王 濤，侯潤(rùn)博，潘 鑫

(錦州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療學(xué)院醫(yī)學(xué)系1，醫(yī)學(xué)技術(shù)系2，遼寧 錦州 121013)

Ⅰ型糖尿病作為一種慢性疾病主要是由胰島β細(xì)胞受損引起，胰腺或胰島移植可以徹底根治，但是由于供體缺乏以及免疫排斥大大限制該治療方案的臨床應(yīng)用[1，2]，干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞（insulinproducing cells，IPCs）再行移植，有望成為Ⅰ型糖尿病治療的新策略[3，4]。miRNA 作為一類小的非編碼RNA，其長(zhǎng)度大約在22 個(gè)核苷酸左右，能夠與靶mRNA 3’端非翻譯區(qū)互補(bǔ)，進(jìn)而降解或阻止該mRNA 翻譯出蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控[5，6]。生物信息學(xué)通過(guò)整合多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域信息和知識(shí)，能夠整體層面揭示疾病或生物過(guò)程的復(fù)雜分子機(jī)制[7]，而且其通過(guò)對(duì)已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，能夠減少重復(fù)實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的資源浪費(fèi)。GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)是生物信息學(xué)研究重要的中心資源之一，其存儲(chǔ)大量高通量數(shù)據(jù)，但是大部分?jǐn)?shù)據(jù)并未被充分利用[8]。目前，運(yùn)用生物信息學(xué)分析干細(xì)胞向IPCs 誘導(dǎo)分化過(guò)程中miRNA-mRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)報(bào)道較少見(jiàn)。因此，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析干細(xì)胞向IPCs 誘導(dǎo)分化過(guò)程中的mRNA 表達(dá)譜，并構(gòu)建miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過(guò)NCBI 的GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESCs）向IPCs 誘導(dǎo)分化過(guò)程中mRNA 表達(dá)譜的相關(guān)數(shù)據(jù)，最終只有GSE42094 數(shù)據(jù)集符合要求，該數(shù)據(jù)集基于GPL10558 平臺(tái)，包含23 個(gè)樣本數(shù)據(jù)（GSM1032319-41），涉及未分化hESCs（WA09）、IPCs 分化的5 個(gè)時(shí)期、胰腺內(nèi)胰島和胎胰。

1.2 數(shù)據(jù)處理與差異表達(dá)分析 選擇GSE42094 數(shù)據(jù)集內(nèi)的未分化hESCs 和IPCs 分化的5 個(gè)時(shí)期進(jìn)行研究，進(jìn)入“Analyze with GEO2R”項(xiàng)目，點(diǎn)擊“Define groups”設(shè)定分組，其中，hESCs 組包含3 個(gè)樣本，Diff1 組3 個(gè)，Diff2 組3 個(gè)，Diff3 組2 個(gè)，Diff4 組2個(gè)，IPCs 組3 個(gè)，對(duì)6 組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為adj.P＜0.05。

1.3 GO 功能和KEGG 路徑顯著性分析 為分析差異表達(dá)基因的潛在生物學(xué)功能，選用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能富集分析，主要分析GO 功能以及KEGG 路徑2 個(gè)方面，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 為分析差異表達(dá)基因的相互作用及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，選用STRING（https://stringdb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI 分析，選擇Homo sapiens 作為“Organism”的條件，其余參數(shù)均為系統(tǒng)默認(rèn)設(shè)置。

1.5 miRNA 預(yù)測(cè) 針對(duì)差異表達(dá)基因預(yù)測(cè)其靶miRNA，選用miRTarBase（https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇reporter assay、western blot、qPCR 和microarray 四種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miRNA-mRNA 靶向匹配作為預(yù)測(cè)miRNA 的入選標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)用Cytoscape 9.1.0 軟件對(duì)miRNA-mRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.6 預(yù)測(cè)miRNA 的驗(yàn)證 將預(yù)測(cè)的miRNA 與PMID:20 735 361[9]的Table S4 數(shù)據(jù)取交集進(jìn)行驗(yàn)證，該研究主要分析miRNA 在人胚胎T3 干細(xì)胞向胰腺胰島樣細(xì)胞團(tuán)分化過(guò)程中的表達(dá)，其Table S4 結(jié)果顯示出胚胎T3 干細(xì)胞（hES-T3 cells grown on mouse embryonic fibroblast feeder，T3ES）、胚胎內(nèi)胚層（embryoid bodies differentiated from T3 cells，T3EB）和胰腺胰島樣細(xì)胞團(tuán)（pancreatic islet-like cell clusters derived from T3 cells，T3pi）三組標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA 表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因 通過(guò)對(duì)GSE42094 的6 組樣本數(shù)據(jù)分析，差異表達(dá)基因的前250 個(gè)被顯示，除去沒(méi)有名稱和重復(fù)的基因，共得到188 個(gè)。進(jìn)一步對(duì)hESCs和IPCs 兩組數(shù)據(jù)分析得到差異表達(dá)基因，并與上述188 個(gè)基因取交集后，選取誘導(dǎo)后上調(diào)和下調(diào)的各前10 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行后續(xù)研究，見(jiàn)表1。該20個(gè)基因代表整個(gè)hESCs 向IPCs 誘導(dǎo)過(guò)程中表達(dá)量差異最具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因。

表1 誘導(dǎo)后上調(diào)和下調(diào)的前10 個(gè)差異表達(dá)基因

2.2 GO 功能和KEGG 路徑顯著性分析 通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)后上調(diào)和下調(diào)的各前10 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能和KEGG 路徑顯著性分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因在“外泌體”和“胞外”比較集中，主要涉及“谷胱甘肽代謝”和“PPAR 信號(hào)通路”，而下調(diào)基因在“基因表達(dá)調(diào)控”“內(nèi)胚層的決定”以及“成體干細(xì)胞種群維持”比較集中。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 通過(guò)PPI 分析發(fā)現(xiàn)10 個(gè)上調(diào)基因中有6 個(gè)基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有相互作用，有2 個(gè)基因顯示二者間直接作用（GSTA1 和GSTA2），剩余兩個(gè)沒(méi)有關(guān)聯(lián)（圖1A）。而下調(diào)的10 個(gè)基因中LOC729860 和UCA1 在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有收錄，其余8 個(gè)基因中有5 個(gè)表達(dá)的蛋白質(zhì)具有相互作用，剩余3 個(gè)沒(méi)有關(guān)聯(lián)（圖1B）。將上調(diào)和下調(diào)的基因進(jìn)行融合分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因KLKB1 能夠與上調(diào)基因FGG 直接進(jìn)行蛋白相互作用，且上調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)通過(guò)VTN 與下調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)的POU5F1 直接作用，將兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)聯(lián)（圖1C）。

圖1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

2.4 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)miRTarBase 數(shù)據(jù)庫(kù)查找靶向作用于差異表達(dá)基因的miRNA，選擇reporter assay、western blot、qPCR 和microarray 4 種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miRNA-mRNA 靶向匹配作為預(yù)測(cè)miRNA 的入選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā) 現(xiàn) CDH17、APOA2、FAM162B、GSTA2、LOC729860、UTF1、KLKB1 等7個(gè)基因沒(méi)有對(duì)應(yīng)miRNA 調(diào)控，而APOA1、TTR、PPP1R16B、RPL36A 4 個(gè)基因雖有相應(yīng)miRNA 調(diào)控，但不滿足設(shè)定的入選標(biāo)準(zhǔn)，因此，該11 個(gè)基因在應(yīng)用Cytoscape 9.1.0 軟件進(jìn)行miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化過(guò)程中，未有miRNA 呈現(xiàn)，其余9 個(gè)基因共對(duì)應(yīng)23 個(gè)預(yù)測(cè)的miRNA。其中，DNMT3B 基因顯示有10 個(gè)miRNA 調(diào)控其表達(dá)，NANOG 基因有9個(gè)，而SPINK1 和UCA1 基因僅各有1 個(gè)miRNA調(diào)控其表達(dá)，且該2 個(gè)基因與miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-335-5p能夠調(diào)控VTN、NANOG、POU5F1 和DNMT3B 4 個(gè)基因的表達(dá)（圖2），其中VTN 為上調(diào)基因（圖3A），NANOG、POU5F1 和DNMT3B 為下調(diào)基因（圖3B～圖3D）。

圖2 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖3 GEO2R 所示基因的表達(dá)量

2.5 預(yù)測(cè)miRNA 的驗(yàn)證 將預(yù)測(cè)的miRNA 與PMID:20 735 361 的Table S4 數(shù)據(jù)取交集，得到21 個(gè)驗(yàn)證的miRNA，剩余2 個(gè)預(yù)測(cè)的miRNA（miR-200b-3p和miR-144-3p）未被驗(yàn)證，可見(jiàn)絕大部分預(yù)測(cè)的miRNA 得到驗(yàn)證，亦即存在于干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的過(guò)程中（表2），同時(shí)表明基于4 種實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)miRNA 的方法具備一定的可信度。表2 顯示miR-302a-3p、miR-34a-5p、miR-34c-5p、miR-29b-3p、miR-375 和miR-29a-3p 表達(dá)量誘導(dǎo)分化后顯著降低，而miR-134-5p、miR-335-5p 和miR-26a-5p 表達(dá)量隨著誘導(dǎo)分化進(jìn)程逐漸升高，其中miR-335-5p表達(dá)量的逐漸升高與NANOG、POU5F1 和DNMT3B表達(dá)量的逐漸降低（圖3B～圖3D）形成對(duì)照，提示二者之間存在靶向關(guān)系且為負(fù)性調(diào)控。結(jié)合圖2 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因與下調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)通過(guò)多個(gè)miRNA 相關(guān)聯(lián)，其中上調(diào)基因VTN 通過(guò)miR-26b-5p和miR-335-5p 與下調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)多個(gè)基因關(guān)聯(lián)，并且VTN 通過(guò)miR-26b-5p 與GSTA1 和GSTA2 的二者間直接作用相關(guān)聯(lián)。上調(diào)基因FGG 通過(guò)miR-29家族（miR-29a-3p、29b-3p、29c-3p）與下調(diào)基因DNMT3B 相關(guān)聯(lián)，提示miRNA 通過(guò)靶向不同表達(dá)類型的基因進(jìn)而調(diào)控干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化進(jìn)程。

表2 PMID:20 735 361 數(shù)據(jù)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的miRNA

表2 （續(xù)）

2.6 miR-335-5p 的結(jié)構(gòu)和功能信息 運(yùn)用miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.mirbase.org/）檢索miR-335-5p的結(jié)構(gòu)信息，其前體hsa-mir-335 的序列及其莖環(huán)結(jié)構(gòu)如圖4A 所示，標(biāo)紅部分為成熟miR-335-5p 的序列（16-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-38）。進(jìn)一步檢索發(fā)現(xiàn)前體hsa-mir-335 在169 篇文獻(xiàn)中被提及，共涉及864 個(gè)詞句，其詞匯云如圖4B 所示，可見(jiàn)其在癌癥和腫瘤方向研究最廣泛，其次就是誘導(dǎo)和分化等方向，與本研究的方向相符。

圖4 miR-335-5p 的結(jié)構(gòu)和功能信息

3 討論

本研究為分析hESCs 向IPCs 誘導(dǎo)分化過(guò)程中的mRNA 表達(dá)譜，采用生物信息學(xué)方法篩選GEO數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的數(shù)據(jù)集得到GSE42094，該數(shù)據(jù)集包含未分化hESCs、IPCs 分化的5 個(gè)時(shí)期、胰腺內(nèi)胰島和胎胰等樣本數(shù)據(jù)。本研究選擇與研究目的直接相關(guān)的未分化hESCs 和IPCs 分化的5 個(gè)時(shí)期來(lái)研究，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)自帶軟件GEO2R 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出差異表達(dá)的mRNA 共188 個(gè)，分別選取誘導(dǎo)后上調(diào)和下調(diào)的各前10 個(gè)差異表達(dá)基因作為后續(xù)研究。

通過(guò)GO 功能和KEGG 路徑顯著性分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因多涉及基因表達(dá)調(diào)控以及多能干細(xì)胞調(diào)控信號(hào)通路等與干細(xì)胞誘導(dǎo)分化機(jī)制相關(guān)的內(nèi)容，而上調(diào)基因涉及內(nèi)容則比較寬泛。進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因的相互作用，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與下調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)通過(guò)上調(diào)基因VTN 和下調(diào)基因POU5F1 的直接作用而相關(guān)聯(lián)，提示VTN 和POU5F1 基因可能為該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心基因。玻連蛋白（Vitronectin，VTN）是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，屬于整合素家族成員之一，其在傷口愈合和凝血過(guò)程中起著重要作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其參與多種生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞粘附和遷移[10-12]，也能夠通過(guò)JNK 和ERK 信號(hào)通路誘導(dǎo)INS-1 細(xì)胞的增殖[13]。本研究發(fā)現(xiàn)玻連蛋白在Diff3 組表達(dá)量開(kāi)始升高，在IPCs 組達(dá)到峰值，表明其參與干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過(guò)程。POU5F1 又稱OCT4，是一種維持干細(xì)胞多能性的轉(zhuǎn)錄因子[14，15]，其與NANOG 在胚胎早期發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，并可作為胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物以及干性維持[16，17]。本研究發(fā)現(xiàn)hESCs 組POU5F1 表達(dá)量最高，隨著誘導(dǎo)進(jìn)程逐漸下降，在Diff3 組表達(dá)量就已經(jīng)處于較低水平。

構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)miR-335-5p能夠調(diào)控VTN、NANOG、POU5F1 和DNMT3B 基因的表達(dá)，其中VTN 為上調(diào)基因，NANOG、POU5F1 和DNMT3B 為下調(diào)基因。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病模型GK 大鼠的胰島內(nèi)miR-335-5p 表達(dá)量顯著增高，其能夠直接靶向抑制Stxbp1 mRNA 的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-335-5p 在INS-1 832/13 細(xì)胞內(nèi)的過(guò)表達(dá)能夠抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌[18]。Tang XW 等[19]發(fā)現(xiàn)在妊娠期糖尿病小鼠中過(guò)表達(dá)miR-335-5p 能夠抑制VASH1 的表達(dá)進(jìn)而降低胰島素釋放的水平，并通過(guò)激活TGF-β 信號(hào)通路誘發(fā)胰島素抵抗。最近，Li G 等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-335-5p 能夠下調(diào)SLC2A4 基因表達(dá)進(jìn)而抑制胰腺細(xì)胞的生長(zhǎng)，與二型糖尿病的進(jìn)展密切相關(guān)。但是，miR-335-5p是否參與干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為IPCs 未見(jiàn)報(bào)道。

通過(guò)將預(yù)測(cè)的miRNA 與文獻(xiàn)PMID:20 735 361數(shù)據(jù)取交集，得到18 個(gè)驗(yàn)證的miRNA，miR-335-5p包含其中，結(jié)果顯示miR-335-5p 在內(nèi)胚層階段（T3EB）其表達(dá)量升高2 倍多，至胰腺胰島樣細(xì)胞團(tuán)階段（T3pi）升高接近5 倍，可見(jiàn)其在整個(gè)干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化過(guò)程中均有表達(dá)，且隨著誘導(dǎo)分化進(jìn)程逐漸升高，表明miR-335-5p 不但參與糖尿病的發(fā)生進(jìn)展，而且參與干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為IPCs 的整個(gè)過(guò)程。

綜上所述，本研究共篩選得到差異表達(dá)的基因188 個(gè)，分別選取誘導(dǎo)后上調(diào)和下調(diào)的各前10 個(gè)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)通過(guò)VTN 與下調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)的POU5F1 直接作用，將兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)聯(lián)。miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)miR-335-5p 能夠調(diào)控VTN、NANOG、POU5F1 和DNMT3B 4 個(gè)基因的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-335-5p 表達(dá)量隨著誘導(dǎo)分化進(jìn)程逐漸升高，與NANOG、POU5F1 和DNMT3B 表達(dá)量逐漸降低形成對(duì)照，提示二者之間存在靶向關(guān)系且為負(fù)性調(diào)控。因此，該miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示miR-335-5p 靶向多個(gè)基因參與hESCs 向IPCs 誘導(dǎo)分化過(guò)程。