劉戈輝, 楊玉鳳, 劉佳夷, 姜志艷, 劉春城*

(1.內蒙古科技大學生命科學與技術學院, 包頭 014010; 2.內蒙古自治區(qū)功能基因組生物信息學重點實驗室, 包頭 014010)

骨骼肌是運動和新陳代謝相關的重要器官,其對于維持運動平衡、調節(jié)蛋白質代謝以及能量代謝意義重大。在劇烈運動、神經(jīng)異常等狀況下都可能出現(xiàn)骨骼肌的損傷,因此肌肉的損傷分為直接創(chuàng)傷(例如撕裂傷,拉傷和挫傷)和間接損傷(與局部缺血和神經(jīng)功能障礙有關)[1]。損傷的癥狀包括了腫脹、疼痛、肌肉緊張、痙攣、僵硬、硬結,甚至會出現(xiàn)皮下淤青;肌肉損傷時按壓疼痛明顯加重,肌肉活動、拉伸時則會出現(xiàn)疼痛加劇、受限等現(xiàn)象[2]。肌肉的反復損傷則會導致骨骼肌纖維化甚至形成瘢痕組織,嚴重影響骨骼肌的功能,對患者日后的運動能力與生活質量產(chǎn)生嚴重的負面影響[3]。

肌纖維(肌肉細胞)和衛(wèi)星細胞(肌肉干細胞)都存在于骨骼肌的微環(huán)境中,微環(huán)境對于肌纖維生長和衛(wèi)星細胞靜息態(tài)維持、激活以及分化具有重要的影響[4]。細胞外基質(extracellular matrix, ECM)是骨骼肌微環(huán)境的重要組成,其由蛋白質、多糖、RNA等組成[4-7]。細胞外基質相關蛋白質主要包括3種,即膠原蛋白、非膠原蛋白和蛋白多糖,其中膠原蛋白是骨骼肌細胞外基質最主要的組成部分;在小鼠骨骼肌中,至少有3種類型的細胞可以產(chǎn)生和分泌膠原蛋白,即成纖維細胞、纖維/脂肪前體細胞和衛(wèi)星細胞[8]。所以對于骨骼肌中細胞外基質相關基因表達變化的研究至關重要。

成肌細胞通過轉分化也可能是骨損傷修復的重要細胞來源,在這一個過程中,也與成肌細胞細胞外基質的表達密切相關。細胞外基質相關蛋白即是轉分化的調節(jié)因子,又是轉分化完成的標志基因[9]。

miRNA是一類長21～24個核苷酸的微小RNA分子,最早在線蟲中發(fā)現(xiàn),即 lin-4和let-7。這2種miRNA 通過部分序列互補結合到靶標基因mRNA的3′端非編碼區(qū),從而調控了線蟲的發(fā)育過程[10]。隨著研究的深入,miRNA在多種生理病理過程中的調節(jié)功能被不斷揭示,miRNA通過調節(jié)基因的表達,包括細胞增殖[11]、細胞分化[12]、程序性細胞凋亡[13]、代謝以及組織器官的形態(tài)建成[14],并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中miRNA同樣具有重要的調節(jié)作用[15]。 miRNA在肌肉發(fā)生、發(fā)育、萎縮、損傷修復等過程中的調控作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)[16]。

miR-18a屬于miR-17-92簇,該miRNA簇在人類中是由13號染色體的6個miRNA組成,這些miRNA被轉錄成單個多順反子單位[17]。miR-17-92簇的多個miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,其中miR-18a的表達改變不僅與細胞增殖、凋亡相關,也與上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、腫瘤侵襲和轉移相關[18]。而上皮-間充質轉化、腫瘤侵襲和轉移與細胞外基質相關蛋白的表達有關。鑒于細胞外基質相關蛋白對于骨骼肌的重要性,本文研究旨在關注miR-18a對于骨骼肌細胞外基質相關基因表達的影響及相應的miR-18a的生理病理功能。

已有研究表明多種miRNA參與調控細胞外基質相關基因的表達從而影響細胞的衰老、增殖、遷移、凋亡、炎癥和分化等過程的調控[19]。其中miR-29b的過表達可以減少人角膜內皮細胞ECM蛋白的產(chǎn)生[20]。miR-203在肝纖維化過程中可以抑制Col1a1、Col3a1等細胞外基質成分的合成和沉積[21]。miR-483的過表達通過Wnt通路調節(jié)髓核細胞增殖和細胞外基質重塑[22]。

目前關于miR-18a在骨骼肌中有關細胞外基質中相關基因表達影響的研究較少,本課題組前期對miR-18a在骨骼肌發(fā)育過程中的功能進行了研究,結果表明miR-18a對于成肌細胞的增殖[23]及骨骼肌萎縮[24]具有重要的調節(jié)作用。因此,關于miR-18a對于骨骼肌中細胞外基質的相關基因表達變化的研究至關重要,現(xiàn)對miR-18a在細胞外基質中的功能進行研究,為骨骼肌損傷為主要病癥的相關疾病的研究提供借鑒意義與理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實驗動物:SPF級的C57BL/6雄鼠購買自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號SCXK(京)2019-0010;小鼠購進后適應性喂養(yǎng)一周,然后將小鼠隨機分為5組,PBS注射3 d對照組,PBS注射10 d對照組,BaCl2注射3 d實驗組,BaCl2注射5 d實驗組,BaCl2注射10 d實驗組。注射量為100 μL,注射位置為脛骨前肌。

(2)細胞系:成肌細胞C2C12購買于中國科學院協(xié)和細胞庫。

(3)miRNA模擬物:miR-18a模擬物(銳博生物科技,中國)基于mmu-miR-18a-5p序列而設計。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘇木精-伊紅染色法(HE染色)

取經(jīng)PBS注射的對照組和BaCl2注射的實驗組小鼠肌肉組織浸泡在4%的多聚甲醛固定液中24 h后進行脫水、石蠟包埋、切片操作,然后按照碧云天HE染色步驟進行染色操作,將染好色的切片放到光學顯微鏡下觀察,采集圖像。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及處理

成肌細胞C2C12用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(Gibco,美國)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中,同時培養(yǎng)基中還添加了1%青霉素和鏈霉素(Gibco,美國)。當細胞匯合度達到約70%以上時,用胰蛋白酶消化、傳代。

轉染采用的是脂質體介導轉染法。轉染前24 h,把濃度為0.5×105/mL的成肌細胞C2C12均勻鋪至6孔板的相應孔中,每孔加入2 mL培養(yǎng)液。在轉染時細胞匯合度可達70%。根據(jù)Lipo6000TM(碧云天,中國)推薦劑量進行轉染。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)(碧云天,中國)可以刺激成肌細胞C2C12分化為成骨細胞系中的細胞,從而誘導成肌細胞向骨的轉分化[25]。

1.2.3 RNA提取和反轉錄

運用Trizol試劑(北京莊盟國際生物,中國)提取總RNA,通過A260/280比值檢測總RNA的純度以及濃度。根據(jù)吸光值將RNA濃度調整一致,利用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega,美國),參照說明書步驟將RNA反轉錄成cDNA;miRNA基于莖環(huán)法進行檢測[26],所用引物相關信息如表1所示;反轉錄產(chǎn)物放置于-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

使用Primer3.0(version 4.1.0)軟件設計相關引物,所用引物相關信息如表1所示。采用SYBR Green PCR Mix(北京莊盟國際生物,中國)試劑盒,在實時熒光定量儀上進行相對定量分析。詳細的步驟參照試劑盒說明書,以20 μL的體系進行檢測。GAPDH或U6作為內參基因,配制20 μL PCR反應體系,反應步驟:94 ℃ 3 min,(94 ℃ 15 s,60 ℃ 40 s,40個循環(huán))。應用2-ΔΔCT法計算Col1a1、Col4a1、Col4a2基因以及miR-18a的相對表達量。

表1 引物名稱和序列Table 1 Primer name and sequences

1.2.5 劃痕實驗

適宜匯合度的培養(yǎng)于6孔板中的成肌細胞C2C12在轉染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。通過塑料吸頭尖端穿過單層細胞制造劃痕,產(chǎn)生劃痕的時間即為0 h,持續(xù)監(jiān)測創(chuàng)面閉合時間至6 h。劃痕寬度由ImageJ軟件分析。

1.2.6 統(tǒng)計分析

使用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學分析。實驗結果均以平均值±標準誤(mean±SEM)來展示,并通過t-檢驗分析計算,p<0.05則具有統(tǒng)計學意義。*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

2 結果與分析

2.1 建立小鼠骨骼肌損傷修復模型

骨骼肌內BaCl2注射是常用的化學誘導骨骼肌損傷的方法,本研究基于在小鼠的脛骨前肌內注射BaCl2構建了骨骼肌損傷修復模型,并通過骨骼肌組織切片HE染色對模型進行了分析。結果如圖1所示,BaCl2注射3 d的實驗組炎性細胞聚集、部分肌纖維發(fā)生斷裂,新的肌纖維尚未形成;以上結果表明BaCl2注射后對骨骼肌造成了嚴重損傷。BaCl2注射5 d的實驗組中可見新形成的肌纖維直徑較小、細胞核居中,并且肌纖維間仍存在炎性細胞;以上結果表明BaCl2注射5 d后損傷的骨骼肌已經(jīng)開始修復。而BaCl2注射10 d的實驗組中,肌纖維直徑逐漸恢復正常水平,細胞核居中,炎性細胞明顯減少。對照組肌纖維排列整齊,形態(tài)結構完整,肌細胞位于肌細胞邊緣。結果表明成功建立了小鼠骨骼肌損傷修復模型。

圖1 肌肉組織HE染色結果分析Fig.1 Analysis of HE(hematoxylin-eosin) staining results of muscle tissue

2.2 骨骼肌損傷修復過程中,miR-18a及細胞外基質相關基因的表達變化

進一步利用RT-qPCR方法對小鼠的脛骨前肌內注射BaCl2構建的骨骼肌損傷修復模型及對照小鼠肌肉組織中miR-18a的表達進行了檢測。結果表明miR-18a的表達水平在肌肉受損后出現(xiàn)明顯上調;而隨著骨骼肌的修復進程,miR-18a的表達水平逐步下調,如圖2(a)所示。根據(jù)這一結果推測miR-18a可能參與了骨骼肌損傷修復的調控。

**表示p<0.01圖2 BaCl2誘導的骨骼肌損傷修復過程中細胞外基質相關基因的表達變化Fig.2 Expression of extracellular matrix related genes during BaCl2induced skeletal muscle injury

在骨骼肌損傷修復過程中,細胞外基質相關基因的表達量也會發(fā)生改變,同時本文研究通過RT-qPCR檢測了Col1a1、Col4a1以及Col4a2基因在這一過程中的表達變化。如圖2(b)～圖2(d)所示,以上被檢測的基因均在損傷后表達量升高,但在損傷修復的進程中的表達量的變化并不相同。其中Col1a1基因在損傷時變化的倍數(shù)較大,而修復過程中變化倍數(shù)迅速縮小;而Col4a1和Col4a2則在損傷3～10 d變化不顯著。

2.3 在成肌細胞C2C12中過表達miR-18a能夠影響細胞外基質相關基因的表達

在小鼠損傷模型中miR-18a與細胞外基質基因有相似的表達模式,那么在肌肉損傷過程中miR-18a是否調控細胞外基質相關基因的表達,本文研究在成肌細胞C2C12中對miR-18a的模擬物進行了轉染,利用RT-qPCR 檢測 miR-18a模擬物(miR-18a mimics)或對照(NC)轉染24 h后的成肌細胞C2C12中Col1a1、Col4a1以及Col4a2的表達變化。結果顯示與對照組相比,在轉染了miR-18a模擬物的成肌細胞中,細胞外基質相關基因Col1a1、Col4a1以及Col4a2表達顯著下調,如圖3所示。表明miR-18a在成肌細胞C2C12中抑制細胞外基質相關基因的表達。

*表示p<0.05;**表示p<0.01圖3 miR-18a抑制了成肌細胞C2C12中細胞外基質相關基因的表達Fig.3 miR-18a inhibited the expression of extracellular matrix related genes in myoblast C2C12

2.4 miR-18a對成肌細胞C2C12遷移的影響

細胞外基質與成肌細胞的遷移密切相關,因此本文研究利用劃痕實驗檢測了轉染miR-18a模擬物對于成肌細胞C2C12遷移的影響。結果表明,與轉染了NC的成肌細胞相比,轉染miR-18a模擬物后成肌細胞遷移的比例有變化,但并無生物統(tǒng)計學意義,如圖4(a)和圖4(b)所示。因此,miR-18a的過表達并不影響成肌細胞C2C12的遷移。

圖4 miR-18a過表達對成肌細胞C2C12遷移的影響Fig.4 Effect of miR-18a overexpression on migration of myoblasts C2C12

2.5 miR-18a對于成肌細胞C2C12向骨轉分化的影響

細胞外基質中相關膠原蛋白的表達與成肌細胞向骨的轉分化密切相關,因此本文研究檢測了miR-18a是否影響成肌細胞C2C12向骨的轉分化過程。如圖5(a)和圖5(b)所示,BMP-2誘導了成肌細胞中Runx2基因和Alpl基因表達量顯著升高,Runx2基因和Alpl基因是成肌細胞C2C12向骨轉分化的重要標志基因[25, 27]?；谝陨夏Ｐ?首先檢測了miR-18a轉染后未誘導的成肌細胞中Runx2基因和Alpl基因的表達量變化。實時熒光定量結果表明Runx2基因和Alpl基因雖然表達量沒有顯著下調,但均具有下調的趨勢[圖5(c)]。接下來本文研究檢測了miR-18a轉染后BMP-2誘導的成肌細胞中Runx2基因和Alpl基因的表達量變化。實時熒光定量檢測結果表明,miR-18a轉染后再利用BMP-2誘導轉分化,Runx2基因和Alpl基因雖然也有下調的趨勢[圖5(d)],但在NC與miR-18a轉染的細胞間仍不存在顯著的差異。以上結果說明miR-18a對于成肌細胞向骨的轉分化并無顯著影響。

*表示p<0.05;**表示p<0.01圖5 miR-18a對成肌細胞C2C12向骨轉分化的影響Fig.5 Effect of miR-18a on osteogenic transdifferentiation of myoblast C2C12

3 討論

MicroRNA在調控細胞外基質相關基因的表達上具有重要作用。本文研究發(fā)現(xiàn)miR-18a的過表達抑制了成肌細胞細胞外基質相關基因的表達,但劃痕實驗結果表明其過表達并未顯著影響成肌細胞的遷移。已有研究表明,miR-18a會抑制成肌細胞的增殖[23]。因此雖然miR-18a影響了成肌細胞的細胞外基質相關基因的表達,但在對于增殖以及其他因素的影響下,miR-18a的過表達并不會引起劃痕實驗中細胞的遷移率發(fā)生顯著改變。

MiRNA在細胞轉分化過程中具有重要調節(jié)作用。有研究表明miRNA-206與Runx1轉錄本結合影響Runx1的翻譯,可以抑制纖維成脂祖細胞的成脂分化[28]。其中在miR-18a在成肌細胞向脂肪轉分化過程中表達量也發(fā)生了改變。因此本研究基于miR-18a過表達對于成肌細胞細胞外基質蛋白具有調控作用,因此檢測了miR-18a過表達對于成肌細胞向成骨細胞轉分化的影響。但在成骨轉分化的實驗結果表明其過表達并未顯著影響成肌細胞向成骨細胞的轉分化[29]。

miR-18a被報道抑制了smad2[30]、PTEN[31]以及NOTCH2[32]等基因的表達,這些基因可以抑制骨的轉分化過程[33-35];同時也有研究表明miR-18a抑制了ERα[36]、sox6[37]等基因的表達,而這些基因則是骨或者軟骨發(fā)育所必需的[38-39]。本研究在成肌細胞中過表達miR-18a的研究結果表明,雖然miR-18a影響了成肌細胞的細胞外基質相關基因的表達,但miR-18a對于轉分化過程并無顯著的影響。

細胞外基質與骨骼肌干細胞也就是衛(wèi)星細胞的干性維持密切相關。前期的研究中發(fā)現(xiàn),在成肌細胞中,miR-18a可以抑制Fgf1的表達[23];在成纖維細胞中,miR-18a可以抑制Notch2的表達[40];以上基因又都與衛(wèi)星細胞的干性維持密切相關[41-42],這些結果都提示了miR-18a可能參與了衛(wèi)星細胞的干性維持與激活。所以以上研究內容將是miR-18a后續(xù)的重要的研究方向。

細胞外基質相關基因對于骨骼肌損傷修復具有重要的意義。細胞外基質不足以滿足骨骼肌重建,肌細胞和衛(wèi)星細胞都會受到影響[43],而細胞外基質相關基因的過量表達,則會導致骨骼肌的纖維化[44]。有研究表明,miR-214-5p下調通過靶向Col4a1促進成骨細胞細胞外基質的形成[45]。miR-30a可以通過下調Sox9的表達促進關節(jié)軟骨細胞外基質的降解[46]。miR-26a表達下調可能參與軟骨疾病中細胞外基質的改變[47]。因此miR-18a對于細胞外基質相關基因的研究,可以為骨骼肌損傷修復的治療提供理論依據(jù)。

4 結論

對于miR-18a的作用機制進行研究中發(fā)現(xiàn),miR-18a在小鼠骨骼肌損傷時表達量升高,該過程中細胞外基質相關基因的表達也是升高的。在成肌細胞C2C12中的研究發(fā)現(xiàn),miR-18a的過表達抑制了Col1a1、Col4a1以及Col4a2基因的表達。但在成肌細胞中對miR-18a的功能進行進一步挖掘時發(fā)現(xiàn),雖然miR-18a影響了細胞外基質相關基因的表達,但miR-18a并不影響成肌細胞的遷移與成肌細胞向骨的轉分化。由此可推測miR-18a在骨骼肌損傷的自我更新過程中有著非常重要的功能,但具體的作用機制及作用靶基因仍需進一步的研究。本文研究對miR-18a在細胞外基質中相關基因的研究,為骨骼肌損傷修復的治療機制進一步的研究提供了理論參考與借鑒意義。