張 靜，馮 潮，王勝威，楊瑞麗，李 武,3,*

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.五邑大學(xué)生物科技與大健康學(xué)院，廣東 江門 529020）

多糖是由10 個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的大分子碳水化合物。作為構(gòu)成生命體的基本分子之一，多糖廣泛地參與細胞的增殖、分化和信號傳導(dǎo)等生理活動[1]。研究表明，多種天然多糖具有抗凝血[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、調(diào)節(jié)腸道菌群[5]等多種生物活性。

目前對于天然來源的多糖，通常采用水提醇沉的方法獲得粗多糖，采用Sevag法[6]、三氯乙酸[7]或大孔樹脂吸附[8]等方法去除粗多糖的蛋白和色素等雜質(zhì)，并進一步采用離子層析和分子篩純化獲得組分較為均一的多糖[9-10]。一些天然來源的多糖，可以通過分級醇沉的方法分離獲得純度較高的多糖。Wang Lei等[11]采用30%、50%和80%分級醇沉的方法，從刺梨中分離到不同分子質(zhì)量的多糖組分；Feng Lei等[12]采用分級醇沉的方法從決明子中分離到分子質(zhì)量為9.56×105Da和0.94×105Da的兩個均一多糖組分。

研究顯示，多糖的生物活性與其糖基的組成、連接方式等結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。Yang Xiaolong等[13]從生姜中分離出一種以(1,4)-α-D-葡萄糖（glucose，Glc）為主鏈的低分子質(zhì)量多糖，其具有促進巨噬細胞增殖，誘導(dǎo)NO、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6分泌的作用。Zhou Shiyang等[14]從山藥中分離出一種由(1,4)-α-D-Glcp組成的摩爾質(zhì)量為7.28×104g/mol的多糖，其具有清除羥自由基的活性。同時研究顯示，相同來源的植物中可能存在多種結(jié)構(gòu)的活性多糖。Yang Yu等[15]分離到一種以→6)-β-半乳糖（galactose，Gal）(1→為主鏈的枸杞多糖，其C3具有α-阿拉伯糖（arabinose，Ara）、β-Galp和α-鼠李糖（rhamnose，Rha）分支，這種枸杞多糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群、降低高脂誘導(dǎo)的小鼠脂肪堆積的作用。Wu Jiaxin等[16]分離出一種以1,3-β-Galp為主鏈的枸杞多糖，其C6具有(1,5)-α-Araf、(1,6)-β-Galp、(1,3)-α-Araf、(1,4)-α-Araf分支，這種多糖顯示出神經(jīng)保護的作用。從前期多糖的報道可以發(fā)現(xiàn)，不同或相同來源的植物多糖，其結(jié)構(gòu)和活性呈現(xiàn)多樣性的特點。但是，由于天然來源多糖的分子質(zhì)量較大、組成復(fù)雜，結(jié)構(gòu)分析較困難。目前，天然多糖的結(jié)構(gòu)解析仍然是限制多糖研究應(yīng)用的瓶頸。

龍眼是我國南方特色水果，干制龍眼（桂圓）為《中華人民共和國藥典》收錄的一味中藥，具有養(yǎng)血安神、補益心脾、益智健腦等功效[17-18]。藥理學(xué)研究表明，龍眼多糖具有免疫調(diào)節(jié)[19]、抗腫瘤[20]等生物活性。研究人員前期已從龍眼果肉中分離到幾種活性多糖。Gan Tingsheng等[9]從新鮮龍眼中分離出1 種由(1→6)-α-D-Glcp組成的多糖；并從干制龍眼中分離出1 種由(1→6)-α-D-Glcp、(1→3)-β-D-Glcp、(1→3)-β-DGalp及(1→3)-α-L-Rhap組成的多糖，上述兩種多糖均具有促進脾淋巴細胞增殖和巨噬細胞NO、IL-1β和IL-6分泌的作用。Bai Yajuan等[21]報道了1 種以(1→3,4)-α-Rhap、(1→4)-β-Galp、(1→6)-β-Galp和(1→3,6)-β-Galp為主鏈的龍眼多糖，其具有抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的提升巨噬細胞TNF-α、IL-6、NO和前列腺素E2分泌的作用。Rong Yu等[19]純化獲得了1 種以(1→4)-β-Glc和(1→6)-β-甘露糖（mannose，Man）為主鏈的具有免疫調(diào)節(jié)活性的龍眼多糖。綜合前期龍眼多糖的文獻可知，龍眼中存在多種結(jié)構(gòu)的活性多糖。對不同龍眼多糖的結(jié)構(gòu)與活性的研究可以為明確龍眼的主要活性物質(zhì)基礎(chǔ)與龍眼的精深加工提供依據(jù)。本實驗通過分級醇沉的方法從龍眼果肉中純化獲得1 種活性多糖組分（記為LP），并對其結(jié)構(gòu)進行表征，同時分析其激活巨噬細胞的作用，旨在為龍眼的高值化開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘儲良’龍眼2020年7月采摘自廣東省高州市龍眼種植基地，去皮去核，熱風(fēng)干燥至水分質(zhì)量分數(shù)為12%，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自中國科學(xué)院細胞庫。

D301R大孔交換樹脂 天津興南允能高分子技術(shù)有限公司；重蒸酚 北京索萊寶公司；3,5-二硝基水楊酸美國默克公司；無水乙醇、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、牛血清白蛋白 中國醫(yī)藥集團有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒上海碧云天生物技術(shù)公司；小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒 美國R&D公司。

1.2 儀器與設(shè)備

細胞計數(shù)器 美國BIO-RAD有限公司；CR22N高速冷凍離心機 日本日立公司；LGJ-10真空冷凍干燥機北京松源華興科技公司；Frontier傅里葉變換紅外光譜儀美國珀金埃爾默有限公司；1260高效液相色譜 美國安捷倫科技公司；BI-MwA多角度激光光散射儀 美國布魯克海文儀器公司；AV-600 MHz核磁共振儀 瑞士Bruker公司；紫外-可見分光光度計 美國PE公司；311型二氧化碳培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CytoFLEX LX型流式細胞儀 美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 龍眼多糖LP的提取

依照文獻[22]提取龍眼多糖LP：100 g龍眼干加入體積分數(shù)85%乙醇溶液浸泡48 h后，通風(fēng)陰干。浸泡后的龍眼果肉打漿，按照料液比為1∶20（g/mL）加入蒸餾水，80 ℃水浴攪拌提取2 h。提取液經(jīng)9 000 r/min離心15 min，收集上清液。取沉淀采用上述方法復(fù)提2 次，合并3 次提取液，55 ℃減壓蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10。按料液比0.61∶1（m/V）向濃縮后的多糖溶液中加入D301R大孔樹脂，48 ℃吸附2 h，除去色素和蛋白。使用紗布過濾除去大孔樹脂及殘渣。待提取液冷卻至室溫，加入無水乙醇至乙醇終體積分數(shù)為20%，然后4 ℃沉淀10 h，10 000 r/min離心15 min，收集上清液。在上清液中加入無水乙醇至乙醇終體積分數(shù)為33.3%，4 ℃沉淀10 h，10 000 r/min離心15 min，收集沉淀。隨后加入適量蒸餾水重懸沉淀，55 ℃減壓蒸發(fā)除去乙醇。濃縮液經(jīng)透析、凍干后得到龍眼多糖樣品LP，稱質(zhì)量并按下式計算龍眼多糖LP得率。

1.3.2 龍眼多糖LP中總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)量分數(shù)測定

采用苯酚-硫酸法[23]測定樣品中的總糖質(zhì)量分數(shù)。取1 mL 0.1 mg/mL龍眼多糖LP溶液于玻璃試管中加入質(zhì)量分數(shù)6%苯酚水溶液1 mL，混勻后加入5 mL質(zhì)量分數(shù)98%濃硫酸，靜置30 min，測定490 nm波長處吸光度，根據(jù)SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸法》計算總糖質(zhì)量分數(shù)。

采用咔唑-硫酸法[24]測定樣品中的糖醛酸質(zhì)量分數(shù)。取1 mL10 mg/mL龍眼多糖LP溶液于玻璃試管中加入0.25 mL咔唑-乙醇溶液，充分混勻后加入5 mL濃硫酸，85 ℃水浴10 min，測定525 nm波長處吸光度。

采用BCA蛋白濃度試劑盒測定樣品中的蛋白質(zhì)量分數(shù)。

1.3.3 龍眼多糖LP的紫外-可見光譜分析

取1 mg/mL龍眼多糖LP溶液，使用紫外-可見光分光度計分析，掃描范圍190～800 nm，記錄光譜圖。

1.3.4 龍眼多糖LP分子質(zhì)量的測定

取3 mg多糖樣品溶于1 mL、0.1 mol/L的硝酸鈉溶液中，55 ℃水浴超聲20 min，過0.45 μm微孔濾膜備用。凝膠滲透色譜激光光散射（gel permeation chromatography with laser light scattering，GPC-LLS）條件：流動相為0.1 mol/L的硝酸鈉溶液，色譜柱為Ultrahydrogel 1000柱（7.8 mm×300 mm，12 μm）串聯(lián)Ultrahydrogel 2000柱（7.8 mm×300 mm，12 μm），激光光散射及示差檢測器，柱溫50 ℃，流速0.6 mL/min，進樣量為100 μL。采用BIC ParSEC軟件分析數(shù)據(jù)并計算數(shù)均分子質(zhì)量（mn）、重均分子質(zhì)量（mw）、峰值分子質(zhì)量（mp）、Z均分子質(zhì)量（mz）以及分散系數(shù)（mw/mn）。

1.3.5 龍眼多糖LP中單糖組成分析

取10 mg龍眼多糖LP樣品于鉗口瓶中，加入5 mL 2 mol/L三氟乙酸，氮氣封瓶，100 ℃水解2 h；冷卻至室溫，取1 mL混合液加入1 mL無水甲醇，采用氮氣吹干后再加入1 mL甲醇復(fù)溶，氮氣吹干，重復(fù)兩次，以除去三氟乙酸。干燥樣品加入1 mL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解制得龍眼多糖LP水解液。

衍生化處理：取400 μL龍眼多糖LP水解液加入等體積1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液，渦旋混勻，70 ℃水浴2 h，冷卻至室溫。樣品加入400 μL 0.3 mol/L HCl溶液然后加入1 200 μL蒸餾水，再加入等體積的氯仿充分混勻后靜置，棄去氯仿，重復(fù)上述操作萃取2 次。萃取后樣品進行高效液相色譜分析：色譜柱C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為90 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.8）；流動相B為色譜純乙腈；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL；檢測器為二極管陣列檢測器。

1.3.6 龍眼多糖LP的傅里葉變換紅外光譜分析

將龍眼多糖LP樣品粉末及KBr在60 ℃烘干至恒質(zhì)量。采用KBr壓片法將樣品制成透明均勻壓片，掃描范圍400～4 000 cm-1，記錄紅外光譜圖。

1.3.7 龍眼多糖LP的核磁共振波譜分析

將70 mg龍眼多糖LP樣品溶解于700 μL重水中，采用AV-600MHz核磁共振儀測定記錄1H、13C波譜以及異核單量子相干譜（heteronuclear single quantum coherence，HSQC）、1H異核多碳相關(guān)譜（1H detected heteronuclear multiple bond correlation，HMBC）和同核氫-氫相關(guān)譜（homonuclear1H-1H correlation spectroscopy，1H-1H COSY）。

1.3.8 巨噬細胞吞噬能力測定

將對數(shù)生長期的巨噬細胞以2×105個/mL接種至24 孔板中，每孔1 mL。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h；吸棄上清液，分別加1 mL含不同終質(zhì)量濃度（50、100、200 μg/mL）LP的完全培養(yǎng)基（含體積分數(shù)10%胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）），LPS組和空白對照組分別加入1 mL含5 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基，每組3 個復(fù)孔，刺激培養(yǎng)24 h；吸棄上清液，各孔分別加入1 mL含異硫氰酸熒光素酯（fluorescein 5-isothiocyanate，F(xiàn)ITC）熒光微球的完全培養(yǎng)基（熒光微球與完全培養(yǎng)基按照1∶10 000的體積混合均勻，37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，超聲5 min），37 ℃、5% CO2避光培養(yǎng)6 h，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2）清洗2 次，去除未被吞噬的熒光微球；加入500 μL PBS重懸細胞，采用流式細胞儀分析，以具有熒光信號的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例表征巨噬細胞吞噬率。

1.3.9 TNF-α、IL-6和IL-1β分泌量的測定

巨噬細胞以2×105個/mL接種至24 孔板中，每孔1 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，樣品組加入1 mL含不同終質(zhì)量濃度（50、100、200 μg/mL）LP的完全培養(yǎng)基，LPS組和空白對照組分別加入1 mL含5 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育48 h，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，隨后1 000 r/min離心5 min，收集上清液并在-20 ℃下保存。根據(jù)相應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書分別測定細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β和IL-6細胞因子的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組數(shù)據(jù)重測定復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 25軟件進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表明具有顯著性差異，采用Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼多糖LP的組成及其紫外-可見光譜

采用分級醇沉的方法對龍眼粗多糖進行分離純化，最終獲得0.8 g多糖組分LP，得率為0.8%。如表1所示，LP中總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為（96.85±0.61）%、（0.14±0.01）%、（0.53±0.23）%。如圖1所示，LP在260 nm和280 nm處無明顯的吸收峰，表明其蛋白和核酸含量較低。以往研究中龍眼多糖多采用離子層析和分子篩的方法分離純化[10-12]，本研究采用分級醇沉的方法獲得純度較高的龍眼多糖LP，且本研究中龍眼多糖提取方法簡便、快速，易于進一步工業(yè)化應(yīng)用。

表1 龍眼多糖LP的組成Table 1 Chemical compositions of LP

圖1 龍眼多糖 LP的紫外-可見光譜Fig.1 Ultraviolet-visible absorption spectrum of LP

2.2 龍眼多糖LP的分子質(zhì)量

如圖2所示，龍眼多糖LP的激光光散射及示差檢測器信號均呈現(xiàn)為單一的對稱峰（示差檢測器在洗脫體積22.5 mL附近的信號峰為流動相），表明LP均一性較好。如表2所示，LP的mn、mw、mp、mz分別為8.25×105、8.42×105、7.67×105、8.63×105Da，分散系數(shù)為1.21，分散系數(shù)約接近1，表明LP的均一性較高。多糖的生物活性與其分子質(zhì)量有著緊密的聯(lián)系。對于相同來源的多糖，高分子質(zhì)量多糖通常比其低分子質(zhì)量多糖顯示出較強的免疫調(diào)節(jié)活性[19,25]。與前期報道的龍眼多糖分子質(zhì)量（104～107Da）相比[26]，本研究中LP分子質(zhì)量中等。龍眼多糖分子質(zhì)量的差異可能與分離純化方法不同有關(guān)。

圖2 龍眼多糖LP的GPC-LLS結(jié)果Fig.2 GPC-LLS chromatogram of LP

表2 龍眼多糖LP的分子質(zhì)量參數(shù)Table 2 Molecular mass parameters of LP

2.3 龍眼多糖LP的單糖組成

如圖3所示，龍眼多糖LP主要由甘露糖醛酸（7.97 min（保留時間，后同））、Man（8.79 min）、Rha（10.54 min）、Glc（17.12 min）、Gal（19.08 min）和Ara（19.82 min）組成，相應(yīng)物質(zhì)的量分數(shù)比為0.09%∶0.35%∶0.12%∶98.70%∶0.57%∶0.20%組成。其中Glc為構(gòu)成LP的主要單糖組分。

圖3 龍眼多糖LP的單糖組成高效液相色譜圖Fig.3 Chromatogram of the monosaccharide composition of LP

2.4 龍眼多糖LP的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

如圖4所示，龍眼多糖LP的紅外光譜圖中3 412 cm-1處特征吸收為O-H的伸縮振動引起；2 924 cm-1處特征吸收為C-H的伸縮振動引起[27]。1 635 cm-1處附近有較強的吸收峰，表明龍眼多糖LP可能含有糖醛酸[28]；1 423 cm-1處特征吸收是C-H的變形振動引起；1 156、1 105 cm-1和1 014 cm-1處出現(xiàn)的連續(xù)峰為吡喃環(huán)中C-O-C的吸收振動引起，表明龍眼多糖LP中可能存在α型吡喃環(huán)[29]；916 cm-1附近的吸收峰表明LP可能含有α-D-葡聚糖[30]；762 cm-1處的吸收峰可能與吡喃糖對稱環(huán)的伸縮振動有關(guān)[31]。

圖4 龍眼多糖LP的傅里葉變換紅外光譜Fig.4 Fourier transform infrared spectrum of LP

2.5 龍眼多糖LP的核磁共振波譜分析結(jié)果

龍眼多糖LP的核磁共振波譜分析結(jié)果如圖5所示。在異頭質(zhì)子區(qū)域（δ4.4～5.5）中存在2 個信號峰，分別為δ5.27和δ4.92（圖5A）。由圖5B可知，存在δ99.28和δ97.68兩個異頭碳信號峰，結(jié)合二維1H-13C HSQC光譜的交叉峰位置（圖5D），將異頭氫信號/異頭碳信號（H1/C1）的交叉峰歸屬為δ4.92/97.68和δ5.27/99.28，分別標記為殘基A和B。

圖5 龍眼多糖LP的一維和二維核磁共振波譜圖Fig.5 One- and two-dimensional NMR spectra of LP

殘基A、B中H、C的化學(xué)位移歸屬如表3所示。殘基A的異頭質(zhì)子為δ4.92，表明其為α-構(gòu)型的糖苷鍵[32]；殘基A上的其他質(zhì)子信號（H2～H6）依據(jù)1H-1H COSY譜圖（圖5C）顯示的交叉峰進行歸類，分別對應(yīng)為δ3.52（H2）、3.66（H3）、3.46（H4）、3.86（H5）、3.93（H6）；依據(jù)二維譜1H-13C HSQC顯示的交叉峰，確定C2～C6的碳譜信號峰，分別歸屬為H2/C2（δ3.52/71.73）、H3/C3（δ3.66/73.38）、H4/C4（δ3.46/69.50）、H5/C5（δ3.86/70.15）及H6/C6（δ3.93/65.51）。未被取代的C6化學(xué)位移一般在60左右[33]。單糖殘基A中C6的出峰位移為65.51，與未被取代的C6化學(xué)位移相比，C6處的化學(xué)位移向低磁場發(fā)生了位移，表明單糖殘基A的C6處有被取代[34-35]。結(jié)合LP的單糖組成與相關(guān)文獻[36]，推斷殘基A為6)-α-D-Glcp-(1。類似的，依據(jù)殘基B的H和C的化學(xué)位移及相關(guān)文獻[37]，推斷殘基B為4)-α-D-Glcp-(1。

表3 龍眼多糖LP的1H和13C核磁共振波譜圖中的化學(xué)位移Table 3 Chemical shifts in 1H and 13C NMR spectra of LP

如圖5D所示，LP殘基A中C1與其H6信號峰相互耦合，表明殘基A中C1連接在其C6位，殘基A中C1（δ97.68）和H6（δ3.93）具有相關(guān)的信號峰（AC1/AH4），表明殘基A（→6)-α-D-Glcp-(1→）是以α-1,6-糖苷鍵自相連接。殘基A中C1與殘基B中H4信號峰相互耦合，表明殘基A的C1連接在殘基B的O4位。結(jié)合對殘基A、B中H、C化學(xué)位移歸屬，推測龍眼多糖LP的主糖鏈由殘基6)-α-D-Glcp-(1和4)-α-D-Glcp-(1鏈接組成，其結(jié)構(gòu)如圖6所示。

本研究中由6)-α-D-Glcp-(1和4)-α-D-Glcp-(1為主鏈的龍眼多糖LP與前期報道的龍眼多糖結(jié)構(gòu)存在差異[21]。多糖提取、純化方法或加工（如干燥等）方式的不同可能會引起龍眼多糖結(jié)構(gòu)及其生物活性的變化[9,38]。研究表明，以6)-α-D-Glcp-(1為主鏈的天然活性多糖在微生物中分布較為廣泛[39-40]。同時研究者從一些果蔬和中草藥中也分離到一些以(1→6)-α-D-Glcp為主鏈的活性多糖，如Zhao Guohua等[41]從番薯中分離到1 種分子質(zhì)量為53.2 kDa的(1,6)-α-D-葡聚糖，其具有促進淋巴細胞和自然殺傷細胞增殖，促進小鼠分泌免疫球蛋白G的作用。Sun Lin等[42]從人參中分離到1 種分子質(zhì)量為17 kDa的(1,6)-α-D-葡聚糖，具有促進淋巴細胞增殖的作用。前期報道表明，具有6)-α-D-Glcp-(1結(jié)構(gòu)的龍眼多糖表現(xiàn)出促進脾淋巴細胞增殖和巨噬細胞NO、IL-1β與IL-6分泌的作用[9]。關(guān)于6)-α-D-Glcp-(1結(jié)構(gòu)與龍眼多糖免疫調(diào)節(jié)活性的聯(lián)系，還有待進一步研究。

2.6 龍眼多糖LP對巨噬細胞吞噬能力的影響

龍眼多糖LP對巨噬細胞吞噬能力的影響如圖7、8所示，質(zhì)量濃度為50、100、200 μg/mL的LP具有促進巨噬細胞吞噬的作用，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，其吞噬率分別為（15.01±0.43）%、（16.56±1.06）%和（20.88±0.71）%，分別是空白對照組的1.41、1.56、1.96 倍。

圖7 龍眼多糖LP對RAW264.7細胞吞噬能力的影響Fig.7 Effect of LP on the phagocytic capacity of RAW264.7 cells

圖8 龍眼多糖LP對RAW264.7細胞吞噬率的影響Fig.8 Effect of LP on the phagocytosis rate of RAW264.7 cells

2.7 龍眼多糖LP對巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影響

如圖9所示，質(zhì)量濃度50、100、200 μg/mL的LP誘導(dǎo)巨噬細胞TNF-α分泌量分別為（5 567.46±24.46）、（6 269.84±47.95）pg/mL和（5 908.73±34.13）pg/mL，分別為空白對照組的2.24、2.52、2.38 倍；誘導(dǎo)巨噬細胞IL-1β分泌量分別為（19.28±0.85）、（33.31±2.19）pg/mL和（50.81±3.22）pg/mL，分別為空白對照組的3.99、6.89、10.51倍；誘導(dǎo)巨噬細胞IL-6分泌量分別為（884.88±43.12）、（2 049.10±108.02）pg/mL和（2 510.08±31.26）pg/mL，分別為空白對照組的3.76、8.71、10.67 倍。以上結(jié)果表明，質(zhì)量濃度50、100、200 μg/mL的LP具有促進巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的作用。

圖9 龍眼多糖LP對RAW264.7細胞TNF-α（A）、IL-1β（B）和IL-6（C）分泌的影響Fig.9 Effect of LP on TNF-α (A), IL-1β (B) and IL-6 (C) secretion in RAW264.7 cells

巨噬細胞是非特異性免疫和特異性免疫應(yīng)答的重要參與者，在多糖的免疫調(diào)節(jié)活性中起著重要的作用[43-44]。研究發(fā)現(xiàn)，一些天然來源的植物多糖通過細胞表面受體介導(dǎo)，激活核因子（nuclear factor，NF）-κB和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路，誘導(dǎo)巨噬細胞吞噬及其NO、TNF-α、IL-1β和IL-6細胞因子分泌[45]。如荊芥多糖通過MAPK通路介導(dǎo)激活巨噬細胞，誘導(dǎo)其IL-6、IL-10和TNF-α的分泌[46]。白術(shù)多糖通過NF-κB信號通路激活巨噬細胞，促進其TNF-α和IL-6分泌[47]。前期研究報道的幾種龍眼多糖也顯示出具有誘導(dǎo)巨噬細胞吞噬[10,19]，促進其IL-6[9]、TNF-α[21]和IL-1β[8]分泌的作用。本研究表明，龍眼多糖LP具有顯著促進巨噬細胞吞噬，誘導(dǎo)其TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的作用。不同結(jié)構(gòu)龍眼多糖激活巨噬細胞的作用與機制存在差異[8,19]，關(guān)于龍眼多糖LP激活巨噬細胞的作用機制還有待進一步研究。

3 結(jié) 論

本實驗采用分級醇沉的方法純化獲得均一性較好的龍眼多糖組分LP。LP由Glc、Gal、Man、甘露糖醛酸、Ara和Rha以相對物質(zhì)的量分數(shù)比為98.70%∶0.57%∶0.35%∶0.09%∶0.20%∶0.12%組成的重均分子質(zhì)量為8.42×105Da的雜多糖，其主鏈結(jié)構(gòu)為6)-α-Glcp-(1→6)-α-Glcp-(14)-α-Glcp-(-1。LP具有促進巨噬細胞的吞噬，誘導(dǎo)其TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的作用。不同結(jié)構(gòu)龍眼多糖及其生物活性分析，可以為龍眼的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。