guān)，而與IL-17有關(guān)［55］。在這個模型中，用中和性TL1A 抗體治療后，纖維化可以逆轉(zhuǎn)，且與結(jié)締組織生長因子、 IL-31Ra、TGF-β1 和胰島素樣生長因子-1 降低有關(guān)，同時也減少了成纖維細胞和肌成纖維細胞的數(shù)量［56］。TL1A-Tg 纖維化模型的主要優(yōu)點是與人類IBD，尤其與CD 有顯著的相關(guān)性，它可以導(dǎo)致小腸與大腸的跨壁腸道纖維化。TL1A 持續(xù)表達能激活免疫表型，增加腸道歸巢分子的表達及Th1 細胞的反應(yīng)，TL1A動物模型對于研究各種免疫失調(diào)性疾病如IBD的發(fā)病機制及炎癥的纖維化反應(yīng)是非常有幫助的［53］。

5 自發(fā)性結(jié)腸炎

自發(fā)的腸纖維化模型是罕見的，SAMP1/YitFc（SAMP）小鼠是一種發(fā)展為慢性回腸炎并伴有回腸纖維化的模型。SAMP1/Yit 亞群通過選擇性繁殖出現(xiàn)皮膚病變和末端回腸炎，當疾病進展到晚期時，SAMP 小鼠的回腸固有肌層肥大、廣泛的膠原沉積，最終形成腸腔狹窄［57］。該模型無需刺激或額外操作，腸道組織學與CD 類似，但是該模型的缺點是小鼠繁殖率低，腸道存在的菌落數(shù)量少，完成實驗所需時間長，很難在市場上買到SAMP小鼠。

6 小腸異位移植模型

小鼠異位移植是一種新的腸纖維化模型，是對大鼠腸纖維化異位移植模型的一種改進。將供體大鼠安樂死后打開腹部，暴露小腸，切除盲腸近端 3 cm 小腸，將切除的小腸采用5 ml 0.9%NaCl 溶液沖洗腸腔，麻醉受體小鼠，在頸部兩側(cè)通過兩個平行于身體軸的小切口制備兩個皮下袋，將切除的小腸植入每個皮下袋，封閉皮膚。第2 天、第7 天、 第14 天及第21 天處死小鼠后實時采用PCR、EVG染色及天狼星紅染色法檢測移植腸中膠原的生成和沉積，發(fā)現(xiàn)移植后同種異體移植物的膠原層厚度隨著時間的推移而不斷增加［58］。小鼠異位移植這種方法高度可行，因為移植組織在所有動物中都是可識別的，該模型可能有助于在分子水平上解釋腸纖維化的形成。但是該方法有其自身的局限性，因為這是一種人為的情況。如腸道同種移植物和同種異體移植物的免疫應(yīng)答很可能是菌株特異性的，微生物組的差異可能會影響腸纖維化的發(fā)展。由于纖維化發(fā)展的速度和缺血效應(yīng)，目前還無法將該模型應(yīng)用于人類IBD的研究。

7 總結(jié)

迄今為止，腸纖維化仍然被認為是慢性腸組織損傷的必然結(jié)果。由于腸道取樣相對不易，且腸狹窄的臨床表現(xiàn)通常較晚，在廣泛的纖維化和管腔狹窄之前通常無法發(fā)現(xiàn)，因此對IBD 患者的促纖維化機制的研究具有挑戰(zhàn)性。腸纖維化動物模型的建立，不僅為研究纖維化的發(fā)病機制提供了可能，而且也為研究臨床前治療打開了大門。這篇綜述希望能為研究腸道纖維化的研究者提供一些選擇過程的指導(dǎo)。充分利用現(xiàn)有的模型和創(chuàng)建額外的實驗工具，將有助于發(fā)展基于病理生理學的腸纖維化的治療方法。