張晶云，榮仕賓，2，秦艷青，吳 疆，王 俊，李晶晶，馮雨晴，趙園園，鐘 秋，史宏志

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省煙草公司許昌市公司襄城縣分公司，河南 襄城 461700；3.中國煙草總公司四川省公司，四川 成都 600041；4.河南省南陽市煙草專賣局，河南南陽 473000；5.四川省煙草公司德陽市公司，四川 德陽 618400）

煙草特有亞硝胺（TSNAs）是由煙草生物堿和亞硝酸發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成的存在于煙葉和煙氣中的具有動物致癌性的N-亞硝基化合物[1]。隨著吸煙損害健康的問題越來越受到人們的重視，降低TSNAs相關(guān)研究得到世界的廣泛關(guān)注。TSNAs主要有8 種[2-3]，其中以N-亞硝基去甲基煙堿（NNN）、4-（N-甲基-亞硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、N-亞硝基新煙草堿（NAT）和N-亞硝基假木賊堿（NAB）4 種含量較高。TSNAs 前體物主要包括生物堿、硝酸鹽和亞硝酸鹽，生物堿主要有4種：煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿，其中煙堿占生物堿總量的92%以上，屬于叔胺類生物堿，其吡咯環(huán)被氧化后生成假氧化煙堿（PON），進(jìn)而生成NNK，降煙堿、新煙草堿和假木賊堿等仲胺類煙堿可直接生成NNN、NAT 和NAB[4-5]。關(guān)于硝酸鹽和亞硝酸鹽與TSNAs 的 關(guān) 系 討 論 眾 多，BRUNNEMANN 等[6]和FISCHER 等[7-8]認(rèn)為總TSNAs 與硝酸鹽之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，硝酸鹽水平是TSNAs 積累的一個指示物，硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的過程則是TSNAs 積累的限制階段。BURTON 等[9]研究表明，TSNAs 在煙葉中的分布更類似于亞硝酸鹽的分布，引起TSNAs積累的主要因素是亞硝酸鹽。史宏志等[10]認(rèn)為TSNAs 的形成受到生物堿和亞硝酸鹽的雙重影響。TSNAs 的形成和積累主要發(fā)生在調(diào)制過程和貯藏過程中，在調(diào)制階段，由于微生物的作用，硝酸鹽被硝酸還原酶還原生成亞硝酸鹽，進(jìn)而與生物堿發(fā)生反應(yīng)形成TSNAs[11-12]。此后的研究表明[13-16]，調(diào)制結(jié)束后的貯藏階段也會形成大量的TSNAs，在貯藏過程中，硝酸鹽可產(chǎn)生氣態(tài)氮氧化物，其與生物堿發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成TSNAs。

煙梗是煙葉的重要組成部分，是卷煙生產(chǎn)中的原料之一?？緹煹暮Ｂ蕿?5%～35%。煙梗具有填充值高、焦油釋放量低的優(yōu)點，是卷煙降焦和降低配方成本的重要手段[17-19]。煙葉葉片和主脈中TSNAs 前體物含量有較大差異，靳彤等[20]、劉扣珠等[21]對初烤煙葉片和主脈間TSNAs及前體物進(jìn)行差異分析，結(jié)果表明，主脈中生物堿含量低于葉片，但硝態(tài)氮含量和TSNAs 含量顯著高于葉片。不同采收方式對葉片和主脈間TSNAs 含量有重要影響，采收方式不同，葉片和主脈的失水速率有所差異，楊煥文等[22]對白肋煙葉片和主脈中TSNAs進(jìn)行了相關(guān)研究，但是由于不同類型煙葉所采用的調(diào)制方法不同，因而調(diào)制后煙葉中TSNAs 含量也有所差異。多年來，有關(guān)采收方式的研究多集中在對煙葉產(chǎn)質(zhì)量的影響方面[23-24]，對TSNAs 的影響研究較少，為探究采收方式對不同類型煙葉葉片和主脈間TSNAs 及前體物的影響差異，以烤煙品種云煙87、曬煙什煙1號和雪茄煙德雪3 號為材料，設(shè)置摘葉采收、片脈分離采收和帶莖采收3 種采收方式，探究其對葉片和主脈中TSNAs 及前體物含量的影響，為選擇適宜的采收方式，有效降低煙葉葉片和主脈中TSNAs 及前體物含量，實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)低害煙葉生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 選材與地點

烤煙品種試驗地點設(shè)在河南省南陽市方城縣清河鎮(zhèn)金葉園園區(qū)。供試材料為當(dāng)?shù)刂髟云贩N云煙87 的上部6 片葉。云煙種植面積為666.67 m2，煙苗于2020 年4 月15 日移栽，行株距為120 cm×55 cm。試驗于8月19日開始采收，8月20日開始烘烤，于8 月27 日烘烤結(jié)束。施肥方式為當(dāng)?shù)亓?xí)慣施肥，每公頃45 kg 氮，供試肥料包括煙草專用復(fù)合肥（N∶P∶K=10∶10∶20）、硝酸鉀、硫酸鉀、液態(tài)鉀肥、芝麻餅肥、沼渣有機(jī)肥。田間管理按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。

雪茄煙和曬煙試驗地點設(shè)在四川省什邡市師古鎮(zhèn)。供試材料為當(dāng)?shù)刂髟云贩N雪茄煙德雪3號和曬煙什煙1 號的上部煙葉，各供試品種種植面積均為333.33 m2。煙苗于2020 年4 月30 日移栽，行距120 cm，株距40 cm。供試土壤屬紫色土，土壤肥力中等，前作為水稻，田間管理按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范統(tǒng)一管理。

1.2 試驗設(shè)計

采取隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，對采收方式設(shè)置3 個處理：摘葉采收（T1），即上部6片葉成熟后一次性采收進(jìn)行調(diào)制；片脈分離采收（T2），即上部6片葉成熟后一次性采收，將葉片和主脈分開進(jìn)行調(diào)制；帶莖采收（T3），即上部6 片葉成熟后帶莖一次性砍收進(jìn)行調(diào)制。

烤煙上部葉（頂部3 片葉）正常成熟時對上部6片葉全部進(jìn)行采摘烘烤，T2、T1、T3 處理烘烤周期為5、6、7 d；雪茄煙采收后在鋼結(jié)構(gòu)現(xiàn)代化晾房調(diào)制，T2-T1-T3 處理周期為22、25、30 d；曬煙在自然環(huán)境下，白天陽光下直曬與夜晚曬棚內(nèi)掛晾反復(fù)交替進(jìn)行，T2、T1、T3處理時間周期為15、19、25 d。具體工藝流程和技術(shù)操作分別按烤煙烘烤技術(shù)規(guī)程[25]和什邡當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)雪茄煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行統(tǒng)一管理，調(diào)制結(jié)束后，將煙葉葉片和主脈分開，磨碎，過孔徑0.25 mm篩子，待測。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 煙葉和主脈硝酸鹽和亞硝酸鹽含量 煙葉硝酸鹽含量采用濃H2SO4-水楊酸法測定[26]，煙葉亞硝酸鹽含量采用對氨基苯磺酸法測定[27]。

1.3.2 煙葉和主脈生物堿含量 準(zhǔn)確稱取200 mg煙末置于15 mL 試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL、10% NaOH 溶液1.5 mL 及甲基叔丁基醚（MTBE）3 mL，旋緊旋蓋，充分振蕩5 min 后，室溫放置過夜（24 h±2 h），取上層清液進(jìn)行GC（氣相色譜法）分析。每個樣品應(yīng)平行測定2次。其原理是在堿性條件下，利用甲基叔丁基醚等有機(jī)溶劑提取煙草或煙草制品中的生物堿類物質(zhì)，通過氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（GC-FID）定量分析檢測其中4 種生物堿含量。

1.3.3 煙葉和主脈TSNAs 含量 樣品均由上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠進(jìn)行測定。測定方法為在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（SPE-LC-MS/MS）[SPELC：Spark Holland，Symbiosis（Pico）；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500]。稱取1.0 g 煙樣，將其放入50 mL 錐形瓶中，加入40 μL 4 種氘代TSNAs（內(nèi)標(biāo)）溶液（5 000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L乙酸銨水溶液，在室溫下用振蕩器（200 r/min）萃取60 min，萃取液過0.45 μm 水相濾膜后使用LC-MS/MS 檢測TSNAs 含量。NNN、NNK、NAT 和NAB 含量之和即為TSNAs總量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 軟件制表繪圖，采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的單因素試驗統(tǒng)計分析進(jìn)行方差分析，顯著性檢驗用F檢驗法，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收方式對調(diào)制后煙葉葉片和主脈硝酸鹽含量的影響

如圖1所示，從烤煙結(jié)果可以看出，烤煙葉片中硝酸鹽含量以片脈分離采收最低，較摘葉采收降低35.29%，帶莖采收處理最高；主脈中硝酸鹽含量以摘葉采收處理最低，帶莖采收處理最高。從曬煙和雪茄煙結(jié)果可以看出，葉片和主脈硝酸鹽含量均高于烤煙，且二者葉片中硝酸鹽含量均以片脈分離采收最低，分別比摘葉采收低24.53%和34.25%；二者主脈中硝酸鹽含量均表現(xiàn)為摘葉采收＜片脈分離采收＜帶莖采收。

圖1 不同采收方式調(diào)制后煙葉硝酸鹽含量比較Fig.1 Comparison of nitrate content of tobacco leaves after modulation by different harvesting methods

2.2 不同采收方式對調(diào)制后煙葉葉片和主脈亞硝酸鹽含量的影響

如圖2所示，由烤煙結(jié)果可以看出，烤煙葉片中亞硝酸鹽含量以帶莖采收最高，其他2 個處理無顯著差異；烤煙主脈中亞硝酸鹽含量以片脈分離采收處理最低，較摘葉采收降低14.34%。由曬煙和雪茄煙結(jié)果可以看出，二者葉片和主脈中亞硝酸鹽含量均高于烤煙，且二者葉片中亞硝酸鹽含量均以片脈分離采收處理最低，分別比摘葉采收降低29.35%和40.44%；二者主脈中亞硝酸鹽含量均以摘葉采收處理最低，其他2個處理無顯著差異。

圖2 不同采收方式調(diào)制后煙葉亞硝酸鹽含量比較Fig.2 Comparison of nitrite content of tobacco leaves after modulation by different harvesting methods

2.3 不同采收方式對調(diào)制后煙葉葉片和主脈生物堿含量的影響

從表1 可以看出，3 個類型之間葉片煙堿含量差異不大，但是曬煙和雪茄煙葉片生物堿總量略高于烤煙，主要是曬煙和雪茄煙葉片的降煙堿含量高于烤煙。烤煙葉片生物堿總量以帶莖采收處理最高，比摘葉采收增加3.49%；曬煙和雪茄煙葉片生物堿總量以片脈分離采收處理最低，分別比摘葉采收低18.48%和12.12%，以帶莖采收處理最高。

表1 不同采收方式調(diào)制后煙葉葉片生物堿含量比較Tab.1 Comparison of alkaloid content of lamina after modulation by different harvesting methods %

由表2 可知，3 種類型煙葉主脈中生物堿含量差異不大?？緹熤髅}中生物堿總量以片脈分離采收處理最高，比摘葉采收增加26.25%，另外2 個處理無顯著差異；曬煙和雪茄煙主脈中生物堿總量以片脈分離采收處理最高，分別比摘葉采收增加69.62%和79.10%，以摘葉采收處理最低。

表2 不同采收方式調(diào)制后煙葉主脈生物堿含量比較Tab.2 Comparison of alkaloid content of stem after modulation by different harvesting methods %

2.4 不同采收方式對調(diào)制后煙葉葉片和主脈TSNAs含量的影響

從表3 可以看出，曬煙和雪茄煙葉片TSNAs 含量高于烤煙；烤煙、曬煙和雪茄煙3種類型煙葉葉片TSNAs 含量均以片脈分離采收處理最低，TSNAs 總量分別比摘葉采收降低26.65%、60.53%和48.48%，三者葉片TSNAs 總量均以帶莖采收處理最高，分別比摘葉采收增加7.87%、40.23%和72.12%。

表3 不同采收方式調(diào)制后煙葉葉片TSNAs含量比較Tab.3 Comparison of contents of TSNAs in lamina after modulation by different harvesting methods ng/g

從表4 可以看出，曬煙和雪茄煙主脈TSNAs 總量高于烤煙；烤煙主脈TSNAs 含量以片脈分離采收處理最低，帶莖采收處理最高，片脈分離采收處理的烤煙主脈TSNAs 含量比摘葉采收處理降低42.08%，而曬煙和雪茄煙主脈TSNAs 含量均以摘葉采收處理最低，帶莖采收處理最高，二者分別比摘葉采收增加25.59%和29.80%。

表4 不同采收方式調(diào)制后煙葉主脈TSNAs含量比較Tab.4 Comparison of contents of TSNAs in stem after modulation by different harvesting methods ng/g

3 結(jié)論與討論

生物堿、硝酸鹽、亞硝酸鹽皆是TSNAs 的前體物質(zhì)，不同類型煙葉TSNAs 及前體物含量有所差異。眾多研究表明[28-29]，雪茄煙中的TSNAs 及前體物硝酸鹽、亞硝酸鹽、生物堿含量均高于烤煙，這與本試驗研究結(jié)果相一致。不同類型煙葉葉片和主脈中TSNAs 含量測定結(jié)果表明，烤煙葉片TSNAs 含量高于主脈，而曬煙和雪茄煙葉片TSNAs 含量低于主脈，推測出現(xiàn)這一結(jié)果可能與不同類型煙葉所采用的調(diào)制方式有關(guān)，烤煙在烘烤過程中，相對較高溫度下微生物活性弱，變黃時間短，煙葉失水相對較快，不利于硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，主要是生物堿發(fā)揮作用發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成TSNAs，而葉片生物堿含量高于主脈，因此烤煙葉片中TSNAs 含量高于主脈；曬煙和雪茄煙采用曬制和晾制方式進(jìn)行調(diào)制，相對低溫條件有利于微生物活動，變黃時間長，葉片失水速度相對較慢，在微生物作用下，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，進(jìn)而促進(jìn)TSNAs 的生成，加上曬煙和雪茄煙主脈中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量均高于葉片，因此二者主脈中TSNAs含量高于葉片。

不同采收方式調(diào)制后煙葉葉片和主脈TSNAs含量有顯著差異，烤煙葉片和主脈中TSNAs 總量表現(xiàn)為帶莖采收＞摘葉采收＞片脈分離采收，猜測這與煙草中水分有關(guān)，調(diào)制過程中煙葉水分變化與細(xì)胞膜透性及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲密切相關(guān)[30]，在烘烤過程中，帶莖采收的煙株莖稈里的水分向葉片和主脈不斷運輸，烘烤時間延長，煙葉干燥速度慢，且莖稈中生物堿向主脈中轉(zhuǎn)運，繼而向葉片中轉(zhuǎn)運，因此葉片生物堿含量以帶莖采收處理最高，促進(jìn)了TSNAs的形成和積累。同理，片脈分離采收的煙葉干燥最快，烘烤及變黃時間最短，各前體物質(zhì)來不及轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化較少，葉片和主脈中TSNAs 形成較少。曬煙和雪茄煙葉片TSNAs 含量在采收方式間表現(xiàn)為片脈分離采收＜摘葉采收＜帶莖采收，這與楊煥文等[22]研究結(jié)果相一致，這可能是因為二者在調(diào)制過程中，帶莖采收處理的煙株調(diào)制時間更長，促進(jìn)大量TSNAs 的形成和積累，而片脈分離采收的葉片失水較快，變黃時間相對較短，TSNAs 的形成相對較少；主脈中TSNAs 含量在采收方式間表現(xiàn)為摘葉采收＜片脈分離采收＜帶莖采收，這可能是由于莖稈中硝酸鹽含量高于葉片和主脈，莖稈中的硝酸鹽隨著水分遷移向主脈運輸，因此主脈中TSNAs 含量以帶莖采收處理最高，而片脈分離采收處理的主脈中硝酸鹽無法向葉片運輸，摘葉采收處理主脈中硝酸鹽可向葉片轉(zhuǎn)運，加上主脈中硝酸鹽含量高于葉片，因此片脈分離采收主脈中TSNAs 含量高于摘葉采收。采用不同采收方式進(jìn)行研究有利于揭示煙葉TSNAs 的形成機(jī)制，但在實際應(yīng)用中，采收方式的確定還要綜合考慮其對煙葉質(zhì)量的影響。

近年來關(guān)于帶莖采收對烤煙產(chǎn)質(zhì)量的影響研究較多，前人認(rèn)為[31-34]，帶莖烘烤可以降低煙葉酶促褐變反應(yīng)，改善上部煙葉烤后品質(zhì)，提高經(jīng)濟(jì)效益等。本試驗中，相比于摘葉采收，雖然帶莖采收增加了烤煙TSNAs 含量，但增加比例小，為7.87%，遠(yuǎn)低于曬煙和雪茄煙TSNAs 的增加比例，曬煙和雪茄煙增加比例分別為40.23%和72.12%，推測是因為曬煙和雪茄煙的調(diào)制時間較烤煙長，帶莖采收后調(diào)制時間延長更久，硝酸鹽向亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化更加充分，因此曬煙和雪茄煙帶莖采收后TSNAs 含量增加較多。對于烤煙而言，帶莖烘烤處理的莖稈里儲存的水分具有緩沖作用，使烘烤時間相應(yīng)延長，TSNAs含量比摘葉采收處理稍有增加，但有利于大分子物質(zhì)的充分轉(zhuǎn)化和香氣物質(zhì)的形成[35]。片脈分離采收處理雖然可降低烤煙葉片TSNAs 及前體物含量，但是由于烘烤過程中葉片與主脈分離，主脈中的水分不能向葉片遷移，會因葉片失水過快[36]，導(dǎo)致內(nèi)含物質(zhì)轉(zhuǎn)化不充分，香氣質(zhì)差，香氣量少，刺激性和雜氣增加，煙葉品質(zhì)急劇下降[37]。因此，在實際生產(chǎn)中選擇采收方式應(yīng)綜合權(quán)衡其對煙葉質(zhì)量和安全性的影響。