李曼 余昌勇 秦鮮 王萍 萬新月

結(jié)直腸癌(CRC)是在世界范圍內(nèi)普遍存在的惡性腫瘤之一,雖然臨床診斷和綜合治療策略的進步延長了CRC患者的生存期,但伴有遠端轉(zhuǎn)移CRC患者的預(yù)后仍然較差。環(huán)狀RNA(circRNA)是具有共價閉合的連續(xù)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子,其具有內(nèi)源性miRNA海綿功能,并通過抑制miRNA活性、調(diào)節(jié)其靶基因表達參與調(diào)控癌細胞惡性表型,circRNA異常表達參與幾乎所有類型癌癥進展過程[1]。研究報道非小細胞肺癌組織中circ_0072083水平升高,敲低circ_0072083可提高順鉑對腫瘤細胞的促凋亡、增殖抑制和抗轉(zhuǎn)移作用[2]。然而,circ_0072083在CRC中的生物學(xué)功能未見報道。早期研究顯示CRC患者血漿、CRC組織中miR-142-3p表達下調(diào)[3],上調(diào)miR-142-3p通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯能夠抑制CRC細胞增殖和腫瘤形成[4]。靶基因預(yù)測顯示miR-142-3p是circ_0072083的潛在靶點,然而circ_0072083能否靶向miR-142-3p調(diào)控CRC進展仍需探討。本研究通過分析CRC組織中circ_0072083、miR-142-3p表達情況,探討circ_0072083靶向在CRC細胞增殖、轉(zhuǎn)移中的作用,旨在為臨床治療CRC提供有效靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年3月至2019年12月在武漢市江廈區(qū)第一人民醫(yī)院行手術(shù)切除52例CRC患者的CRC組織和配對的癌旁組織。其中男30例,女22例;年齡62～76歲。手術(shù)切除前均未接受放療或化療。樣本離體后立即置于液氮冷凍,然后在-80℃下保存。本實驗方案獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。所有參與者獲得書面知情同意。

1.2 細胞與試劑 CRC細胞LoVo購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心;Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司;si-circ_0072083、si-NC、miR-142-3p mimic、miR-NC、anti-miR-NC、miR-142-3p Inhibitor、circ_0072083野生型報告質(zhì)粒(WT-circ_0072083)、circ_0072083突變型報告質(zhì)粒(MUT-circ_0072083)購自廣州銳博生物公司;CCK-8檢測試劑盒、TaqMan multiplex qPCR master mix購自上海翌圣生物;高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI公司;Transwell室購自美國Millipore公司;兔源E-cadherin抗體(FNab02617)、兔源N-cadherin抗體(FNab05569)購自武漢菲恩生物公司;羊抗兔IgG(ab205718)和兔源GAPDH抗體(ab70699)購自美國abcam公司。

1.3 RT-qPCR檢測circ_0072083和miR-142-3p表達 用TRIzol試劑從臨床標本中分離總RNA,用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄,用TaqMan multiplex qPCR master mix進行RT-qPCR檢測circ_0072083和miR-142-3p表達。用2-ΔΔCt法檢測RNA表達倍數(shù)的變化。circRNA檢測以GAPDH為內(nèi)參,miRNA檢測以U6為內(nèi)參。circ_0072083上游引物5’-AAC CAC CAC AGA TTC ACT AT-3’,下游引物5’-AAC CAC CAC AGA TTC ACT AT-3’;GAPDH上游引物5’-ATA GCA CAG CCT GGA TAG CAA CGT AC-3’,下游引物5’-CAC CTT CTA CAA TGA GCT GCG TGT G-3’;miR-142-3p上游引物5’-GTC GTA TCC AGT GCA GGG-3’,下游引物5’-CGA CGT GTA GTG TTT CCT A-3’;U6上游引物’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’,下游引物5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。

1.4 細胞的培養(yǎng)與分組 LoVo細胞接種于RPMI-1640培養(yǎng)基(補充1%青霉素鏈霉素、10%胎牛血清),置于37℃,含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。細胞達80%匯合時1∶3的比例傳代。取2×104個對數(shù)期LoVo細胞接種于24孔板,在細胞50%匯合時,用Lipofectamine 2000試劑進行細胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染寡核苷酸序列不同LoVo細胞共分為si-circ_0072083組、si-NC組、miR-142-3p mimic組、miR-NC組、si-circ_0072083+anti-miR-NC組、si-circ_0072083+miR-142-3p Inhibitor組。轉(zhuǎn)染48 h收集細胞,RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染效果后進行后續(xù)實驗。

1.5 CCK-8和平板克隆實驗檢測細胞增殖 (1)CCK-8實驗:各組LoVo細胞以3 000個/孔接種96孔板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h后更換為含10 μl CCK-8和90 μl培養(yǎng)液,繼續(xù)孵育2 h,酶標儀測定450 nm處吸光度(A)。增殖抑制率(%)=(1-實驗A/對照A)×100%。(2)平板克隆實驗:不同組LoVo細胞置于培養(yǎng)箱以200個/孔接種6孔板培養(yǎng),每3天更換新鮮培養(yǎng)基,細胞培養(yǎng)約14 d至出現(xiàn)可見細胞菌落。棄去培養(yǎng)液,甲醇固定菌落后用結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計數(shù)>50個細胞的克隆數(shù)。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲 用無血清培養(yǎng)液重懸各組LoVo細胞,為檢測細胞遷移情況,將200 μl細胞懸液接種未包被基質(zhì)膠的上腔室;為檢測細胞侵襲情況,將200 μl細胞懸液接種預(yù)先涂有50 μl基質(zhì)膠的上腔室。將500 μl含10%胎牛血清培養(yǎng)液加入下腔室作為趨化因子。培養(yǎng)箱孵育24 h,將膜下表面遷移或侵襲的細胞固定,用1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機選擇3個視野進行計數(shù)取均值表示侵襲或遷移數(shù)。

1.7 Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達 收集各組LoVo細胞并用細胞裂解緩沖液裂解。測定蛋白濃度后,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離30 μg蛋白樣品,并濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂牛奶封閉膜1 h,然后4℃以下抗體中孵育過夜。E-cadherin抗體(1∶5 000稀釋)、N-cadherin抗體(1∶2 000稀釋)、內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 000稀釋)。二抗(1∶2 500稀釋)與膜在室溫下孵育2 h。采用增強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測蛋白表達。

1.8 雙熒光素酶報告實驗 將LoVo細胞接種24孔板,用WT-circ_0072083或MUT-circ_0072083分別和miR-142-3p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染。孵育48 h后,測定細胞相對熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 circ_0072083和miR-142-3p在結(jié)直腸癌中的表達 結(jié)直腸癌組織中circ_0072083表達水平高于癌旁組織,miR-142-3p表達水平低于癌旁組織。結(jié)直腸癌組織中circ_0072083和miR-142-3p表達水平呈負相關(guān)(r=-0.61)。見表1,圖1。

圖1 結(jié)直腸癌中circ_0072083和miR-142-3p的表達及相關(guān)性分析

表1 circ_0072083和miR-142-3p在結(jié)直腸癌中的表達

2.2 沉默circ_0072083對LoVo增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較,si-circ_0072083組LoVo細胞circ_0072083表達水平、克隆數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、N-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05),miR-142-3p表達水平、增殖抑制率、E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表2,圖2。

表2 沉默circ_0072083對LoVo增殖遷移侵襲的檢測

圖2 沉默circ_0072083對LoVo中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響

2.3 circ_0072083靶向調(diào)控miR-142-3p circular RNA interactome預(yù)測到circ_0072083和miR-142-3p存在結(jié)合位點。與miR-NC和WT-circ_0072083共轉(zhuǎn)染組比較,miR-142-3p mimic和WT-circ_0072083共轉(zhuǎn)染組LoVo細胞的相對熒光素酶活性顯著下降。見圖3,表3。

圖3 circ_0072083和miR-142-3p的互補序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4 miR-142-3p對LoVo增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較,miR-142-3p mimic組LoVo細胞miR-142-3p表達水平、增殖抑制率、E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05),細胞克隆數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、N-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖4,表4。

圖4 miR-142-3p對LoVo中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響

表4 miR-142-3p對LoVo增殖遷移侵襲的檢測

2.5 抑制miR-142-3p對沉默circ_0072083處理的LoVo增殖、遷移、侵襲的影響 與si-circ_0072083+anti-miR-NC組比較,si-circ_0072083+miR-142-3p Inhibitor組LoVo細胞miR-142-3p表達水平、增殖抑制率、E-cadherin蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),細胞克隆數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、N-cadherin蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5,圖5。

表5 抑制miR-142-3p對沉默circ_0072083處理的LoVo增殖遷移侵襲的檢測

圖5 抑制miR-142-3p對沉默circ_0072083處理的LoVo中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響3 討論

目前已鑒定出大量與CRC相關(guān)的circRNA,并確定其在CRC進展和(或)轉(zhuǎn)移中的作用。據(jù)報道,circ_001988表達下調(diào)與CRC神經(jīng)周圍侵襲和分化密切相關(guān)[5]。circLONP2在體外可增強CRC細胞的侵襲性,高表達的circLONP2預(yù)示CRC患者總生存率較差[6]。circFNDC3B在CRC組織中表達較低,其上調(diào)可抑制CRC的致瘤性、轉(zhuǎn)移性和血管生成特性[7]。以上表明失調(diào)的circRNA可能作為CRC的潛在生物標志物,調(diào)控circRNA水平可有助于抑制CRC細胞惡性行為。本研究檢測到CRC組織中circ_0072083表達增加,提示其表達失調(diào)可能參與CRC進展。轉(zhuǎn)染si-circ_0072083可抑制CRC細胞的克隆、侵襲和遷移能力,增加細胞增殖抑制率。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的先決步驟,其在CRC的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起關(guān)鍵作用[8]。本研究顯示沉默circ_0072083可上調(diào)上皮標志分子E-cadherin水平,N-cadherin水平下調(diào),表明沉默circ_0072083可提高抑制EMT阻礙CRC細胞遷移和侵襲。Wang等[9]報道沉默circ_0072083可抑制腎癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。此外,Ding等[10]證實敲低circ_0072083通過抑制細胞增殖、侵襲和異種移植腫瘤生長以及增加細胞凋亡來降低膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的耐藥性。以上研究表明circ_0072083在CRC中具有致癌功能,沉默circ_0072083可有效抑制CRC細胞惡性生物學(xué)行為。

circ_0072083通過與不同miRNA分子結(jié)合來調(diào)控癌癥進展。Wei等[11]證實circ_0072083可作為miR-1261的分子海綿促進甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)circ_0072083通過靶向下調(diào)miR-101-3p在非小細胞肺癌中起癌基因作用。CRC患者血清miR-142-3p水平明顯低于健康志愿者,低血清miR-142-3p水平與晚期癌癥顯著相關(guān)[13]。miR-142-3p通過靶向丙酮酸激酶M2(PKM2)調(diào)控有氧糖酵解進而抑制CRC細胞侵襲和遷移[14]。miR-142-3p還可作為circ_0087862、circPACRGL的靶向miRNA,并介導(dǎo)沉默circ_0087862和circPACRGL對CRC進展的抑制作用[15,16]。此外,多項研究表明miR-142-3p在肺腺癌[17]、乳腺癌[18]、葡萄膜黑色素瘤[19]中均具有抗腫瘤功能。本研究檢測到CRC組織中miR-142-3p表達降低,且與circ_0072083水平呈負相關(guān)關(guān)系。進一步研究發(fā)現(xiàn)circ_0072083對miR-142-3p表達還具有靶向負調(diào)控作用。過表達miR-142-3p可抑制CRC細胞的克隆、侵襲和遷移能力,增加細胞增殖抑制率,這與沉默circ_0072083在CRC中的抗癌作用一致,這提示miR-142-3p表達上調(diào)可能介導(dǎo)沉默circ_0072083的抗CRC作用。為證實上述猜想,本研究將anti-miR-142-3p、si-circ_0072083共轉(zhuǎn)染CRC細胞,檢測細胞惡性生物學(xué)行為顯示,抑制miR-142-3p表達顯著減弱沉默circ_0072083對CRC細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,進一步證實circ_0072083通過靶向miR-142-3p調(diào)控CRC細胞惡性生物學(xué)行為。

綜上所述,CRC組織中circ_0072083表達上調(diào),miR-142-3p表達下調(diào)。沉默circ_0072083通過上調(diào)miR-142-3p水平來抑制CRC細胞增殖、遷移和侵襲。因此,靶向抑制circ_0072083/miR-142-3p軸可能是抑制CRC進展的重要策略。