謝建華，郭小妹，袁蘭蘭，余 強(qiáng)，陳 奕，申明月*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

甾醇類(lèi)化合物是一類(lèi)來(lái)自于植物或真菌的天然活性物質(zhì)，其主要膳食來(lái)源是植物油、谷物、堅(jiān)果、豆類(lèi)和食用菌等。這些甾醇類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)與膽固醇相似，但僅在植物或真菌中合成。甾醇類(lèi)化合物具有許多重要的生物活性，例如降膽固醇、抗炎、抗腫瘤、抗菌等[1-2]，其中降膽固醇作用尤為明顯，被稱(chēng)為“膽固醇的克星”，國(guó)內(nèi)外關(guān)于甾醇類(lèi)化合物降膽固醇的研究也越來(lái)越多。研究表明甾醇類(lèi)化合物可以顯著降低血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、血清甘油三酯（triglycerides，TG）、肝脂水平和致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（即高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）/低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C））[3-5]，促進(jìn)膽固醇排出，增加小鼠糞便膽固醇含量[6]。

近年來(lái)，由于不良的飲食習(xí)慣和生活方式，人群血脂水平明顯增加。血脂異常是以人體內(nèi)脂蛋白代謝異常為特征，主要包括TC、LDL-C、TG水平的升高和/或HDL-C水平的降低等。血脂異常是心血管疾病的主要誘因和危險(xiǎn)因素。人體內(nèi)的血漿膽固醇穩(wěn)態(tài)主要受肝臟內(nèi)源性合成、腸道對(duì)膳食膽固醇的吸收以及膽汁的清除和排泄控制。在過(guò)去的幾十年里，科學(xué)家們已達(dá)成共識(shí)，營(yíng)養(yǎng)和飲食管理是預(yù)防血脂異常，從而最大限度降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵策略[7]。增加富含甾醇類(lèi)食物的攝入有助于改善血脂水平，降低膽固醇，預(yù)防心血管疾病。

目前，關(guān)于甾醇類(lèi)化合物降膽固醇活性的研究主要集中于植物甾醇如β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等，對(duì)于來(lái)源于食用菌類(lèi)的甾醇研究很少，且大多都停留在表象指標(biāo)研究階段，其作用機(jī)理仍不明確。本研究以麥角甾醇、麥角甾醇酯、(22E)-麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮（(22E)-ergosta-4,6,8(14),22-tetrean-3-one，(22E)-Ergosta）、星魚(yú)甾醇為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建高膽固醇HepG2細(xì)胞模型，探究其對(duì)膽固醇水平的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝腫瘤細(xì)胞系HepG2來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

麥角甾醇（批號(hào)：E0018，純度＞95%） 梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；麥角甾醇酯（純度97%，批號(hào)：12-CF-135-3）、(22E)-Ergosta（純度98%，批號(hào)：4-EKP-158-1）、星魚(yú)甾醇（純度94%，批號(hào)：7-VHP-132-1） 加拿大Toronto Research Chemicals公司；DMEM培養(yǎng)基、油紅O染色液（細(xì)胞專(zhuān)用） 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清 以色列Biological Industries公司；膽固醇、25-羥基膽固醇、辛伐他汀上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CCK8試劑盒日本同仁化學(xué)研究所；細(xì)胞裂解液、細(xì)胞總蛋白提取試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔單克隆尼曼-匹克C1型類(lèi)似蛋白1（Niemann-Pick type C1-like 1，NPC1L1）抗體、兔單克隆ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G5（ATP-binding cassette transporter G5，ABCG5）抗體、兔單克隆固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（sterolregulatory element binding protein 2，SREBP2）抗體、小鼠β-actin抗體 美國(guó)Abcam公司；兔單克隆ABCG8抗體、兔單克隆膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶2（acetyl-coenzyme A acetyltransferase，ACAT2）抗體、兔單克隆羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A synthase，HMGCS1）抗體 美國(guó)Cell Signaling Technology公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠、山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TG、總蛋白定量檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀、HERACELL 150i二氧化碳細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Scientific公司；Research plus單道固定量程移液器 德國(guó)艾本德公司；CKX53倒置顯微鏡 日本Olympus公司；GelDoc XR Biorad凝膠成像系統(tǒng)、Mini-PROTEAN Tetra電泳儀、1704150全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；1260超高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每2～3 d按照1∶3比例傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，按2×105個(gè)/孔接種于6 孔板。實(shí)驗(yàn)分為4 組：空白對(duì)照組：加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基；模型組：加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基配制的膽固醇（10 μg/mL）和25-羥膽固醇（1 μg/mL）混合溶液[8-9]；陽(yáng)性對(duì)照組：加入2 mL以無(wú)血清培養(yǎng)基配制的膽固醇（10 μg/mL）、25-羥膽固醇（1 μg/mL）和辛伐他?。?0 μmol/L）混合溶液；甾醇類(lèi)化合物處理組：加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基配制的膽固醇（10 μg/mL）、25-羥膽固醇（1 μg/mL）及不同濃度甾醇類(lèi)化合物（25、50、100 μmol/L）的混合溶液。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞存活率測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞（1×104個(gè)/孔）接種于96 孔板。細(xì)胞貼壁后，無(wú)血清培養(yǎng)基同化處理12 h，然后分別加入200 μL濃度為25、50、100 μmol/L的各甾醇溶液處理24 h，按照CCK8試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定光密度值（OD450nm）。以不加甾醇溶液為空白對(duì)照組，以不接種細(xì)胞、不加甾醇溶液為空白，根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率。根據(jù)細(xì)胞存活率結(jié)果確定甾醇作用濃度。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)TG相對(duì)含量測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，按照分組處理各組細(xì)胞。吸去細(xì)胞上清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次，加入100 μL細(xì)胞裂解液，輕晃使裂解液充分作用，將細(xì)胞收集于離心管中，2 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG含量。模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和甾醇類(lèi)化合物處理組TG相對(duì)含量均以其相對(duì)空白對(duì)照組的含量表示，單位為%。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)TC相對(duì)含量測(cè)定

細(xì)胞按照分組處理完成后，4 ℃、1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞。加入100 μL細(xì)胞裂解液，振蕩渦旋30 s，靜置5 min，反復(fù)處理6 次，離心后收集上清液，采用總蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清蛋白質(zhì)量濃度。取細(xì)胞上清于EP管中，加入等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)15% KOH-乙醇溶液，渦旋5 min，40 ℃水浴超聲皂化1 h，加入數(shù)滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%三氯乙酸溶液去除蛋白，渦旋5 min，加入等體積正己烷-異丙醇（3∶2，V/V）充分混勻，室溫12 500 r/min離心15 min，收集上層有機(jī)相，剩余溶液反復(fù)抽提4 次。合并有機(jī)相，氮吹至近干，加入1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，室溫12 500 r/min離心15 min，取上清液，濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣，進(jìn)行超高效液相色譜分析。

檢測(cè)條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-異丙醇（67∶33，V/V），檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm、柱溫20 ℃、進(jìn)樣量20 μL、流速1 mL/min，等度洗脫。模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和甾醇類(lèi)化合物處理組的TC相對(duì)含量均以其相對(duì)空白對(duì)照組的含量表示，單位為%。

1.3.5 油紅O和Filipin III染色并觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔接種于6 孔板，按前述分組處理48 h。根據(jù)油紅O染色液（細(xì)胞專(zhuān)用）試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞染色，顯微鏡獲取圖像。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種在13 mm蓋玻片上，用膽固醇合成抑制劑辛伐他汀處理24 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，PBS沖洗后，細(xì)胞用50 μg/mL的Filipin III避光染色45 min，PBS漂洗，并用顯微鏡觀察拍照。

1.3.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)HepG2細(xì)胞膽固醇調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)

細(xì)胞按照上述分組分別處理后，用預(yù)冷的PBS洗3 遍，收集各組細(xì)胞，每管加入150 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解5 min。隨后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，部分用于蛋白定量，剩余上清液加入Loading Buffer變性后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。蛋白樣品?jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入相應(yīng)抗體，4 ℃過(guò)夜，用TBST洗膜3 次，每次15 min，然后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。用TBST洗膜3 次后在聚偏二氟乙烯膜上均勻加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，使用凝膠成像儀顯影。以β-actin條帶灰度作為參照，計(jì)算靶蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用Origin 2021軟件進(jìn)行圖形繪制，使用SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甾醇類(lèi)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

為確定甾醇類(lèi)化合物是否對(duì)細(xì)胞活力和增殖有影響，使用CCK8試劑盒檢測(cè)不同濃度甾醇類(lèi)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用。如圖1A所示，不同濃度各甾醇類(lèi)化合物處理組與空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率均無(wú)顯著差異，說(shuō)明甾醇化合物的加入對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響，所選擇的濃度可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 甾醇類(lèi)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率（A）、細(xì)胞內(nèi)TC（B）和TG（C）水平的影響（n＝3）Fig.1 Effect of sterol compounds on the viability (A) and intracellular TC (B) and TG (C) levels of HepG2 cells (n = 3)

2.2 甾醇類(lèi)化合物對(duì)細(xì)胞TC水平的影響

如圖1B所示，膽固醇和25-羥膽固醇處理細(xì)胞后，模型組細(xì)胞內(nèi)TC水平相較于空白對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），與模型組相比，甾醇類(lèi)化合物處理組TC水平發(fā)生不同程度的下降。濃度為25 μmol/L時(shí)，麥角甾醇組TC水平最低，其次為(22E)-Ergosta和麥角甾醇酯組，星魚(yú)甾醇組TC水平最高；濃度為50 μmol/L時(shí)，麥角甾醇、麥角甾醇酯和(22E)-Ergosta組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），TC水平均顯著低于星魚(yú)甾醇組；濃度為100 μmol/L時(shí)，麥角甾醇酯和(22E)-Ergosta組TC水平較低，其次為麥角甾醇組，星魚(yú)甾醇組TC水平最高。

2.3 甾醇類(lèi)化合物對(duì)細(xì)胞TG水平的影響

TG是重要的脂質(zhì)組分，如圖1C所示，與模型組相比，4 種甾醇均顯著降低了高TC細(xì)胞內(nèi)TG水平（P＜0.05）。高濃度（100 μmol/L）時(shí)麥角甾醇酯降TG效果最佳，與陽(yáng)性對(duì)照組辛伐他汀相當(dāng)，其余3 組間無(wú)顯著差異；低濃度（25 μmol/L）時(shí)麥角甾醇的降TG效果最好；濃度為50 μmol/L時(shí)，麥角甾醇、麥角甾醇酯和(22E)-Ergosta組間TG水平?jīng)]有顯著差異，降TG效果均優(yōu)于星魚(yú)甾醇（P＜0.05）。

2.4 甾醇類(lèi)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響

油紅O可以特異性使細(xì)胞脂質(zhì)染紅，通過(guò)顏色分布和程度可以觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分布情況。圖2顯示，膽固醇和25-羥膽固醇處理細(xì)胞后顏色較正常組更紅，說(shuō)明脂質(zhì)含量明顯增加，陽(yáng)性藥物和甾醇類(lèi)化合物處理后的細(xì)胞紅色分布減少，說(shuō)明它們不同程度減少了HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積，并且甾醇類(lèi)化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的減少作用呈濃度依賴(lài)性，其中(22E)-Ergosta作用最為明顯。結(jié)果表明甾醇類(lèi)化合物可以降低膽固醇和25-羥膽固醇誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚。

圖2 甾醇類(lèi)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響（×200）Fig.2 Effect of sterol compounds on lipid accumulation in HepG2 cells (× 200)

2.5 甾醇類(lèi)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞膽固醇代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

上述結(jié)果表明甾醇類(lèi)化合物可以降低膽固醇和25-羥膽固醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)TC、TG水平并抑制脂質(zhì)積聚。為進(jìn)一步探究甾醇類(lèi)化合物降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇的作用機(jī)制，分析膽固醇代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化。如圖3、4所示，相較于模型組，4 種甾醇類(lèi)化合物均抑制了NPC1L1的表達(dá)，且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。其中高濃度麥角甾醇酯下調(diào)NPC1L1表達(dá)的效果與陽(yáng)性對(duì)照辛伐他汀相近。與模型組相比，甾醇類(lèi)化合物不同程度上調(diào)了ABCG5/8的表達(dá)，其中麥角甾醇的上調(diào)作用最為顯著，這與陽(yáng)性對(duì)照辛伐他汀的作用效果相反。隨著作用濃度的上升，麥角甾醇酯、(22E)-Ergosta及星魚(yú)甾醇上調(diào)ABCG8蛋白表達(dá)的能力增強(qiáng)。HMGCS1和SREBP2是調(diào)控膽固醇合成的關(guān)鍵蛋白[10-11]，ACAT2可將膽固醇酯化，隨后組裝成乳糜微粒進(jìn)入淋巴循環(huán)[12]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4 種甾醇類(lèi)化合物均可有效下調(diào)HMGCS1、SREBP2和ACAT2蛋白的表達(dá)。

圖3 甾醇類(lèi)化合物作用下HepG2細(xì)胞膽固醇代謝相關(guān)蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.3 Western blot analysis of cholesterol metabolism-related protein expression in HepG2 cells treated with sterols

圖4 甾醇類(lèi)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞膽固醇代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n＝3）Fig.4 Effects of sterols on the expression of cholesterol metabolismrelated proteins in HepG2 cells (n = 3)

以上結(jié)果提示4 種甾醇類(lèi)化合物可能通過(guò)降低NPC1L1、HMGCS1、SREBP2和ACAT2的表達(dá)，從而減少膽固醇的吸收、合成和酯化，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)TC水平。同時(shí)，甾醇類(lèi)化合物上調(diào)了膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG5/8的表達(dá)，說(shuō)明甾醇類(lèi)化合物促進(jìn)了膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。

3 討 論

甾醇的主要食物來(lái)源為植物油、面包、谷物和蔬菜等，隨著物質(zhì)的豐富，不健康的飲食習(xí)慣使人們?nèi)菀讛z入過(guò)多的膽固醇，從而導(dǎo)致心血管疾病。現(xiàn)有研究證實(shí)甾醇具有顯著的降低膽固醇作用，補(bǔ)充甾醇類(lèi)化合物可以改善血脂代謝情況，但是多數(shù)研究?jī)H通過(guò)測(cè)定血清脂質(zhì)、血清TC水平等指標(biāo)[7,10,13-15]說(shuō)明甾醇降膽固醇的作用，對(duì)于其降膽固醇的內(nèi)在機(jī)制并未深入探索。本研究通過(guò)建立高膽固醇HepG2細(xì)胞模型，以辛伐他汀作為陽(yáng)性對(duì)照，考察4 種甾醇類(lèi)化合物（麥角甾醇、麥角甾醇酯、(22E)-Ergosta、星魚(yú)甾醇）對(duì)HepG2細(xì)胞TC、TG水平的影響，并通過(guò)其對(duì)膽固醇代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響探究甾醇類(lèi)化合物可能的降膽固醇機(jī)制。

TC、TG水平是反映機(jī)體脂質(zhì)代謝水平的主要生化指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)甾醇類(lèi)化合物可以有效降低TC、TG、LDL-C含量[16-18]，在本實(shí)驗(yàn)中，4 種甾醇類(lèi)化合物降低了高固醇導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)TC及TG水平的升高，油紅O染色結(jié)果顯示甾醇類(lèi)化合物改善了高膽固醇細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積。為進(jìn)一步研究4 種甾醇類(lèi)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平調(diào)節(jié)作用的機(jī)制，使用Western blot測(cè)定膽固醇合成代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)。人體內(nèi)血漿膽固醇的穩(wěn)態(tài)主要受到肝臟內(nèi)源性合成、腸道對(duì)膳食膽固醇的吸收以及膽汁的清除和排泄控制。NPC1L1是膳食和膽汁膽固醇腸道吸收的關(guān)鍵蛋白[19]。NPC1L1在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)，并定位于富含小GTPase Rab5蛋白的亞細(xì)胞泡狀室。Davies等[20]建立NPC1L1敲除的小鼠模型，與野生型小鼠的肝細(xì)胞相比，敲除NPC1L1的小鼠肝細(xì)胞表現(xiàn)出異常的質(zhì)膜吸收和脂質(zhì)（包括膽固醇和鞘脂）轉(zhuǎn)運(yùn)。NPC1L1缺失可以完全抵消飲食誘導(dǎo)的小鼠高膽固醇血癥，其血漿脂蛋白和肝膽固醇譜與使用膽固醇吸收抑制劑依麥哲布治療的野生型小鼠相似[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4 種甾醇類(lèi)化合物相較模型組顯著下調(diào)了NPC1L1蛋白的表達(dá)（P＜0.05），表明甾醇類(lèi)化合物可能通過(guò)減少膽固醇的吸收降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。ACAT2在膽固醇酯化、腸道膽固醇吸收和載脂蛋白釋放中具有重要作用，研究表明植物甾醇可以下調(diào)ACAT2表達(dá)，從而有效抑制膽固醇吸收，降低脂肪水平[22-23]。在本研究中，模型組ACAT2表達(dá)量較空白對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），膽固醇可以激活A(yù)CAT2的表達(dá)，促進(jìn)膽固醇酯化，4 種甾醇類(lèi)化合物可以下調(diào)ACAT2表達(dá)，從而減少膽固醇的酯化，影響膽固醇的吸收。

ABCG5和ABCG8位于腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的頂膜上，ABCG5和ABCG8形成專(zhuān)性異源二聚體，限制腸道吸收膽固醇，促進(jìn)膽固醇排泄到膽汁[24-25]。小鼠中過(guò)表達(dá)ABCG5和ABCG8可減少肝臟膽固醇循環(huán)從而延緩飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4 種甾醇類(lèi)化合物可以有效上調(diào)ABCG5/8蛋白的表達(dá)，且對(duì)ABCG8的上調(diào)較ABCG5顯著，說(shuō)明4 種甾醇類(lèi)化合物可能通過(guò)促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇向膽汁分泌，從而降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平。

HMGCS包括HMGCS1和HMGCS2，是促進(jìn)膽固醇合成的重要酶[26]，Yao Weilong等[27]研究表明抑制HMGCS1蛋白表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平顯著下降。SREBPs能夠調(diào)控脊椎動(dòng)物細(xì)胞中的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，其激活后調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[28]，SREBP途徑的發(fā)現(xiàn)使控制膽固醇合成和攝取分子機(jī)制的研究取得重大進(jìn)展[29-31]。本實(shí)驗(yàn)中4 種甾醇類(lèi)化合物顯著降低了HMGCS1及SREBP2蛋白的表達(dá)，說(shuō)明4 種甾醇類(lèi)化合物可能通過(guò)減少膽固醇的合成，從而降低膽固醇的水平。

4 結(jié) 論

通過(guò)添加膽固醇和25-羥基膽固醇構(gòu)建高膽固醇HepG2細(xì)胞模型，在培養(yǎng)體系中添加不同濃度的4 種甾醇類(lèi)化合物，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，測(cè)定細(xì)胞中的TC、TG水平，發(fā)現(xiàn)4 種甾醇類(lèi)化合物可以抑制膽固醇和25-羥基膽固醇引起的HepG2細(xì)胞內(nèi)TC、TG水平升高，改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累情況。為進(jìn)一步探究甾醇類(lèi)化合物在高膽固醇HepG2細(xì)胞模型中的作用機(jī)制，對(duì)涉及膽固醇合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，4 種甾醇類(lèi)化合物可以降低NPC1L1、HMGCS1、SREBP2和ACAT2的表達(dá)，上調(diào)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG5和ABCG8表達(dá)。