韓 雪， 王 蕾， 孫 旭， 寧家輝， 衣紅杰， 趙 婧

(1.山東中醫(yī)藥大學， 山東 濟南 250014 2.山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院神經內科， 山東 濟南 250001)

阿爾茨海默病(AD)早在臨床癥狀出現(xiàn)前就已發(fā)生神經病理改變，最終發(fā)展為嚴重的癡呆。間充質干細胞(MSCs)移植治療技術是近年來新興的細胞修復治療技術。臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)具有多向分化潛能，移植后可改善AD導致的認知功能障礙?？煽康捏w外誘導方式可以促進MSCs靶向神經元分化，提高生物利用率。本文著重對UC-MSCs的特性和優(yōu)勢、治療AD可能的機制、體外誘導靶向分化的方式展開綜述，旨在為UC-MSCs治療AD的實驗和臨床研究提供理論依據(jù)，為治療AD尋找新思路。

1 AD的治療現(xiàn)狀

當下明確批準治療AD的藥物主要有乙酰膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，但僅可暫時改善癥狀，對疾病病程沒有影響。目前藥物開發(fā)更多地瞄準疾病修飾療法，能夠延緩AD臨床病程甚至逆轉認知衰老。近年來靶向菌-腸-腦軸和抗淀粉樣單克隆抗體成為研究熱點，但長期的療效和安全性存在巨大爭議[1]。研究[2]顯示中藥也可抑制β-淀粉樣蛋白(Aβ)異常沉積和Tau蛋白過度磷酸化，包括單味中藥和復方制劑，但具體機制和毒副作用未闡明。除藥物治療外，非藥物治療輕中度AD也獲得極大關注。研究[3]證明運動鍛煉對腦功能具有直接的益處，有氧運動可以增加腦血流量，提高氧利用率，改善突觸可塑性和促進神經發(fā)生，協(xié)同認知訓練效果更佳，可以涉及記憶、計算、語言等多個領域。感覺刺激包括音樂療法、芳香療法、光療法等，能緩解AD患者的焦慮抑郁情緒，調節(jié)睡眠節(jié)律，改善認知和行為[4]。此外，針灸、經顱磁刺激等也可改善認知障礙，提高AD患者的日常生活能力。但這些方法治療效果仍需要大規(guī)模數(shù)據(jù)的支持。總之，目前尚無明確治療AD的有效方法。近年來大量關注點集中在MSCs移植治療AD上[5]。

2 UC-MSCs的特性和優(yōu)勢

MSCs作為可持續(xù)自我更新、增殖分化的干細胞，廣泛存在于多種組織，用于神經再生技術的MSCs來源以骨髓、脂肪和臍帶研究較多。骨髓間充質干細胞(BMSCs)收集需經骨髓穿刺獲取，且一次獲得細胞數(shù)量有限，具有分化能力強、免疫原性低、倫理問題少等特點。Nakano等[6]通過APP/PS1小鼠腦室內注射BMSCs將外泌體miR-146a轉移到星形膠質細胞中，可減輕神經炎癥并促進突觸發(fā)生，改善了學習記憶障礙，但對Aβ聚集和神經元凋亡沒有影響。脂肪間充質干細胞(ADSCs)在局麻下吸脂獲得，比BMSCs來源更廣泛。UC-MSCs來自分娩后廢棄的臍帶，獲取途徑方便，對于供體幾乎沒有創(chuàng)傷，倫理問題更少。黃平等[7]研究表明UC-MSCs較ADSCs對外周血單核細胞的抑制作用更強，同時缺少抗原主要組織相容性復合體Ⅱ和共刺激表面抗原CD40、CD80和CD86，所以在免疫排斥方面優(yōu)于ADSCs；在誘導分化方面，Drela等[8]研究表明與BMSCs相比，UC-MSCs維持在更早的胚胎期，旁分泌作用更強，誘導后表現(xiàn)出更高的神經譜系分化傾向；以上兩項實驗還表明相同培養(yǎng)條件下UC-MSCs體外增殖率高于BMSCs和ADSCs。相比之下UC-MSCs優(yōu)勢更明顯，可能是神經修復治療更合適的MSCs來源。

3 UC-MSCs治療AD可能的機制

3.1提供神經營養(yǎng)因子，促進神經結構的重建:腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)和神經生長因子(NGF)是最常見的神經營養(yǎng)因子，可以促進神經發(fā)生和突觸形成。BDNF對AD導致的膽堿能神經元丟失及膠質細胞異常激活具有潛在保護作用，增加表達可以減緩AD的病情進展和認知功能下降。劉莎等[9]通過立體定位法將UC-MSCs移植到AD大鼠海馬CA1區(qū)，BDNF和NGF表達均增加，改善局部微環(huán)境，促進神經結構重建。神經營養(yǎng)因子還可以誘導UC-MSCs分化為神經元并促進其成熟。李云逸等[10]研究表明體外過表達NGF和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的UC-MSCs組較單純培養(yǎng)基組產生了更多的神經樣細胞團塊，人重肽神經絲蛋白、神經元特異性烯醇化酶(NSE)表達增加，誘導UC-MSCs向神經細胞分化。UC-MSCs移植可提供神經營養(yǎng)因子，增加神經遞質表達，營造適合神經元遷移和神經再生的微環(huán)境，促進神經元增殖分化。

3.2誘導神經元分化，增強突觸可塑性:研究[11]發(fā)現(xiàn)Aβ沉積和Tau過度磷酸化引起細胞膜孔隙形成，大量Ca2+內流，破壞細胞鈣平衡，氧自由基增加，導致突觸丟失、細胞骨架破壞，神經元死亡，參與AD發(fā)生。而UC-MSCs可以分化為神經元樣細胞，促進突觸的重構和神經再生。突觸素是突觸功能成熟和神經遞質釋放的重要蛋白，高度參與突觸功能和神經可塑性。Doshmanziari等[12]移植UC-MSCs后明顯上調突觸素和生長相關蛋白-43的表達，大鼠海馬區(qū)基于新生的軸突神經纖維，可建立更加完善的神經信號傳導通路。因此，UC-MSCs能通過表達更高水平的神經元相關基因，分化為特定神經元，修復神經鞘和細胞骨架，恢復突觸之間的聯(lián)系，激活內源性神經發(fā)生，重建大腦損傷的神經功能回路。

3.3減輕神經炎癥，誘導膠質細胞清除功能:神經炎癥是AD的發(fā)病機制之一。小膠質細胞可以表達經典激活“促炎”(M1)表型和交替激活“抗炎”(M2)表型。Aβ異常沉積可以觸發(fā)先天免疫反應，結合小膠質細胞上的模式識別受體，M1表型表達增加，M2表型的免疫調節(jié)和修復作用受到抑制，釋放炎癥介質，導致AD進展。Xu等[13]研究顯示UC-MSCs通過調節(jié)小膠質細胞自噬相關蛋白和增強Aβ降解酶表達，保護小膠質細胞和神經元免受Aβ的神經毒性侵害，促進Aβ被吞噬，防止細胞凋亡。綜上，UC-MSCs移植通過交替激活小膠質細胞來調節(jié)炎性細胞因子的分泌，抑制神經炎癥，分泌Aβ蛋白水解酶，進一步恢復組織穩(wěn)態(tài)，改善AD患者的大腦微環(huán)境。

4 體外誘導MSCs分化方式

MSCs的神經元分化潛能是治療AD最有希望的修復機制。但MSCs移植后多分布在肺臟、肝臟等，細胞存活率低，且受自身多種分化潛能的影響，能特異性分化為神經細胞的MSCs也非常有限。因此如何提高MSCs的生物利用率，促進向神經元靶向分化、提高新生神經細胞的成熟率及存活率成為研究熱點。

4.1化學誘導劑:最早的誘導方案就是使用化學混合物，如β-巰基乙醇、二甲基亞砜等。劉雨思等[14]取P3代UC-MSCs加入β-巰基乙醇和胎牛血清進行預誘導，加入二甲基亞砜和丁羥基茴香醚正式誘導后發(fā)現(xiàn)膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、NSE及微管相關蛋白表達陽性，GFAP是星形膠質細胞標志物，表明UC-MSCs可以分化為膠質細胞和神經元。使用化學劑誘導速度快，分化明顯，但是會對細胞產生毒性作用，同時有些學者認為該方法導致的細胞形態(tài)改變可能是應激反應，不是真正向神經元分化，可能不適合體內移植[15]。

4.2神經營養(yǎng)因子:目前最常用的誘導方案是采用具有神經功能的細胞因子與MSCs結合。神經營養(yǎng)因子是一種小分子蛋白，對細胞損傷小，安全性相對較高，經常被添加到培養(yǎng)液中以促進神經干細胞分化，如bFGF、BDNF、NGF、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、表皮生長因子(EGF)等。bFGF和EGF是使用頻率最高的神經誘導因子。bFGF是廣譜的神經營養(yǎng)因子和促有絲分裂因子，除了促進干細胞增殖外，還可決定其分化方向，與EGF協(xié)同可以促進神經元存活和分化。MSCs表達TrkA和TrkB受體，BDNF與細胞膜上受體結合，激活一系列細胞生物學反應，促進MSCs向成熟神經元分化。但神經因子分子量小，半衰期短，易代謝，直接注入體內難以滿足治療需求。因此，需建立一種有效、持續(xù)釋放細胞因子的方法提高分化效率。目前基因轉染技術可以幫助解決這一問題，體外轉染神經因子質粒進入MSCs，不斷分泌細胞因子以實現(xiàn)自我誘導。IGF-1是一種促生長肽，參與中樞和外周組織的分化和增殖，在生長、發(fā)育和衰老中發(fā)揮作用。綜上，將干細胞與相關神經因子相結合的方法似乎更有前途。

4.3中藥分子:目前可以誘導MSCs神經分化的中藥分子有銀杏葉提取物、黃連素、黃芪甲苷等。閆冬冬等[16]在UC-MSCs培養(yǎng)基中加入不同濃度黃連素誘導液，80%以上細胞特異性表達巢蛋白、NSE、GFAP，證實了黃連素的神經誘導作用，且發(fā)現(xiàn)100μg/mL濃度組誘導效果最明顯，UC-MSCs存活時間最長。詹吉恒等[17]研究顯示虎杖苷聯(lián)合生長因子(bFGF+EGF+BDNF)組較單純生長因子組誘導MSCs神經分化作用更強，提示中藥聯(lián)合生長因子共同誘導效果會更顯著。

4.4生物活性納米材料:目前常用的生物活性納米材料有石墨烯、金納米、硒等。納米顆粒是一種可以穿越血腦屏障的微觀顆粒，副作用少，近年來納米技術已成為一種提高治療效率的生物醫(yī)學方法。殼聚糖是一種天然聚合物，具有促進神經再生的潛力。在體外用納米顆粒將細胞外基質制造成3D支架結構，可促進細胞附著和存活、神經元分化和軸突生長，能夠更好地模擬體內的微環(huán)境，保持細胞活力，優(yōu)點是低細胞毒性、良好的生物相容性等特點。

5 小 結

綜上所述，UC-MSCs的特性和優(yōu)勢使其具有治療潛力，在促神經再生、提高神經營養(yǎng)因子和減輕神經炎癥等方面發(fā)揮神經保護作用，體外誘導神經分化可以提高細胞生物利用率，在治療AD方面取得了一些進展。

迄今為止，盡管UC-MSCs的基礎研究取得了可喜成果，但臨床應用仍處于初級階段，UC-MSCs發(fā)揮神經保護作用的相關機制尚不十分明確。由于標準的實驗室模型無法準確模擬人類體內微環(huán)境，所以UC-MSCs移植存在一定的局限性和不確定性，在提高生物安全性避免移植后排斥反應、實現(xiàn)UC-MSCs靶向神經元分化并遷移到損傷部位、提高細胞在體內存活和再生等方面還需進一步研究，在移植途徑、移植數(shù)量、移植頻率、治療周期等方面缺乏高效安全的移植流程，不能確定體外誘導神經分化的可靠方式。在未來的研究中，基因修飾和生物工程方法可能為解決這些問題提供機會，使UC-MSCs成為臨床治療AD的有效選擇之一。