王佳佳，王 鑫，龐曉旭，黃昆侖,2，許文濤，羅云波,2，程 楠,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

生物傳感器主要由分子識(shí)別和檢測(cè)信號(hào)輸出元件組成[1]，是用于檢測(cè)微量物質(zhì)的工具，具有專一性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、能在線分析等優(yōu)勢(shì)[2-4]。近幾十年來，細(xì)胞生物傳感器以微生物全細(xì)胞作為識(shí)別元件[5]在污染物[6]、化學(xué)成分[7]以及微量元素[8]檢測(cè)等領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展。然而，活細(xì)胞系統(tǒng)的復(fù)雜性導(dǎo)致其必然存在一些天然的缺陷，例如，細(xì)胞膜限制檢測(cè)范圍[9-10]、跨膜運(yùn)輸使響應(yīng)時(shí)間長[10]、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞釋放存在安全隱患[11]等。

生物技術(shù)的快速發(fā)展使生物學(xué)家可準(zhǔn)確地改造生物基因，繼而生產(chǎn)出所需的生物大分子。而合成生物學(xué)發(fā)展前期，主要是基于細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)工程化設(shè)計(jì)，但復(fù)雜的活細(xì)胞生命系統(tǒng)、細(xì)胞的生長與預(yù)期計(jì)劃不一致等問題，極大地限制了合成生物學(xué)發(fā)展。為了打破這些限制，一項(xiàng)新的工程技術(shù)——無細(xì)胞合成生物學(xué)誕生了。無細(xì)胞合成生物學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了無細(xì)胞系統(tǒng)的開發(fā)，很好地彌補(bǔ)了細(xì)胞生物傳感器的缺陷。無細(xì)胞系統(tǒng)以DNA或mRNA作為模板，利用分離的細(xì)胞成分（例如核糖體和重組蛋白）或細(xì)胞粗提取物[12]，在開放的環(huán)境中添加反應(yīng)底物、化學(xué)物質(zhì)（可以是具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)[13]）和輔助因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯以表達(dá)蛋白質(zhì)[14]，整個(gè)構(gòu)建流程可在幾小時(shí)內(nèi)完成[15]。此外，無細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)的能量物質(zhì)均用于目標(biāo)反應(yīng)，而非自我復(fù)制，極大提高了能量利用率[16]?；跓o細(xì)胞系統(tǒng)設(shè)計(jì)的無細(xì)胞生物傳感器還具有諸多優(yōu)點(diǎn)[17]。例如，不需要活細(xì)胞生物參與控制，且不存在轉(zhuǎn)基因生物釋放問題[18]，便于戶外操作；可檢測(cè)細(xì)胞毒性物質(zhì)[18]，檢測(cè)范圍更廣；運(yùn)用了冷凍干燥技術(shù)可使無細(xì)胞體系具有較長的儲(chǔ)存期[19]；檢測(cè)限可以達(dá)到zmol級(jí)別[20]，靈敏度更高；當(dāng)存在抑制或殺死活細(xì)胞的毒素時(shí)，系統(tǒng)也可正常運(yùn)行[21]，具有良好的毒性耐受性；待測(cè)物可與識(shí)別元件直接接觸反應(yīng)，從而更快產(chǎn)生信號(hào)[18]，大大縮短響應(yīng)時(shí)間；沒有細(xì)胞生長等培養(yǎng)過程[22]，縮短生物傳感器構(gòu)建時(shí)間。

本文對(duì)近幾年基于不同平臺(tái)的無細(xì)胞生物傳感器進(jìn)行分類（表1），綜述了不同類型無細(xì)胞生物傳感器的研究進(jìn)展，概述了無細(xì)胞生物傳感器在金屬離子、農(nóng)藥與獸藥殘留等領(lǐng)域的檢測(cè)情況，旨在為無細(xì)胞生物傳感器的研究發(fā)展提供參考。

表1 無細(xì)胞生物傳感器在實(shí)際應(yīng)用中的分類匯總Table 1 Summary of the applications of cell-free biosensors

續(xù)表1

1 無細(xì)胞生物傳感器

無細(xì)胞生物傳感器是在無細(xì)胞體系中進(jìn)行，首先敏感元件（轉(zhuǎn)錄因子等）特異性識(shí)別并結(jié)合待測(cè)物，下游基因隨后被激活從而引發(fā)轉(zhuǎn)錄翻譯過程，最終輸出信號(hào)（例如顏色變化、熒光、電信號(hào)）[10]。如圖1所示，目前，基于不同平臺(tái)設(shè)計(jì)的多種無細(xì)胞生物傳感器被廣泛應(yīng)用于環(huán)境檢測(cè)[9,28]、食品安全檢測(cè)[39,53]、疾病診斷[17,49]等領(lǐng)域。

圖1 無細(xì)胞生物傳感器原理Fig.1 Schematic diagram of the working principle of cell-free biosensors

1.1 識(shí)別反應(yīng)機(jī)制

生物傳感器作為分析裝置，其核心是利用生物分子進(jìn)行特異性識(shí)別機(jī)制[55-56]。隨著待測(cè)物種類增多，傳統(tǒng)的識(shí)別元件（如酶、抗體）在多樣化應(yīng)用中受限，新型識(shí)別元件有待深入研究。以下將介紹幾種目前已用于無細(xì)胞生物傳感器的識(shí)別元件，為將來設(shè)計(jì)新的識(shí)別元件提供思路。

1.1.1 轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，可與基因特異性結(jié)合，并在特定的時(shí)間和地點(diǎn)以特定的強(qiáng)度調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程[57]，這種調(diào)控既可激活也可抑制。例如，轉(zhuǎn)錄因子ArsR響應(yīng)金屬離子As3+[38]，當(dāng)待測(cè)物中不存在As3+時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子ArsR與啟動(dòng)子的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而阻止轉(zhuǎn)錄。當(dāng)As3+存在時(shí)，ArsR會(huì)與As3+特異性結(jié)合，發(fā)生構(gòu)象改變，繼而從RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)脫落，RNA聚合酶方可與啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而下游基因表達(dá)，產(chǎn)生顏色變化；轉(zhuǎn)錄因子LasRV能夠?qū)︴；呓z氨酸內(nèi)酯（acyl homoserine lactones，AHL）產(chǎn)生響應(yīng)（圖2）[17]，當(dāng)在無細(xì)胞體系中加入囊性纖維化患者痰樣時(shí)，基因LasR表達(dá)出的轉(zhuǎn)錄因子LasRV與痰樣中的AHL特異性結(jié)合，進(jìn)而激活下游啟動(dòng)子表達(dá)，產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，檢測(cè)限為4.9 nmol/L。利用無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)僅需2.5 h即可觀察到樣品間的差異[17]，證明了無細(xì)胞生物傳感器用于快速檢測(cè)具有可行性。此外，當(dāng)待測(cè)物沒有與其對(duì)應(yīng)的配體時(shí)，可通過代謝酶將轉(zhuǎn)錄因子不可識(shí)別的待測(cè)物轉(zhuǎn)化成可檢測(cè)的配體進(jìn)行檢測(cè)[30,34]。然而，轉(zhuǎn)錄因子存在會(huì)與除待測(cè)物以外物質(zhì)反應(yīng)的問題[10]，有待進(jìn)一步研究。

圖2 AHL響應(yīng)型LasRV生物傳感器原理示意圖[17]Fig.2 Schematic diagram of AHL responsive LasRV biosensor[17]

1.1.2 Toehold開關(guān)

Toehold開關(guān)是一種由兩條RNA組成的可編程工程元件[58]，利用發(fā)卡結(jié)構(gòu)來隔離核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome binding site，RBS）和起始密碼子以阻止順式基因翻譯啟動(dòng)[41]。Toehold開關(guān)因其較好的特異性以及可識(shí)別任意核酸序列，常被用作檢測(cè)核酸的無細(xì)胞生物傳感器識(shí)別元件。例如檢測(cè)呼吸道合胞體病毒亞型A和B（圖3）[42]，分別以呼吸道合胞體病毒亞型A和B為觸發(fā)RNA設(shè)計(jì)開關(guān)，當(dāng)觸發(fā)RNA存在時(shí)，會(huì)與Toehold開關(guān)的立足點(diǎn)區(qū)域特異性結(jié)合，導(dǎo)致Toehold開關(guān)發(fā)生構(gòu)象改變，暴露核糖體結(jié)合位點(diǎn)，從而激活β-半乳糖苷酶基因（LacZ）表達(dá)，產(chǎn)生從黃色到紫色的顏色變化。Toehold開關(guān)可以在布料、多孔氧化鋁等多種材料中運(yùn)行[40]，為便攜性無細(xì)胞生物傳感器開發(fā)提供了多個(gè)選擇平臺(tái)。然而，Toehold開關(guān)存在鎖死或OFF狀態(tài)下的基因表達(dá)問題，限制了其發(fā)展。目前主要通過使用12 nts環(huán)并結(jié)合更穩(wěn)定的莖或?qū)h(huán)域減少到11 nts[46]，以減少Toehold開關(guān)OFF狀態(tài)下基因表達(dá)。

圖3 Toehold開關(guān)設(shè)計(jì)原理[42]Fig.3 Schematic diagram of the principle for designing Toehold switches[42]

1.1.3 核糖開關(guān)

核糖開關(guān)是在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上順式調(diào)控表達(dá)的RNA元件[59]，由可與小分子配體特異性結(jié)合的適配子和調(diào)控基因表達(dá)的表達(dá)平臺(tái)兩部分構(gòu)成[60-61]。相較于反式作用RNA和蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)，基于核糖開關(guān)識(shí)別的傳感器只需調(diào)整一個(gè)DNA模板即可達(dá)到優(yōu)化的目的[36]，操作更簡化。如圖4所示，在檢測(cè)水中氟化物時(shí)，當(dāng)有氟化物存在時(shí)，核糖體開關(guān)與其特異性結(jié)合，發(fā)生構(gòu)象改變，下游基因表達(dá)，產(chǎn)生熒光；當(dāng)沒有氟化物時(shí)，核糖開關(guān)折疊成終止發(fā)卡結(jié)構(gòu)，阻止下游基因表達(dá)，檢測(cè)限為50 μmol/L[36]。然而，由于用于合成核糖開關(guān)的工程信號(hào)模塊設(shè)計(jì)方法尚未完全明確，目前核糖開關(guān)數(shù)量有限[61]，基于核糖開關(guān)無細(xì)胞生物傳感器的相關(guān)報(bào)道也較少。

圖4 檢測(cè)氟化物的核糖開關(guān)無細(xì)胞生物傳感器示意圖[36]Fig.4 Schematic diagram of riboswitch cell-free biosensor for fluoride detection[36]

1.1.4 成簇規(guī)律間隔短回文序列及相關(guān)蛋白系統(tǒng)體系

成簇規(guī)律間隔短回文序列及相關(guān)蛋白系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated，CRISPR-Cas）是古生菌和細(xì)菌中特有的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[62]，依賴于DNA/RNA-RNA識(shí)別和結(jié)合來對(duì)核酸序列特異性切割[63]，根據(jù)不同的Cas效應(yīng)器（Cas9、Cas12、Cas13等），CRISPR-Cas生物傳感器系統(tǒng)有不同的剪切原理[64]，例如，CRISPR-Cas13a系統(tǒng)中，crRNA與Cas蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體（ribonucleoprotein，RNP），直接切割目標(biāo)探針顯示熒光信號(hào)[65]。CRISPR-Cas系統(tǒng)具有易編程的特點(diǎn)，不僅可用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因編輯，還可以最小的成本將DNA雙鏈斷裂[63]，是目前無細(xì)胞生物傳感器領(lǐng)域中新引入的識(shí)別機(jī)制，例如利用CRISPR-Cas9設(shè)計(jì)鑒別兩種寨卡病毒菌種的無細(xì)胞生物傳感器（圖5）[46]，通過逆轉(zhuǎn)錄將觸發(fā)序列附加到基于核酸序列的擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技術(shù)擴(kuò)增的病毒RNA上，Cas9切割具有PAM序列菌株的DNA片段，切割后的DNA片段無法與Toehold開關(guān)特異結(jié)合，而未切割DNA片段可與Toehold開關(guān)特異結(jié)合，促使下游Lacz基因表達(dá)，產(chǎn)生顏色變化，檢測(cè)限為1 fmol/L；利用CRISPR-Cas9檢測(cè)尿液或血液中RNA生物標(biāo)志物[66]，一旦傳感器接觸到待測(cè)物的RNA，待測(cè)物RNA會(huì)與處于自阻遏狀態(tài)的gRNA發(fā)生雜交，釋放目標(biāo)RNA并恢復(fù)與terR基因結(jié)合能力，繼而Cas9進(jìn)行切割，從而使綠色熒光蛋白基因不再被抑制，熒光強(qiáng)度增加。由于gRNA的額外序列可被重新設(shè)計(jì)，該生物傳感器理論上擁有檢測(cè)多種RNA生物標(biāo)志物的能力[66]，但CRISPR-Cas系統(tǒng)存在脫靶等潛在風(fēng)險(xiǎn)[67]，以其作為識(shí)別機(jī)制的無細(xì)胞生物傳感器還較為少見。

圖5 基于CRISPR-Cas9檢測(cè)寨卡病毒的無細(xì)胞生物傳感器原理[46]Fig.5 Schematic diagram of cell-free biosensor for Zika virus detection based on CRISPR-Cas9[46]

1.1.5 其他

除上述的識(shí)別機(jī)制外，還有其他新型識(shí)別元件，例如利用缺乏氨基酸的無細(xì)胞合成蛋白系統(tǒng)（cell-free protein synthesis，CFPS）設(shè)計(jì)無細(xì)胞生物傳感器定量檢測(cè)氨基酸[37]。CFPS具有開放性，即允許改變體系中各種成分的濃度或替換內(nèi)源性成分（如同位素標(biāo)記、非天然氨基酸、熒光標(biāo)記tRNA、突變核糖體）[68]。當(dāng)體系中缺少特定的氨基酸時(shí)，翻譯過程無法繼續(xù)，加入含有特定氨基酸的樣品后，翻譯繼續(xù)，產(chǎn)生熒光，檢測(cè)限為100 nmol/L。該過程無需化學(xué)處理或色譜分離，幾小時(shí)內(nèi)即可準(zhǔn)確測(cè)定出樣品中氨基酸滴度，為氨基酸的定量提供了更實(shí)惠、靈活的選擇。此外，還可利用抗生素氨基糖苷類與細(xì)菌30S核糖體亞基結(jié)合可抑制翻譯的原理設(shè)計(jì)無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)血清抗生素[48]。當(dāng)抗生素不存在時(shí)，T3 RNAP mRNA翻譯出T3 RNAP，從而激活NanoLuc螢光素酶基因表達(dá)翻譯，產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)；當(dāng)抗生素存在時(shí)，T3 RNAP mRNA和NanoLuc螢光素酶翻譯受到抑制，導(dǎo)致信號(hào)減弱。雖然大部分傳感器具有識(shí)別機(jī)制，但也有傳感器不具有識(shí)別元件，例如利用抗生素抑制細(xì)菌蛋白合成檢測(cè)抗生素[47]。當(dāng)抗生素不存在時(shí)，LacZ表達(dá)，合成β-半乳糖苷酶，發(fā)生顏色變化；當(dāng)抗生素存在時(shí)，β-半乳糖苷酶合成受到抑制，顏色無變化。

1.2 信號(hào)輸出

1.2.1 比色信號(hào)

比色信號(hào)由于肉眼可見，常被用作無細(xì)胞生物傳感器的輸出信號(hào)。例如，LacZ表達(dá)產(chǎn)物可使黃色底物氯酚紅-β-D-半乳糖吡喃糖苷變成紫色；兒茶酚-2,3-雙加氧酶基因（XylE）表達(dá)產(chǎn)物可使無色低成本底物焦茶酚變成黃色[38]。LacZ的檢測(cè)限略低于XylE[38]，且其表達(dá)產(chǎn)物β-半乳糖苷酶的催化速度快[40]，常被用作比色信號(hào)報(bào)告基因。然而，β-半乳糖苷酶是一種比熒光蛋白更大的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄翻譯需要更多的能量，從而降低了其生成量[69]。目前，Ma Duo等[20]提出將蛋白分為α與w兩部分，利用Toehold開關(guān)隔離LacZα序列，補(bǔ)充合成的LacZw不僅提高了β-半乳糖苷酶的生成量，還使檢測(cè)時(shí)間縮短了23 min。

1.2.2 熒光信號(hào)

熒光信號(hào)作為另一種常見的無細(xì)胞生物傳感器輸出信號(hào)，常用熒光蛋白和熒光RNA適配體進(jìn)行熒光表達(dá)。熒光無細(xì)胞生物傳感不需要ATP來釋放熒光，穩(wěn)定性高、操作簡單。并且，Lopreside等[26]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)比比色信號(hào)響應(yīng)時(shí)間更短，檢測(cè)限更低。

熒光蛋白是一種可發(fā)熒光的蛋白質(zhì)[70]。在特定激發(fā)光下，熒光蛋白發(fā)射光可用熒光計(jì)測(cè)量，且相對(duì)穩(wěn)定、成熟時(shí)間短，因此常將其作為熒光生物傳感器首選。熒光蛋白種類豐富，包括綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、翡翠綠色熒光蛋白（emerald green fluorescent protein，EmGFP）等。

熒光RNA適配體是一類可與小分子熒光團(tuán)結(jié)合的RNA。這些小分子熒光團(tuán)與綠色熒光蛋白中發(fā)現(xiàn)的熒光團(tuán)相似，通常是沒有熒光的，與其同源適配體結(jié)合后，會(huì)產(chǎn)生明顯的熒光現(xiàn)象。例如：菠菜適配體與3,5-二氟-4-羥基亞芐基咪唑啉酮（3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone，DFHBI）結(jié)合產(chǎn)生綠色熒光[71]，西蘭花適配體與(Z)-4-(3,5-二氟-4-羥基亞芐基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-5(4H)-酮結(jié)合產(chǎn)生綠色熒光[72]，玉米適配體與3,5-二氟-4-羥基亞芐基-咪唑啉酮-2-肟結(jié)合產(chǎn)生黃色熒光[73]。熒光適配體即使熒光團(tuán)被光漂白，也可以連續(xù)交換結(jié)合熒光團(tuán)，產(chǎn)生熒光，具有比熒光蛋白更長的熒光壽命[74]。

1.2.3 生物發(fā)光

熒光素酶是一類在自然界中不需要激發(fā)光照射即能產(chǎn)生生物熒光的一類酶，可用于無細(xì)胞生物傳感器光信號(hào)輸出。在沒有信號(hào)背景情況下，熒光素酶具有極大的線性范圍（高達(dá)7～8 個(gè)數(shù)量級(jí)）[33]。Voyvodic等[34]利用螢火蟲熒光素酶基因作為報(bào)告基因設(shè)計(jì)無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)可卡因，提高了信噪比。此外，NanoLuc熒光素酶具有高靈敏度和寬動(dòng)態(tài)范圍[75]，也可用于無細(xì)胞生物傳感器設(shè)計(jì)[48]。

1.2.4 電信號(hào)

電信號(hào)利用電極捕獲物質(zhì)產(chǎn)生電流或電壓變化進(jìn)行檢測(cè)，可用作無細(xì)胞生物傳感器的輸出信號(hào)。Mousavi等[53]利用電極捕獲含有氧化還原標(biāo)記的DNA產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)的原理設(shè)計(jì)無細(xì)胞生物傳感器（圖6）檢測(cè)抗生素耐藥基因，該傳感器利用不同的Toehold開關(guān)激活后產(chǎn)生不同的限制性內(nèi)切酶，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)抗生素耐藥基因的目的，檢測(cè)限為1 fmol/L。此外，Zhang Yan等[50]借助血糖儀讀數(shù)，結(jié)合代謝模塊設(shè)計(jì)無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)Zn2+。Zn2+與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，激活LacZ表達(dá)產(chǎn)生β-半乳糖酶，而β-半乳糖酶又將乳糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而能夠用血糖儀讀數(shù)，輸出電信號(hào)。

圖6 基于納米載體的多路電化學(xué)接口無細(xì)胞生物傳感器原理圖[53]Fig.6 Schematic diagram of multi-channel electrochemical interface cell-free biosensor based on nanocarriers[53]

1.3 生物傳感平臺(tái)

生物傳感平臺(tái)是傳感器反應(yīng)的載體，目前報(bào)道的無細(xì)胞生物傳感器平臺(tái)有以下5 種。1）溶液平臺(tái)?；谌芤旱臒o細(xì)胞生物傳感器無需再經(jīng)其他平臺(tái)，可直接進(jìn)行信號(hào)讀取，并且成分在體系中分散更均勻。目前，基于溶液的無細(xì)胞生物傳感器的相關(guān)報(bào)道比較多，其發(fā)展已經(jīng)趨于成熟。2）紙張平臺(tái)。通過冷凍干燥技術(shù)將細(xì)胞提取物、構(gòu)建的基因網(wǎng)絡(luò)等嵌入到紙張上，以創(chuàng)建具有細(xì)胞基本轉(zhuǎn)錄和翻譯功能且無菌的紙張平臺(tái)?；诩垙埰脚_(tái)的無細(xì)胞生物傳感器在室溫下穩(wěn)定、易于貯存、價(jià)格便宜，且只需加水即可激活[40]，已成為近幾年的研究熱點(diǎn)。3）電極平臺(tái)。該平臺(tái)生物傳感器將工程分子組件與電子產(chǎn)品結(jié)合[49]，通過翻譯板塊輸出葡萄糖，即可使用血糖儀進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。這些傳感器不需再定制類似數(shù)據(jù)閱讀器的基礎(chǔ)設(shè)施，可降低成本。4）納米載體。作為2021年國家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目的納米載體具有放大信號(hào)[76]、催化反應(yīng)[77]等優(yōu)勢(shì)，但基于納米載體的無細(xì)胞生物傳感器目前還較為少見，有待深入研究。5）微流體平臺(tái)。微流體可使用微小通道來處理少量樣品，具有能夠縮短分析時(shí)間、減少昂貴試劑使用等優(yōu)勢(shì)，然而這類無細(xì)胞生物傳感器的報(bào)道同樣比較少。盡管目前無細(xì)胞生物傳感平臺(tái)不再單一，但除溶液外的平臺(tái)研究還較少。未來一段時(shí)間內(nèi)，進(jìn)一步開發(fā)提升檢測(cè)效率且便攜的無細(xì)胞生物傳感平臺(tái)或成為該方向研究重點(diǎn)。

2 無細(xì)胞生物傳感器在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 金屬離子檢測(cè)

環(huán)境和食品中的化學(xué)污染物金屬離子威脅著人類的生存和健康，金屬離子含量高，會(huì)導(dǎo)致許多健康問題發(fā)生。

Pellinen等[9]早在2004年就以轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別采用熒光素酶作為輸出信號(hào)建立無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)Hg2+，然而并沒有給出檢測(cè)限。隨著研究的深入，直到2019年，Gupta等[33]則將熒光素酶換成熒光蛋白設(shè)計(jì)傳感器檢測(cè)Hg2+，給出的檢測(cè)限為1 μg/L。同年，Zhang Peng等[18]也在先前的工作基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)熒光無細(xì)胞生物傳感器并檢測(cè)了新的金屬離子As3+，其檢測(cè)限為661.005 nmol/L。由于溶液平臺(tái)的無細(xì)胞生物傳感器攜帶不便，Gr?we等[39]設(shè)計(jì)了基于紙張的熒光無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)Hg2+，并開發(fā)了一種與智能手機(jī)相結(jié)合的雙濾鏡系統(tǒng)，使戶外檢測(cè)更加方便，檢測(cè)限為6 μg/L。

目前，無細(xì)胞生物傳感器已用于檢測(cè)Pb2+[28]、Zn2+[28,50]、Cu2+[28]、As3+[18,32,38]、Hg2+[9,18,26,33,39]和Cd2+[28]，其中檢測(cè)Hg2+的研究較多，但其識(shí)別機(jī)制還局限于轉(zhuǎn)錄因子，檢測(cè)金屬離子種類有限，與便攜設(shè)備聯(lián)用比較少。因此，用于檢測(cè)金屬離子的無細(xì)胞生物傳感器未來可探索新的轉(zhuǎn)錄因子或識(shí)別元件，進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)范圍；與血糖儀、智能手機(jī)、3D打印裝置等便攜設(shè)備結(jié)合使用，使數(shù)據(jù)讀取更加精準(zhǔn)方便。

2.2 農(nóng)藥和獸藥殘留檢測(cè)

農(nóng)藥和獸藥的過度濫用會(huì)導(dǎo)致其殘存于環(huán)境、動(dòng)植物體內(nèi)或其代謝物中，對(duì)水土資源及食品造成污染，給人體健康帶來危害。

Pellinen等[9]以熒光素酶基因構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別無細(xì)胞生物傳感器用于檢測(cè)四環(huán)素，檢測(cè)限為10 ng/mL。隨著無細(xì)胞生物傳感器的發(fā)展，Jung等[28]利用熒光適配體設(shè)計(jì)的傳感器檢測(cè)四環(huán)素等污染物并應(yīng)用于實(shí)際市政水樣檢測(cè)。此外，Silverman等[30]利用除草劑阿特津通過酶的作用可轉(zhuǎn)換為氰尿酸的原理設(shè)計(jì)熒光無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)水樣中阿特津，檢測(cè)限為20 μmol/L，但是，并沒有達(dá)到美國環(huán)境保護(hù)局對(duì)阿特津3 μg/L的檢測(cè)限要求。隨著對(duì)無細(xì)胞生物傳感器平臺(tái)的研究深入，低成本的紙張無細(xì)胞生物傳感器開始出現(xiàn)。Duyen等[47]開發(fā)了一系列基于紙張的無細(xì)胞生物傳感器，利用抗生素抑制β-半乳糖酶合成的原理，檢測(cè)抑制細(xì)菌蛋白合成的抗生素帕羅霉素、四環(huán)素、氯霉素和紅霉素，其檢測(cè)限分別為0.5、2.1、0.8 mg/mL和6.1 mg/mL，并對(duì)真實(shí)水樣進(jìn)行了檢測(cè)。為使數(shù)據(jù)讀取更加方便準(zhǔn)確，Amalfitano等[49]則結(jié)合血糖儀設(shè)計(jì)無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)四環(huán)素。

目前，已有基于溶液[9,28,30]、紙張[47-48]、納米載體[53]和電極[49]平臺(tái)的無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)農(nóng)藥和獸藥殘留，其中多數(shù)是檢測(cè)水樣中的抗生素，最低檢測(cè)限為10 ng/mL，檢測(cè)樣品比較單一。未來，進(jìn)一步提高無細(xì)胞傳感器的特異性，將其應(yīng)用于復(fù)雜的食品樣品檢測(cè)，可促進(jìn)食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的快速發(fā)展。

2.3 病毒檢測(cè)

近些年來，由病毒引起的疾病具有極高的發(fā)病率，利用無細(xì)胞生物傳感器快速、靈敏、簡便的優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)病毒，已在臨床診斷領(lǐng)域發(fā)揮功效。

Pardee等[40]構(gòu)建的基于Toehold開關(guān)識(shí)別紙張無細(xì)胞生物傳感器可肉眼檢測(cè)埃博拉病毒，檢測(cè)限為3 nmol/L。2016年，他們?cè)谙惹皹?gòu)建的無細(xì)胞生物傳感器的基礎(chǔ)上，對(duì)Toehold開關(guān)進(jìn)行了優(yōu)化，并利用CRISPR-Cas9作為識(shí)別元件區(qū)分血漿中的不同的寨卡病毒毒株[46]。2018年，Ma Duo等[20]首次將磁珠技術(shù)用于無細(xì)胞生物傳感檢測(cè)的樣品前處理，對(duì)糞便樣本中的諾如病毒進(jìn)行富集，使檢測(cè)靈敏度提高了1 000 倍，檢測(cè)限為270 zmol/L，盡管此設(shè)計(jì)可檢測(cè)諾如病毒GII.4基因型，但無法檢測(cè)近些年比較流行的GII.17基因型。Sun Qiuli等[43]則解決了這一問題，他們基于此前研究設(shè)計(jì)的紙張比色傳感器可區(qū)分GII.4與GII.17基因型，檢測(cè)限分別為0.5 pmol/L、2.6 fmol/L。NASBA是病毒檢測(cè)常用的擴(kuò)增技術(shù)，需要1～3 h。為縮短擴(kuò)增時(shí)間，Park等[44]提出用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（reverse transcription loop-mediated，RT-LAMP）技術(shù)代替NASBA，對(duì)唾液中的冠狀病毒進(jìn)行處理，檢測(cè)限為3 fmol/L。此外，Nguyen等[45]將設(shè)計(jì)的檢測(cè)埃博拉病毒的無細(xì)胞傳感器置于兩層親膚的硅膠材料中間，實(shí)現(xiàn)了可穿戴目的。無細(xì)胞生物傳感器也可與現(xiàn)有的數(shù)據(jù)讀取設(shè)備結(jié)合，例如血糖儀。Tang Yidan等[51]利用轉(zhuǎn)化酶可將底物蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，通過設(shè)計(jì)含有轉(zhuǎn)化酶基因的Toehold開關(guān)識(shí)別寨卡病毒，最終通過血糖儀進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，檢測(cè)限為20 copies。Amalfitano等[49]則選取海藻糖酶作為轉(zhuǎn)化酶設(shè)計(jì)無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2），檢測(cè)限為100 copies。

目前，基于病毒檢測(cè)的無細(xì)胞生物傳感器設(shè)計(jì)流程較為成熟，通?；诩垙埰脚_(tái)對(duì)病毒進(jìn)行核酸擴(kuò)增-Toehold開關(guān)識(shí)別-輸出比色信號(hào)-便攜設(shè)備數(shù)據(jù)讀取。相較于傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)手段，基于紙張的無細(xì)胞生傳感器方便攜帶，不需要專業(yè)人員和大型儀器，在快速檢測(cè)領(lǐng)域極具應(yīng)用前景。

2.4 群體感應(yīng)分子檢測(cè)

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）一直是食品安全和環(huán)境領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，利用QS分子（包括AHL、N-3-氧十二烷基-L-高絲氨酸內(nèi)酯等）可以開發(fā)控制細(xì)胞間通訊的藥物和潛在抗菌劑[78]。QS是細(xì)菌通過對(duì)自身誘導(dǎo)物信號(hào)產(chǎn)生、釋放和濃度的感應(yīng)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力[23]。

Kawaguchi等[23]報(bào)道了一款基于轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的比色無細(xì)胞生物傳感器可快速篩選群體感應(yīng)分子中的AHL，通過肉眼即可看到顏色變化，檢測(cè)限為100 nmol/L。而Yang等[27]則以熒光作為信號(hào)輸出設(shè)計(jì)無細(xì)胞生物傳感器篩選與腔鏈霉菌群體受體蛋白相互作用的群體感應(yīng)分子。無細(xì)胞生物傳感器不僅能用于群體感應(yīng)分子的篩選，還可以用于檢測(cè)臨床樣本，判斷患者病情。Seto[54]設(shè)計(jì)的無細(xì)胞生物傳感器可快速檢測(cè)患者是否感染病理性銅綠假單胞菌。在銅綠假單細(xì)胞菌的毒性作用下，N-3-氧十二烷基-L-高絲氨酸內(nèi)酯使轉(zhuǎn)錄蛋白從啟動(dòng)子中解綁，從而允許下游基因表達(dá)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。

目前，利用無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)群體感應(yīng)分子的報(bào)道還是比較多的，檢測(cè)樣本覆蓋水樣[18]、痰樣[17]、細(xì)菌[27,54]。然而，其識(shí)別機(jī)制還限于轉(zhuǎn)錄因子。探索檢測(cè)群體感應(yīng)分子新的識(shí)別元件用于無細(xì)胞生物傳感器設(shè)計(jì)，將是未來重點(diǎn)的研究方向。

2.5 其他

除上述外，無細(xì)胞生物傳感器還用于苯甲酸鹽、內(nèi)分泌干擾素、氨基酸的檢測(cè)以及教學(xué)工具的設(shè)計(jì)。苯甲酸鹽是一種常見的食品防腐添加劑，其在食品中最高含量限制為0.1%。若向含有抗壞血酸的飲料中添加苯甲酸鹽，苯甲酸鹽會(huì)轉(zhuǎn)化為低水平的苯（一種強(qiáng)致癌物）[16]，運(yùn)輸過程中溫度的升高亦可增強(qiáng)反應(yīng)。因此，Voyvodic等[34]設(shè)計(jì)了一款無細(xì)胞傳感器可以100%準(zhǔn)確區(qū)分哪些飲料中含有苯甲酸鹽。內(nèi)分泌干擾素是一類能擾亂生殖系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)。Salehi等[24]設(shè)計(jì)了基于轉(zhuǎn)錄因子甲狀腺受體識(shí)別的無細(xì)胞生物傳感器，用于檢測(cè)內(nèi)分泌干擾素。基于細(xì)菌檢測(cè)內(nèi)分泌干擾物需要24～36 h，而該生物傳感器只需要不到30 min就可以得到結(jié)果。此后，他們將甲狀腺受體結(jié)合域替換為雌激素受體結(jié)合域設(shè)計(jì)生物傳感器檢測(cè)血液與尿液中的內(nèi)分泌干擾素雙酚A、β-雌二醇與二乙基丙腈[25]，檢測(cè)限分別為330、26 nmol/L和9 nmol/L，比同類細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)效果更好。缺乏氨基酸會(huì)導(dǎo)致生理功能異常，影響抗體代謝，因此氨基酸可作為多種癌癥早期診斷的指標(biāo)。Jang等[37]報(bào)道了無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)氨基酸。此后，Jang等[52]又對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，與血糖儀結(jié)合使用，使其操作更方便。生物標(biāo)志物是可標(biāo)記細(xì)胞、組織器官等的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生改變或可能發(fā)生改變的生化指標(biāo)。Takahashi等[41]設(shè)計(jì)的低成本紙張無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)臨床糞便樣本中的生物標(biāo)志物mRNA，檢測(cè)限為30 amol/L～3 fmol/L。無細(xì)胞生物傳感器不僅可用于物質(zhì)檢測(cè)，也可作為教學(xué)工具輔助生物學(xué)習(xí)，Huang等[35]設(shè)計(jì)了檢測(cè)香蕉和獼猴桃DNA的教學(xué)工具，便于學(xué)生對(duì)生物學(xué)的理解。

3 結(jié) 語

綜上，無細(xì)胞生物傳感器的研究日漸增多，其發(fā)展也越來越成熟。目前，多種平臺(tái)已用于構(gòu)建無細(xì)胞生物傳感器，平臺(tái)覆蓋了溶液、紙張、電極、納米載體、微流體。無細(xì)胞生物傳感器已在水樣、血清、尿液等實(shí)際樣品中應(yīng)用，但對(duì)于食品等復(fù)雜實(shí)際樣品檢測(cè)的應(yīng)用還比較少，這或許是后續(xù)工作可以重點(diǎn)關(guān)注的領(lǐng)域。

隨著樣品檢測(cè)需求日益增加，無細(xì)胞生物傳感器依然面臨巨大的挑戰(zhàn)：1）實(shí)際樣品的復(fù)雜性，含有多種成分會(huì)干擾無細(xì)胞生物傳感器的檢測(cè)。為提升無細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)的準(zhǔn)確性，可尋找新的識(shí)別元件或設(shè)計(jì)更為高效的開關(guān)或優(yōu)化無細(xì)胞體系等有效的措施提升無細(xì)胞生物傳感器的靈敏度和特異性；2）目前用于無細(xì)胞系統(tǒng)的主要是大腸桿菌提取物，未來可以基于真核生物的提取物設(shè)計(jì)靈敏度更高、更為實(shí)用的生物傳感器；3）實(shí)際樣品檢測(cè)單一，無細(xì)胞生物傳感器目前大多數(shù)還是檢測(cè)水樣和血清，對(duì)于多樣化實(shí)際樣本的檢測(cè)是未來的檢測(cè)應(yīng)用方向；4）目前基于無細(xì)胞生物傳感器的研究方向比較單一，多集中于液相平臺(tái)和使用轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別，因此研究多樣化識(shí)別元件和平臺(tái)是未來發(fā)展趨勢(shì)。綜上所述，無細(xì)胞生物傳感器展現(xiàn)出了極大的檢測(cè)應(yīng)用潛力，隨著進(jìn)一步的研究開發(fā)，便攜、靈敏的無細(xì)胞生物傳感器有望在醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境等領(lǐng)域中投入應(yīng)用。