宓 偉，尹淑英，高麗霞，李 寧，石塔拉

（1.濱州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 濱州 256603）

肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcioma，HCC）起源于肝臟的上皮或間葉組織，具有易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移和播散、惡性程度高的特點(diǎn)，傳統(tǒng)的化療和放療未見生存獲益[1-3]。我國(guó)每年約11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%[4]。HCC是受環(huán)境因素和飲食因素雙重影響的發(fā)病過程復(fù)雜的惡性腫瘤，目前確切的分子發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。隨著分子生物學(xué)的深入研究和發(fā)展，在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中，發(fā)現(xiàn)有多條分子信號(hào)通路，如磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phosphattidylinositol 3-kinase/serine threonine protein kinase/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR）、沉默調(diào)節(jié)蛋白6/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（recombinant sirtuin 6/nuclear factor kappa-B，SIRT6/NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體等信號(hào)通路，其參與肝癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移[5-14]。

山楂原花青素（hawthorn procyanidins，HPC）是一類由表兒茶素和兒茶素縮合而成的一種比來源于葡萄籽高聚體原花青素生物活性高的低聚體多酚化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗微生物等生理活性[15-18]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，Traf6）是一種銜接蛋白家族成員，可以介導(dǎo)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體、白細(xì)胞介素1（interleukin 1，IL-1）受體、NF-κB等信號(hào)通路[19-24]。NF-κB介導(dǎo)黏附分子、趨化因子和細(xì)胞因子等介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。在靜息狀態(tài)下，NF-κB抑制蛋白（inhibitory subunit of NF-κB，IκB）與NF-κB p65結(jié)合在細(xì)胞漿中調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生理功能，當(dāng)癌癥刺激時(shí)，IκB激酶復(fù)合體磷酸化IκB被蛋白酶降解，NF-κB p65轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核與特定的DNA序列結(jié)合，抑制細(xì)胞凋亡基因Bax、Caspase-3的表達(dá)，加速癌細(xì)胞增殖[25-28]。但HPC能否下調(diào)Traf6/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚鮮見報(bào)道。本研究旨在探討HPC靶向作用于Traf6/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的效果，為肝細(xì)胞肝癌的分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新的途徑，亦為開發(fā)食品中的抗腫瘤成分提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肝癌細(xì)胞株（Huh-7）購(gòu)于上?？道煽茖W(xué)生物有限公司。

HPC（純度≥99%）（批號(hào)：20200418） 杭州綠盛生物技術(shù)有限公司；杜氏高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM） 美國(guó)Life Technology公司；胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 美國(guó)Gbico公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）試劑盒 武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)研究所；Super ECL Plus發(fā)光液 北京普利萊基因科技有限公司；Cas9-Puro慢病毒 廣州源井生物科技有限公司；嘌呤霉素 上海賽默飛世爾科技有限公司；β-actin多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體 武漢恒生科技生物公司；Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3一抗、二抗羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G英國(guó)Abcam公司；總RNA提取試劑盒、SYBR green試劑盒日本Takara Bio公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒美國(guó)Caltag公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2恒溫培養(yǎng)箱 德國(guó)Heraeus公司；熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 澳大利亞Corbett公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)、DYY-12型凝膠電泳儀 北京六一儀器廠；FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)Becton Dickinson公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Alpha Innotech公司。

1.3 方法

1.3.1 Huh-7細(xì)胞傳代培養(yǎng)

Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、鏈霉素和青霉素各100 U/mL的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后棄去培養(yǎng)上清液，用10%磷酸鹽緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞1～2 次，加2 mL 1 mol/L EDTA溶液于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化1～2 min，待細(xì)胞密度達(dá)80%進(jìn)行傳代。

1.3.2 CCK-8檢測(cè)HPC處理后Huh-7細(xì)胞增殖情況

取一定量的HPC以甲醇為溶劑配制質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、40、80 μg/mL的系列溶液[29]，用DMEM培養(yǎng)基將Huh-7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109個(gè)/L，以每孔100 μL接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到50%～60%時(shí)后，加入不同質(zhì)量濃度的HPC，設(shè)10 個(gè)平行孔，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后振蕩1 min，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度A。細(xì)胞存活率按下式[30]計(jì)算。

1.3.3 Huh-7細(xì)胞Traf6的轉(zhuǎn)染

在慢病毒介導(dǎo)下將Traf6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，然后在培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素，對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Huh-7細(xì)胞株進(jìn)行篩選，獲得過表達(dá)Traf6的Huh-7細(xì)胞，并檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Huh-7細(xì)胞中Traf6的表達(dá)情況。

1.3.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Huh-7細(xì)胞中Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3mRNA表達(dá)水平

當(dāng)Huh-7細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以0.5×106個(gè)/孔接種于6 孔板中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到50%～60%后，棄去舊培養(yǎng)基，HPC細(xì)胞組和HPC+Traf6過表達(dá)組加入2 mL 40 μg/mL HPC處理細(xì)胞，空白對(duì)照組和Traf6過表達(dá)組用等體積DMSO處理，在37 ℃、飽和濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按試劑盒說明提取Huh-7細(xì)胞總RNA，采用SYBR green試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，按試劑盒說明操作，并選擇GAPDH作為內(nèi)參，通過熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 List of primer sequences used this study

1.3.5 免疫印跡法檢測(cè)Huh-7細(xì)胞中Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)分組同1.3.4節(jié)。收集HPC處理后的Huh-7細(xì)胞和Traf6過表達(dá)的Huh-7細(xì)胞，用BCA法檢測(cè)RIPA裂解液提取的蛋白質(zhì)量濃度。在提取蛋白液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6% SDS緩沖液，沸水變性5 min，SDS-PAGE后濕移至聚偏二氟乙烯膜上，37 ℃封閉2 h，依次加入羊抗兔Traf6、NF-κB p65、Bax、Caspase-3抗體和β-actin多克隆抗體，4 ℃過夜，滴加ECL發(fā)光試劑進(jìn)行檢測(cè)，采用Quanlity One軟件掃描各條帶，獲取目的蛋白灰度[31]。

1.3.6 Annexin V-FITC/PI 檢測(cè)Huh-7細(xì)胞凋亡情況

實(shí)驗(yàn)分組同1.3.4節(jié)。制備Huh-7細(xì)胞懸液，濃度為1×106個(gè)/L，每孔100 μL接種于6 孔板，培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后在HPC細(xì)胞組和HPC+Traf6過表達(dá)組中加入質(zhì)量濃度為40 μg/mL HPC 2 mL，空白對(duì)照組和Traf6過表達(dá)組加入等體積DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞樣品檢測(cè)，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書利用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 HPC對(duì)Huh-7細(xì)胞增殖的抑制作用

如圖1所示，當(dāng)HPC質(zhì)量濃度小于10 μg/mL時(shí)對(duì)Huh-7細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用，0、5、10 μg/mL HPC處理組相對(duì)存活率分別為100%、98%、96%。而當(dāng)HPC質(zhì)量濃度大于20 μg/mL時(shí)對(duì)Huh-7細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，20、40、80 μg/mL HPC處理組相對(duì)存活率分別為84%、75%、62%，且隨HPC質(zhì)量濃度升高Huh-7細(xì)胞的相對(duì)存活率顯著降低（P＜0.05）。

圖1 HPC對(duì)Huh-7細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝6）Fig.1 Effect of HPC on the proliferation of Huh-7 cells (x± s, n = 6)

2.2 Traf6過表達(dá)影響HPC對(duì)Huh-7細(xì)胞增殖的抑制作用

如圖2所示，實(shí)驗(yàn)中采用質(zhì)量濃度為40 μg/mL的HPC處理細(xì)胞，結(jié)果顯示HPC組中Huh-7細(xì)胞的相對(duì)存活率為73%，顯著低于空白對(duì)照組相對(duì)存活率（100%）（P＜0.05）；HPC+Traf6過表達(dá)細(xì)胞組中Huh-7細(xì)胞的相對(duì)存活率為82%，顯著高于HPC細(xì)胞組相對(duì)存活率（73%）（P＜0.05）。

圖2 Traf6過表達(dá)對(duì)HPC抑制Huh-7細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝6）Fig.2 Effect of Traf6 overexpression on inhibitory effect of HPC on the proliferation of Huh-7 cells (x ± s, n = 6)

2.3 HPC對(duì)Huh-7細(xì)胞中Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示，HPC處理的Huh-7細(xì)胞中Traf6和NF-κB p65mRNA表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），Bax和Caspase-3的mRNA表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。HPC+Traf6過表達(dá)細(xì)胞組中Traf6和NF-κB p65mRNA表達(dá)水平顯著低于Traf6過表達(dá)細(xì)胞組（P＜0.05），Bax和Caspase-3的mRNA表達(dá)水平顯著高于Traf6過表達(dá)細(xì)胞組（P＜0.05）。

圖3 HPC對(duì)Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝6）Fig.3 Effect of HPC on the mRNA expression of Traf6, NF-κB p65,Bax and Caspase-3 (x± s, n = 6)

2.4 HPC對(duì)Huh-7細(xì)胞中Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，HPC組中Traf6和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。HPC+Traf6過表達(dá)細(xì)胞組中Traf6和NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平顯著低于Traf6過表達(dá)細(xì)胞組（P＜0.05），Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平顯著高于Traf6過表達(dá)細(xì)胞組（P＜0.05）。

圖4 HPC對(duì)Traf6、NF-κB p65、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）Fig.4 Effect of HPC on the protein expression of Traf6, NF-κB p65,Bax and Caspase-3 (x± s, n = 6)

2.5 HPC對(duì)Huh-7細(xì)胞凋亡的影響

如圖5所示，空白對(duì)照組、HPC組、Traf6過表達(dá)組和HPC+Traf6過表達(dá)組Huh-7細(xì)胞的凋亡率分別為29%、48.1%、15.5%和41.7%。HPC組的Huh-7細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），Traf6過表達(dá)組的Huh-7細(xì)胞凋亡率顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），HPC+Traf6過表達(dá)組的Huh-7細(xì)胞凋亡率顯著高于Traf6過表達(dá)組（P＜0.05）。

圖5 HPC對(duì)Huh-7細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝6）Fig.5 Effect of HPC on apoptosis of Huh-7 cells (x ± s, n = 6)

3 討 論

HPC是具有開發(fā)價(jià)值的食品和藥物成分[32]。很多流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)HPC具有廣譜抗腫瘤作用，HPC可通過多條信號(hào)通路作用于癌細(xì)胞的凋亡，并影響腫瘤血管的形成[33-36]。手術(shù)和化療是肝癌的常用臨床治療手段，但患者對(duì)其耐受性差[37-39]。因此，探索毒副作用小的天然植物藥對(duì)肝癌的治療和預(yù)后十分重要[40]。本研究從細(xì)胞水平和基因水平初步證實(shí)HPC具有靶向抗肝癌細(xì)胞增殖的作用，期望為研究食品成分作為開發(fā)藥物方面提供理論參考。

NF-κB信號(hào)通路可調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，癌癥發(fā)生時(shí)往往Traf6蛋白表達(dá)量會(huì)增加，肝癌細(xì)胞中過表達(dá)的Traf6蛋白可以上調(diào)NF-κB信號(hào)通路，使其細(xì)胞質(zhì)中的IκB磷酸化并被降解，釋放的NF-κB p65轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核與靶點(diǎn)結(jié)合，能使促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)量降低，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖并抑制癌細(xì)胞凋亡[41-42]。本實(shí)驗(yàn)探討了不同質(zhì)量濃度HPC對(duì)Huh-7細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示當(dāng)HPC質(zhì)量濃度大于20 μg/mL時(shí)對(duì)Huh-7細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且該作用存在劑量依賴性，與孫思明等[43]研究發(fā)現(xiàn)HPC抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖具有劑量依賴性結(jié)果一致。利用40 μg/mL的HPC處理Huh-7細(xì)胞，結(jié)果表明HPC可以通過下調(diào)Traf6的表達(dá)起到抑制肝癌細(xì)胞的作用。Roy等[44]的研究證明，葡萄籽原花青素通過p53、Bax和Caspase 3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果顯示，HPC處理的Huh-7細(xì)胞中Traf6和NF-κB p65mRNA表達(dá)水平下降，同時(shí)Traf6和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平亦下降，HPC可以通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)控p65的基因和蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。Jeelani等[45]研究表明Caspase-3蛋白與癌細(xì)胞凋亡有關(guān)，本研究結(jié)果表明HPC可通過下調(diào)Traf6/NF-κB信號(hào)通路、活化Caspase-3從而抑制Huh-7細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)Huh-7細(xì)胞凋亡。

綜上所述，HPC可以下調(diào)Traf6/NF-κB信號(hào)通路、抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，但本實(shí)驗(yàn)沒有研究HPC是否通過阻止Huh-7細(xì)胞周期來抑制其增殖并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，后續(xù)尚需進(jìn)一步研究。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度40 μg/mL HPC真正進(jìn)入機(jī)體后，是否會(huì)被機(jī)體免疫系統(tǒng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)弱化，能否在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用，也需進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果初步表明，NF-κB信號(hào)通路是HPC作用的潛在靶點(diǎn)，HPC通過下調(diào)Traf6/NF-κB信號(hào)通路，抑制Traf6和NF-κB p65的表達(dá)，促進(jìn)Bax和Caspase-3的表達(dá)，誘導(dǎo)Huh-7肝癌細(xì)胞凋亡，HPC為食物中的植物活性成分，可經(jīng)小腸黏膜細(xì)胞直接吸收進(jìn)入血液循環(huán)，且無毒副作用，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。