朱洪慧，李映姿，高遠(yuǎn)卓，林泓，王成洋，晏紫儀，彭瀚平，李田野，熊茂，李云峰

水稻短寬?；虻膱D位克隆

朱洪慧，李映姿，高遠(yuǎn)卓，林泓，王成洋，晏紫儀，彭瀚平，李田野，熊茂，李云峰

西南大學(xué)水稻研究所/西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/轉(zhuǎn)基因植物與安全控制重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716

【】水稻產(chǎn)量由單位面積有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重3個(gè)因素構(gòu)成，其中，粒重主要由水稻的籽粒形態(tài)決定。篩選和鑒定新的粒型突變材料和基因，可為產(chǎn)量性狀的分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)?！尽吭诙i稻保持系西大1B（XD1B）的甲基磺酸乙酯（EMS）誘變?nèi)后w中鑒定到一個(gè)短寬粒突變體（）；分析籽粒形態(tài)和其他農(nóng)藝性狀，并對穎殼進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)觀察分析；運(yùn)用BSA法進(jìn)行基因定位；通過遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)確定候選基因；采用qRT-PCR分析該基因的表達(dá)模式及其他粒型相關(guān)基因和細(xì)胞發(fā)育基因的表達(dá)水平?！尽哭r(nóng)藝性狀分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體粒長顯著降低，粒寬顯著增加，表現(xiàn)出短寬粒的表型；進(jìn)一步組織和細(xì)胞學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)突變體穎殼縱向細(xì)胞變短是粒長變短的主要原因，而粒寬增加是由于穎殼橫向細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞大小同時(shí)增加。遺傳分析結(jié)果表明，該突變性狀受隱性單基因控制，通過圖位克隆與遺傳互補(bǔ)驗(yàn)證，確定候選基因?yàn)?，編碼一個(gè)植物特異轉(zhuǎn)錄因子。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)無明顯的組織特異性，在莖、葉、幼穗中表達(dá)強(qiáng)烈。通過對已知粒型相關(guān)基因、細(xì)胞周期和細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)通過正向調(diào)控穎殼橫向細(xì)胞數(shù)目和（或）細(xì)胞大小決定粒寬的和在突變體中上調(diào)明顯，而正向調(diào)控縱向細(xì)胞數(shù)目和大小并負(fù)向調(diào)控橫向細(xì)胞數(shù)目和大小的/在突變體明顯下調(diào)；另外，部分與細(xì)胞周期和細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)的基因也在突變體和野生型之間的表達(dá)也呈現(xiàn)顯著差異?！尽烤幋a一個(gè)植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控粒型基因（、和/等）影響穎殼的細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)展，從而決定水稻籽粒長度和寬度。

水稻；籽粒形態(tài)；穎殼發(fā)育；圖位克隆

0 引言

【研究意義】水稻（L.）是重要的糧食作物，全球有一半的人口食用水稻，目前，中國水稻產(chǎn)量在全球排名第一。水稻產(chǎn)量由單位面積有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重3個(gè)因素共同決定，其中，粒重主要受籽粒形態(tài)的影響。水稻成熟籽粒最外層由一層堅(jiān)硬的穎殼（內(nèi)稃和外稃）包裹；在雙受精前后，胚乳和胚開始發(fā)育之前，穎殼的細(xì)胞增殖和擴(kuò)展已經(jīng)完成，其大小形態(tài)已經(jīng)確定；其后隨著內(nèi)部胚乳和胚等組織器官的發(fā)育，穎殼進(jìn)一步硅化、脫水、成熟，但其大小形態(tài)不會再發(fā)生變化；換言之，雖然主要營養(yǎng)物質(zhì)胚乳是受精后才開始發(fā)育，但是，籽粒形態(tài)在很大程度上是由受精前穎殼的發(fā)育所決定?；诜f殼的重要性，水稻穎殼發(fā)育的遺傳機(jī)制研究對于改善粒型、提升產(chǎn)量具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】近年來，人們鑒定了許多與水稻粒型發(fā)育相關(guān)的基因，它們大多是通過影響穎殼細(xì)胞數(shù)目（細(xì)胞增殖）和（或）細(xì)胞大?。?xì)胞擴(kuò)展）來起作用[1-2]；按照調(diào)控途徑可以分為G蛋白信號、泛素蛋白酶體、MAPK信號通路、激素（BR、IAA和CK）信號和其他途徑；而按照基因具體功能，即對穎殼細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)展的具體作用，也可以將目前已克隆的與穎殼發(fā)育相關(guān)粒型基因分為三類：第一類，、、/、/、、/等只影響穎殼細(xì)胞增殖的基因。其中，編碼異三聚體G蛋白中非典型的Gγ亞基，屬于G蛋白途徑，負(fù)向調(diào)控細(xì)胞增殖[3-5]。和/都屬于泛素蛋白酶體途徑，編碼一個(gè)環(huán)型E3泛素連接酶，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂，突變后增加了穎殼細(xì)胞的數(shù)目，最終粒寬和粒重增加[6-7]。/編碼一個(gè)泛素特異性蛋白酶，具有去泛素化活性，通過調(diào)控穎殼橫向細(xì)胞增殖來正向調(diào)控水稻籽粒寬度[8]。/編碼一個(gè)鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，是BR激素信號傳導(dǎo)的正調(diào)控因子，通過影響穎殼的細(xì)胞數(shù)目來控制籽粒寬度和粒型[9-10]。同時(shí)，BR途徑的/編碼一個(gè)帶有Kelch重復(fù)域的蛋白磷酸酶OsPPKL1，通過去磷酸化抑制BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期蛋白Cyclin-T1;3活性，從而減少細(xì)胞分裂，抑制籽粒伸長[11-12]。屬于其他途徑，編碼一個(gè)植物特有的PLATZ轉(zhuǎn)錄因子，通過籽粒的細(xì)胞增殖，正向調(diào)控籽粒長度[13]。第二類，、、、、和等只影響細(xì)胞擴(kuò)展的基因。其中，屬于泛素蛋白酶體途徑的編碼一個(gè)具有去泛素化酶活性的蛋白酶，通過影響穎殼細(xì)胞擴(kuò)展來控制水稻籽粒的大小和形狀；功能缺失后粒寬和粒厚增加，粒長變短[14]，、和都與BR激素途徑相關(guān)，其中，、編碼細(xì)胞色素P450家族蛋白，是BR生物合成過程中的關(guān)鍵酶，通過調(diào)控細(xì)胞擴(kuò)展影響穎殼的發(fā)育，正向調(diào)控籽粒大小，它們的多個(gè)功能缺失突變體都表現(xiàn)小粒，而過表達(dá)則增加籽粒長寬[15-18]，卵形家族蛋白OFP3是BR合成和信號傳導(dǎo)的抑制因子，負(fù)調(diào)控細(xì)胞伸長，過表達(dá)會導(dǎo)致籽粒變小[19]，和都參與生長素途徑，轉(zhuǎn)錄因子OsARF6受生長素信號調(diào)控，能直接與生長素輸入載體OsAUX3啟動(dòng)子結(jié)合，正調(diào)控表達(dá)，通過改變穎殼細(xì)胞生長素的含量和分布、影響穎殼細(xì)胞的縱向伸長，進(jìn)而負(fù)調(diào)控粒長和粒重[20]。第三類，、、/、、、/、/OsSPL16、SRS1/DEP2等基因可以同時(shí)影響穎殼細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)展。其中，、、/與BR信號途徑相關(guān)。編碼一個(gè)絲氨酸羧肽酶，可以加強(qiáng)BR信號傳導(dǎo)，通過促進(jìn)水稻穎殼細(xì)胞分裂和擴(kuò)展正向調(diào)控籽粒寬度[21]。GS9轉(zhuǎn)錄活性受BR途徑OsGSK2蛋白的正調(diào)控，功能缺失突變體穎殼的縱向細(xì)胞長度增大而橫向細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致籽粒細(xì)長[22]；模塊同時(shí)受BR信號途徑OsGSK2和下游轉(zhuǎn)錄因子OsBZR1的調(diào)控，/與通過互作促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨大，正向調(diào)控籽粒大小[23-26]。編碼一個(gè)膜定位蛋白，參與調(diào)節(jié)生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)，是生長素響應(yīng)和轉(zhuǎn)運(yùn)的正調(diào)控因子，通過增加穎殼細(xì)胞增殖與擴(kuò)展，正向調(diào)控籽粒大小[27]；編碼細(xì)胞數(shù)目調(diào)控因子OsCNR1，與調(diào)控細(xì)胞周期的KRP1蛋白互作，影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞生長，負(fù)向調(diào)控水稻粒寬和粒重[28]。GL7/GW7編碼一個(gè)TONNEAU1募集基序蛋白，表達(dá)量上調(diào)能增加穎殼細(xì)胞的縱向細(xì)胞分裂并減少橫向細(xì)胞分裂。GW8編碼一個(gè)包含SBP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子OsSPL16，高表達(dá)時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞分裂和灌漿從而促進(jìn)水稻粒寬增加和增產(chǎn)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)/OsSPL16直接與/GW7啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其表達(dá)，從而增加橫向細(xì)胞分裂，正向調(diào)控水稻粒寬[29-30]。編碼一個(gè)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，功能缺失突變體穎殼的縱向細(xì)胞變大且細(xì)胞數(shù)目增多，橫向細(xì)胞變寬，導(dǎo)致產(chǎn)生小圓粒表型[31-34]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過穎殼發(fā)育影響水稻籽粒形態(tài)的基因數(shù)量龐大，它們位于多個(gè)調(diào)控途徑并且通過幾種不同的調(diào)控方式影響了穎殼發(fā)育過程中的細(xì)胞生長，進(jìn)而決定最終籽粒的形態(tài)建成。然而，多數(shù)基因在籽粒長度和寬度上的影響是一致的，或僅僅調(diào)控其中一方面。目前，在籽粒形態(tài)的縱向和橫向方面進(jìn)行相反的調(diào)控基因仍較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)水稻短寬粒突變體，命名為（），通過對突變體進(jìn)行詳細(xì)的表型分析，明確的生物學(xué)功能；通過圖位克隆和表達(dá)模式分析等，確定的基本信息，同時(shí)了解其調(diào)控籽粒形態(tài)發(fā)育的機(jī)制，為利用該基因進(jìn)行水稻籽粒形態(tài)

分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻突變體來源于秈稻保持系西大1B（XD1B）的EMS誘變?nèi)后w，經(jīng)過多代自交進(jìn)行分離純化后，突變性狀穩(wěn)定遺傳。選用正常不育系材料56S作母本，突變體作父本，兩者雜交后收獲F1種子，同年，在海南種植F1并收獲種子。第二年種植獲得F2群體，將F1、F2群體用于遺傳分析和定位。

1.2 形態(tài)與組織學(xué)分析

挑取野生型和突變體成熟期的籽粒，用掃描電鏡和體視鏡觀察表型并拍照。從和野生型處于抽穗期的花序中，選取開花前的小穗，置于酒精醋酸福爾馬林混合固定液（FAA，50%無水乙醇、0.9 mol·L-1的冰乙酸和3.7%甲醛）中浸泡48 h以上，固定材料的細(xì)胞形態(tài)；然后，依次用乙醇進(jìn)行梯度脫水、二甲苯透明和浸蠟處理。石蠟包埋，切出10 μm厚的蠟帶。經(jīng)預(yù)檢查、分段后轉(zhuǎn)移到涂抹多聚賴氨酸的載玻片上，經(jīng)過展片、烘片后，進(jìn)行番紅染色，并用中性樹脂封片。用光學(xué)顯微鏡NikonE600觀察制作好的石蠟切片。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

于2022年夏季水稻抽穗期與成熟期，隨機(jī)選取10株野生型和10株突變體，統(tǒng)計(jì)穗長、一次枝梗、二次枝梗、穗粒數(shù)、粒長、粒寬和粒重等農(nóng)藝性狀。隨機(jī)選取野生型和突變體抽穗期10個(gè)小穗進(jìn)行石蠟切片觀察，每張切片統(tǒng)計(jì)小穗穎殼橫向細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞面積。隨機(jī)選取野生型和突變體成熟期的10個(gè)籽粒進(jìn)行掃描電鏡觀察，統(tǒng)計(jì)穎殼縱向細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞長度。差異顯著性均采用測驗(yàn)。

1.4 分子標(biāo)記定位及連鎖圖譜的構(gòu)建

在56S/雜交構(gòu)建的F2群體中選取突變單株作為定位群體，使用BSA法進(jìn)行目標(biāo)基因的定位。根據(jù)F2植株表型，分別選取10株正常單株和10株突變單株，剪取等量葉片，構(gòu)建正?；虺睾屯蛔兓虺?。用CTAB法提取親本、基因池和定位群體單株的DNA。定位引物選用SSR引物（表1），由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為2.0 μL 10×PCR buffer、0.4 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、10.3 μL ddH2O、10 μmol·L-1前后引物各0.5 μL、1.0 μL模板DNA、0.3 μL 5 U·μL-1Taq酶。PCR程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯凝膠電泳后觀察。將只呈現(xiàn)56S帶型的單株記為A，只呈現(xiàn)帶型的單株記為B，同時(shí)呈現(xiàn)雙親帶型的單株記為H，用重組子個(gè)數(shù)進(jìn)行作圖，根據(jù)Gramene網(wǎng)站（http://www. gramene.org/）的水稻基因組信息構(gòu)建物理圖譜。

1.5 候選基因的克隆分析

從Gramene網(wǎng)站（http://www.gramene.org/）查詢并下載注釋基因的序列，設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)擴(kuò)增引物（F：5′-CAATAACTGCCACGGCAGCAAAC-3′和R：5′-CCAAGCAGCTCATCTTCCAGTCT-3′）。分別以野生型和突變體DNA為模板擴(kuò)增目標(biāo)序列，由測序公司進(jìn)行測序分析。用Vector NTI 10.5軟件中Align功能或Assemble功能查看并比對野生型和突變體之間序列找出突變基因及突變位點(diǎn)。使用Chromas2軟件查看測序峰圖。

1.6 遺傳互補(bǔ)驗(yàn)證

設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（-com-F1：5′-ATGACATGA TTACGAATTCATGCAGGGTAGATGAGTCTGATTA -3′和-com-R1：5′-GCTTGATCTCTTTTGGTTA TGTGGGTCAGTGCTGTTAAGAGCCC-3′；-com- F2：5′-GGGCTCTTAACAGCACTGACCCACATAAC CAAAAGAGATCAAGC-3′和-com-R1：5′- CGA CGGCCAGTGCCAAGCTTACAGGGAACCAACTAATCATCTG-3′），擴(kuò)增序列、3 417 bp上游序列和60 bp下游序列（總長為11 327 bp），將酶切的pCAMBIA1300載體作為骨架，通過同源重組法構(gòu)建互補(bǔ)載體，酶切位點(diǎn)為dⅢ和RⅠ。

表1 引物序列

將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒以及突變體種子送至武漢伯遠(yuǎn)公司進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因苗，先洗脫掉其根部的瓊脂糖，然后室內(nèi)培養(yǎng)數(shù)日，移至大田。提取轉(zhuǎn)基因葉片的DNA，設(shè)計(jì)外源檢測引物（- com-detection-F：5′-TAAGCTGCCAGTTGAGCGTTTC C-3′和-com-detection-R：5′-CACTTTATGCTTC CGGCTCGTATG-3′）進(jìn)行PCR鑒定，以鑒定該遺傳轉(zhuǎn)化是否成功。

1.7 RNA提取及qRT-PCR分析

利用RNA提取試劑盒（TIANGEN生物公司）提取野生型和突變體RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以水稻為內(nèi)參基因，使用Vector NTI 10.5軟件設(shè)計(jì)引物（表1），用BIO-RAD CFX Connect Realtime Reaction System儀進(jìn)行qRT-PCR，所得數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt法計(jì)算RQ與SD值，作圖，并用檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 swg1突變體的表型分析

與野生型相比，突變體葉片直立，穗型直立，株型整體較為緊湊（圖1-A）。同時(shí)，突變體穗長顯著變短，比野生型短20%左右（圖1-B和圖1-E）；雖然一次枝梗數(shù)無明顯差異，但二次枝梗數(shù)顯著低于野生型；由于二次枝梗數(shù)的減少和穗長的變短，突變體的每穗粒數(shù)極顯著減少（圖1-F—H）。

相比穗型的變化，突變體在籽粒形態(tài)上的改變也極為明顯。首先，突變體籽粒的長度極顯著變短，比野生型短12.3%（圖1-C和圖1-K），但突變體籽粒寬度極顯著高于野生型9.4%（圖1-C和圖1-L）；所以，突變體粒型表現(xiàn)為團(tuán)粒，籽粒長寬比僅為3.0，而野生型達(dá)到3.6。可能由于長寬的相反變化，最終導(dǎo)致野生型和突變體的粒重?zé)o明顯差異（圖1-I）。進(jìn)一步去除穎殼，統(tǒng)計(jì)野生型與突變體的糙米性狀，發(fā)現(xiàn)突變體的糙米長極顯著短于野生型10%左右，糙米寬極顯著長于野生型8%左右，長寬比也極顯著降低，這與籽粒變化基本一致（圖1-D和圖1-N—P）。

2.2 swg1突變體穎殼的細(xì)胞學(xué)分析

為進(jìn)一步探究突變體出現(xiàn)短寬粒性狀的原因，對突變體穎殼進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)分析。首先，通過掃描電鏡觀察分析了野生型和突變體外稃和內(nèi)稃外表皮細(xì)胞特征和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)野生型和突變體內(nèi)外稃外表皮細(xì)胞均呈現(xiàn)典型的硅化特征（圖2-A和圖2-E），每個(gè)細(xì)胞上分布一個(gè)明顯的瘤狀突起，細(xì)胞縱向排列規(guī)則，橫向無明顯規(guī)律，野生型和突變體之間無明顯差異（圖2-B和圖2-F）；統(tǒng)計(jì)外稃外表皮縱向硅化細(xì)胞的總數(shù)量，發(fā)現(xiàn)與野生型相比并無明顯差異（圖2-I）；進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)相同縱向長度的細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)突變體的細(xì)胞數(shù)量極顯著多于野生型，隨后計(jì)算發(fā)現(xiàn)突變體外表皮硅化細(xì)胞的長度極顯著小于野生型（圖2-B、圖2-F和圖2-J）。表明突變體籽粒變短是由于穎殼細(xì)胞縱向擴(kuò)展水平降低，從而導(dǎo)致細(xì)胞變短。

由于掃描電鏡的拍攝平面和橫向細(xì)胞的不規(guī)則排列問題，通過石蠟切片分析了野生型和突變體開花期小穗穎殼的橫向細(xì)胞特征和數(shù)目。結(jié)果顯示，外稃和內(nèi)稃的細(xì)胞組成和特征在突變體和野生型之間并無明顯差異，由外向內(nèi)都是由4層細(xì)胞組成，包括1層硅化明顯的外表皮，3—6層細(xì)胞壁染色較深、尺寸較小的厚壁細(xì)胞，2—3層染色較淺、尺寸較大的薄壁細(xì)胞，以及1層的內(nèi)表皮細(xì)胞（圖2-D和圖2-H）。分別統(tǒng)計(jì)外稃橫向的外表皮細(xì)胞、厚壁細(xì)胞和內(nèi)表皮細(xì)胞的總數(shù)目，發(fā)現(xiàn)突變體橫向細(xì)胞總數(shù)量極顯著增多，其中，外表皮細(xì)胞、厚壁細(xì)胞增加幅度達(dá)到8.3%和9.3%（圖2-K、圖2-M和圖2-O）；進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)外表皮細(xì)胞和內(nèi)表皮細(xì)胞的橫向?qū)挾纫簿鶚O顯著高于野生型（圖2-L和圖2-N）；隨后，通過統(tǒng)計(jì)相同位置的細(xì)胞數(shù)目和面積，計(jì)算得出突變體橫向厚壁細(xì)胞大小為125 μm2，極顯著高于野生型35%（圖2-P）。以上結(jié)果表明，突變體籽粒變寬是由于穎殼細(xì)胞橫向細(xì)胞增殖與細(xì)胞擴(kuò)展同時(shí)增加所導(dǎo)致。

綜上所述，一方面通過正向調(diào)控穎殼縱向細(xì)胞擴(kuò)展影響籽粒長度，另一方面通過同時(shí)抑制穎殼的橫向細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)展影響籽粒寬度。

2.3 swg1突變體的遺傳分析

突變體與不育系56S雜交后，F(xiàn)1植株表現(xiàn)正常，F(xiàn)2群體植株則表現(xiàn)出顯著的性狀分離，其中，正常植株308株，突變表型植株95株，分離比為3.242﹕1，經(jīng)卡平方測驗(yàn)其分離比符合3﹕1（2=0.438＜20.05=3.84），表明的性狀受隱性單基因控制（表2）。

A：野生型和突變體成熟期的株型對比；B：野生型和突變體成熟期的穗型對比；C：野生型和突變體的籽粒；D：野生型和突變體的米粒；E：穗長；F：一次枝梗數(shù)；G：每穗粒數(shù)；H：二次枝梗數(shù)；I：千粒籽粒重；J：千粒米重；K：籽粒長度；L：籽粒寬度；M：籽粒長寬比；N：米粒長度；O：米粒寬度；P：米粒長寬比。*：在p＜0.05水平差異顯著；**：在p＜0.01水平差異極顯著。下同

表2 swg1短寬粒性狀的遺傳分析

2.4 SWG1的定位

選用一套平均分布在水稻12條染色體的SSR引物，對56S、突變親本進(jìn)行多態(tài)性分析；隨后在F2中分別隨機(jī)選取野生型植株和突變體植株各10株構(gòu)建基因池，用親本間差異引物分析突變基因池和正常基因池，發(fā)現(xiàn)第7染色長臂端的分子標(biāo)記RM21934和RM21979在2個(gè)基因池具有多態(tài)性；用這兩個(gè)標(biāo)記分析50個(gè)F2突變株，重組子個(gè)數(shù)分別為5和4，且目標(biāo)基因位于2個(gè)標(biāo)記之間。為進(jìn)一步縮小定位區(qū)間，在RM21934和RM21979之間進(jìn)一步篩選多態(tài)性分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)RM21968與RM234在親本和基因池間具有多態(tài)性。繼續(xù)用這兩個(gè)標(biāo)記分析56株F2突變株，重組子個(gè)數(shù)都為1，目的基因定位于RM21968與RM234分子標(biāo)記之間（圖3-A）。

2.5 SWG1候選基因分析

通過查詢?nèi)毡厩缧蛄性诙ㄎ粎^(qū)間分子標(biāo)記RM21968（25.36 Mb）和RM234（25.47 Mb）（110 kb）之間的基因，共有18個(gè)注釋基因（圖3-B），包括、、編碼含有結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)；、、、均編碼轉(zhuǎn)座子蛋白；、、、編碼不同的酶類或組成酶的亞基；編碼核糖體蛋白S2；、、、均編碼蛋白質(zhì)；編碼轉(zhuǎn)錄因子（表3）。

為確定候選基因，對野生型XD1B和突變體進(jìn)行了基因組重測序，比對定位區(qū)間重測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)_的第一個(gè)外顯子第389個(gè)堿基發(fā)生了單堿基替換，由胞嘧啶（C）變成胸腺嘧啶（T），隨后通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增比對，確定突變體中位點(diǎn)的確發(fā)生了C-T的替換，從而導(dǎo)致翻譯的蛋白質(zhì)由原本的脯氨酸變成絲氨酸，因此，將暫定為的候選基因（圖3-C）。

A：掃描電鏡下野生型的穎殼外表面，標(biāo)尺=4 mm；B：掃描電鏡下野生型的外稃外表皮局部，標(biāo)尺=400 μm；C：野生型小穗橫切面的石蠟切片，標(biāo)尺=2 mm；D：野生型小穗橫切面的石蠟切片局部及細(xì)胞類型標(biāo)注；E：掃描電鏡下突變體的穎殼外表面，標(biāo)尺=4 mm；F：掃描電鏡下突變體的外稃外表皮局部，標(biāo)尺=400 μm；G：突變體小穗橫切面的石蠟切片，標(biāo)尺=2 mm；H：突變體小穗橫切面的石蠟切片局部及細(xì)胞類型標(biāo)注；I：外稃縱向上外表皮細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)；J：外稃縱向上外表皮細(xì)胞長度的統(tǒng)計(jì)；K：外稃橫向上外表皮細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)；L：外稃橫向上外表皮細(xì)胞寬度的統(tǒng)計(jì)；M：外稃橫向上內(nèi)表皮細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)；N：外稃橫向上內(nèi)表皮細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)；O：外稃橫向上厚壁細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)；P：外稃橫向上厚壁細(xì)胞面積的統(tǒng)計(jì)。LE：外稃；OEP：外表皮細(xì)胞；SC：厚壁細(xì)胞；PA：內(nèi)稃；IEP：內(nèi)表皮細(xì)胞

A: The epidermis of wild-type glume under scanning electron microscope, Bar=4 mm; B: The epidermis of lemma of wild type under scanning electron microscope, Bar=400 μm; C: Paraffin section of cross section of wild-type spikelets, Bar=2 mm; D: Partly paraffin section and cell type labeling on the cross section of wild-type spikelets; E: The epidermis of mutant glume under scanning electron microscope, Bar=4 mm; F: The epidermis of lemma of mutant under scanning electron microscope, Bar=400 μm; G: Paraffin section of cross section of mutant spikelets, Bar=2 mm; H: Partly paraffin section and cell type labeling on the cross section of mutant spikelets; I: Statistics of the number of outer epidermal cells in lemma longitudinal direction; J: Statistics of the length of outer epidermal cells in lemma longitudinal direction; K: Statistics of the number of outer epidermal cells in lemma transverse direction; L: Statistics of the width of outer epidermal cells in lemma transverse direction; M: Statistics of the number of inner epidermal cells in lemma transverse direction; N: Statistics of the number of inner epidermal cells in lemma transverse direction; O: Statistics of the number of sclerenchyma cells in lemma transverse direction; P: Statistics of the area of sclerenchyma cells in lemma transverse direction. LE: lemma; OEP: Outer epidemics; SC: sclerenchyma cells; PA: parenchyma cells; IEP: inner epidermal cells

圖2 野生型和穎殼的組織細(xì)胞學(xué)分析

Fig. 2 Histocytology analysis of wild-type andmutant glumes

2.6 SWG1候選基因的遺傳互補(bǔ)驗(yàn)證

包含10個(gè)外顯子，開放閱讀框全長7 850 bp，CDS全長4 098 bp，編碼包含1 365個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。為了佐證的突變是導(dǎo)致突變體表型的原因，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增野生型中的（包括3 417 bp啟動(dòng)子、基因組DNA 7 850 bp及60 bp下游序列），構(gòu)建互補(bǔ)表達(dá)載體（圖4-A），隨后，將此表達(dá)載體運(yùn)用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)入中。

共獲得17株T0轉(zhuǎn)基因植株，使用外源轉(zhuǎn)基因檢測引物進(jìn)行擴(kuò)增（圖4-A中F1、R1），結(jié)果表明，有7株為陽性植株（圖4-B）；進(jìn)一步用內(nèi)源突變位點(diǎn)檢測引物（圖4-A中F2、R2）擴(kuò)增片段進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明，7株陽性植株全部含有純合突變體位點(diǎn)（圖4-C）。觀察分析這些轉(zhuǎn)基因植株抽穗期和成熟期的表型，發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因植株中穗型、粒型性狀全都與野生型類似，完全恢復(fù)正常（圖4-D—H）。上述結(jié)果證明，就是。在先前的研究中被鑒定為直立密穗基因，編碼一個(gè)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子[32]。

A：SWG1的精細(xì)定位；B：定位區(qū)間內(nèi)的18個(gè)開放閱讀框；C：SWG1的基因結(jié)構(gòu)及突變位點(diǎn)。Ser：絲氨酸；Pro：脯氨酸；Arg：精氨酸

表3 定位區(qū)間內(nèi)的注釋基因

A：pCAMBIA1300-SWG1載體示意圖；B：7株轉(zhuǎn)基因植株的陽性結(jié)果電泳圖；C：F2-R2片段的測序峰圖；D—F：野生型、突變體和互補(bǔ)植株的穗型，標(biāo)尺=1 cm；G：野生型、突變體和互補(bǔ)植株籽粒的十粒長；H：野生型、突變體和互補(bǔ)植株籽粒的十粒寬

2.7 SWG1的表達(dá)模式分析

為明確的表達(dá)部位，運(yùn)用qRT-PCR對的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。結(jié)果表明，在植株中廣泛表達(dá)，在根、莖、葉、葉鞘、穗中均有表達(dá)，無明顯的組織特異性。特別地，在穗中，的表達(dá)隨著穗長度的增加而逐漸減少，在1和3 cm的幼穗中表達(dá)最為強(qiáng)烈，在7、9和11 cm的穗中也都有較高的表達(dá)（圖5）。穎殼由外稃和內(nèi)稃組成，作為最早起始的花器官，1—3 cm是其細(xì)胞增殖最為劇烈的時(shí)期，而7—11 cm時(shí)期應(yīng)該是處于細(xì)胞的擴(kuò)展階段，因此，推測在穗發(fā)育各個(gè)階段的表達(dá)與其功能是相適應(yīng)的。

圖5 SWG1在野生型中的qRT-PCR表達(dá)分析

2.8 粒型相關(guān)基因及細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

先前的研究認(rèn)為編碼一個(gè)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子[30]，為了了解的作用機(jī)制，通過qRT-PCR分析已知粒型調(diào)控基因在野生型和突變體之間的表達(dá)差異。由于水稻粒型的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜龐大，選取了部分通過影響穎殼細(xì)胞增殖和（或）細(xì)胞擴(kuò)展調(diào)控粒長和粒寬的代表性基因，包括、、、、、、、和。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，促進(jìn)穎殼橫向細(xì)胞分裂和擴(kuò)展的、促進(jìn)穎殼橫向細(xì)胞分裂的在中均呈極顯著上調(diào)表達(dá)；同時(shí)，（促進(jìn)穎殼細(xì)胞分裂調(diào)控粒長）、/（調(diào)控細(xì)胞分裂與擴(kuò)展，正向調(diào)控粒長、負(fù)向調(diào)控粒寬）、（促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨大調(diào)控籽粒大小）、（負(fù)向調(diào)控籽粒大?。┖停ㄓ绊懠?xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)展、負(fù)向調(diào)控水稻粒寬）呈顯著下調(diào)表達(dá)（圖6-A）?？傊?，和的上調(diào)表達(dá)、/、及的下調(diào)表達(dá)與突變體籽粒由于穎殼細(xì)胞數(shù)目變多、細(xì)胞變大導(dǎo)致的籽粒變寬表型相吻合，而突變體由于細(xì)胞變小導(dǎo)致的粒長減少也與/、的下調(diào)表達(dá)相一致。

為進(jìn)一步明確突變體穎殼細(xì)胞增殖和擴(kuò)展的變化原因，檢測了部分細(xì)胞周期相關(guān)基因和細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，與細(xì)胞分裂相關(guān)的大部分基因上調(diào)表達(dá)，其中，表達(dá)上調(diào)37%，表達(dá)上調(diào)29%（圖6-B），揭示的橫向細(xì)胞數(shù)目變多可能是由于細(xì)胞分裂增強(qiáng)所導(dǎo)致；同時(shí)，在6個(gè)檢測的細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因中，4個(gè)上調(diào)表達(dá)，2個(gè)下調(diào)表達(dá)，其中，、和表達(dá)量上升40%左右，表達(dá)量上升近1倍（圖6-C），而和則呈明顯的下調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明，突變體穎殼細(xì)胞大小的變化的確與細(xì)胞擴(kuò)展有關(guān)。

總之，可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控部分已知的粒型基因的表達(dá)，進(jìn)而影響了部分與細(xì)胞周期和細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因的表達(dá)，決定了穎殼細(xì)胞數(shù)目和大小的發(fā)育，最終參與了籽粒形態(tài)的發(fā)育。

3 討論

3.1 swg1突變體是dep2的新等位突變體，同時(shí)調(diào)控籽粒形態(tài)和穗部性狀發(fā)育

本研究從XD1B的EMS誘變?nèi)后w中鑒定到一個(gè)短寬粒突變體，通過圖位克隆和遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)將候選基因定為，其編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。先前報(bào)道了該基因的多個(gè)等位突變體，其中，、、均表現(xiàn)出植株矮化、直立密穗、葉片直立等表型；Zhu等[31]認(rèn)為的莖稈更粗，且最上部節(jié)間的維管束組織多于野生型，增加了節(jié)間的機(jī)械強(qiáng)度，從而導(dǎo)致植株直立。Li等[32]研究發(fā)現(xiàn)的一次枝梗與二次枝梗數(shù)目與野生型相比無顯著變化，但細(xì)胞增殖異常導(dǎo)致了穗長減短，這可能是產(chǎn)生密穗表型的原因。Zhu等[33]研究表明OsRELA作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性控制莖中細(xì)胞、近軸側(cè)薄壁細(xì)胞、遠(yuǎn)軸側(cè)薄壁細(xì)胞的生長，從而對葉片角度和株高有正向調(diào)節(jié)作用。另外一個(gè)等位突變體表現(xiàn)出小圓粒的性狀，認(rèn)為籽粒變短是由于細(xì)胞長度和細(xì)胞數(shù)量均下降，而籽粒變寬是由于細(xì)胞橫向?qū)挾仍黾覽34]。本研究鑒定的同時(shí)表現(xiàn)出直立密穗和短寬粒等性狀，這符合先前等位突變體的表型，說明是的新等位突變體。然而，雖然的短寬粒表型與先前等位突變體的小圓粒表型一致，都是長度減少和寬度增加；但這種宏觀表型變化背后的細(xì)胞學(xué)表型卻具有明顯差異，先前研究表明突變體穎殼外表皮細(xì)胞較野生型更短更寬，籽粒的變化是由于細(xì)胞擴(kuò)展異常導(dǎo)致[31]；突變體籽粒變化可能是由于細(xì)胞增殖異常[32]，籽粒穎殼縱向細(xì)胞變大且細(xì)胞數(shù)目增多，橫向細(xì)胞變寬[34]。而在本研究中，穎殼在縱向上的細(xì)胞數(shù)目沒有顯著差異，其變短完全是由于細(xì)胞縱向擴(kuò)展不足；另外在橫向上，除了與一樣細(xì)胞變寬變大以外，還表現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)目增多，導(dǎo)致這種差異可能的原因是突變位點(diǎn)的不同，的突變發(fā)生在第6外顯子區(qū)域，、均在該基因的第7外顯子區(qū)域發(fā)生了突變，而本研究是的第一個(gè)外顯子區(qū)域發(fā)生了突變，不同位點(diǎn)的突變可能導(dǎo)致SWG1蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而改變了蛋白功能，導(dǎo)致SWG1蛋白所處調(diào)控途徑的上下游基因出現(xiàn)差異，從而表現(xiàn)出最終表型（細(xì)胞學(xué)）上的不同。但SWG1蛋白不具有任何已知的結(jié)構(gòu)域，若要明確SWG1蛋白與籽粒穎殼細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系，需要對其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。

A：野生型和突變體中粒型相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平；B：野生型和突變體中細(xì)胞分裂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平；C：野生型和突變體中細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平

3.2 SWG1在籽粒長寬上進(jìn)行相反的調(diào)控

目前，已報(bào)道大量與水稻籽粒形態(tài)發(fā)育相關(guān)的基因，它們大多是通過細(xì)胞增殖或（和）細(xì)胞擴(kuò)展影響穎殼發(fā)育，但多數(shù)基因?qū)ψ蚜Ｐ螒B(tài)發(fā)育的影響都比較單一，在籽粒長度和寬度上表現(xiàn)出一致的調(diào)控，或僅僅調(diào)控其中一方面。本研究進(jìn)行了詳細(xì)的細(xì)胞學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)穎殼縱向上細(xì)胞數(shù)目不變而長度減少，橫向上細(xì)胞數(shù)目和大小均增加，明確了一邊通過正向調(diào)控細(xì)胞擴(kuò)展影響籽粒長度，一邊通過負(fù)向調(diào)控橫向細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)展影響籽粒寬度，特別是在細(xì)胞擴(kuò)展上呈現(xiàn)出縱橫2個(gè)方向上相反的調(diào)控方式。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)的突變影響了多個(gè)籽粒大小發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。其中，、的上調(diào)表達(dá)、/、的下調(diào)表達(dá)與的表型高度一致。編碼一個(gè)絲氨酸羧肽酶，具有加強(qiáng)BR信號傳導(dǎo)的功能，最終促進(jìn)水稻穎殼細(xì)胞分裂和擴(kuò)展正向調(diào)控籽粒寬度[21]。/的上調(diào)表達(dá)能增加谷粒的縱向細(xì)胞分裂和伸長，并減少橫向細(xì)胞分裂和擴(kuò)展，導(dǎo)致谷粒變得細(xì)長；而是一個(gè)包含SBP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，能夠直接與啟動(dòng)子結(jié)合并抑制它的表達(dá)[29-30]。所以，在中，/的下調(diào)表達(dá)可能是上調(diào)表達(dá)的結(jié)果，而不是突變的直接結(jié)果。TGW2編碼細(xì)胞數(shù)目調(diào)控因子OsCNR1，通過與調(diào)控細(xì)胞周期的KRP1蛋白互作影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞生長，負(fù)向調(diào)控水稻粒寬[28]，所以，在中，的下調(diào)表達(dá)與穎殼細(xì)胞橫向分裂和擴(kuò)展增加也是高度吻合。因此，推測編碼的轉(zhuǎn)錄因子可能直接或間接參與了、和的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而決定籽粒的形態(tài)發(fā)育。

除了這些基因以外，籽粒大小調(diào)控基因和在突變中也表現(xiàn)出明顯的下調(diào)表達(dá)，但是與的表型并不是十分匹配；的作用機(jī)制與相似，和BR信號途徑相關(guān)，通過促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)展正向調(diào)控籽粒大小[23-26]，所以，在中，的下調(diào)表達(dá)與縱向細(xì)胞伸長不足是相適應(yīng)的，但是與橫向的細(xì)胞分裂與擴(kuò)展加強(qiáng)是矛盾的，推測其對突變體橫向細(xì)胞的影響可能有其他基因作用作屏蔽。屬于G蛋白信號途徑，編碼一個(gè)非典型的Gγ亞基，通過與或競爭性結(jié)合Gβ亞基，從而負(fù)向調(diào)控籽粒長度[3-5]，但是其表達(dá)明顯下調(diào)似乎與籽粒變短表型是不匹配的；先前的研究表明不同的結(jié)構(gòu)域變異會導(dǎo)致其功能相反，OSR結(jié)構(gòu)功能的丟失會導(dǎo)致形成長的籽粒，而C端TNFR/NGFR和VWFC結(jié)構(gòu)域功能域失活突變會產(chǎn)生非常短的籽粒[4]。因此，要明確的表達(dá)與表型的關(guān)系，需要進(jìn)一步去分析突變體中蛋白是屬于哪種類型。

4 結(jié)論

從秈稻保持系XD1B的EMS誘變?nèi)后w中鑒定到一個(gè)短寬粒突變體。相較于野生型，突變體粒長變短，粒寬增加，呈短寬粒的表型；突變體穎殼縱向細(xì)胞變短是導(dǎo)致粒長變短的主要原因，而粒寬增加是由于穎殼橫向細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞大小同時(shí)增加導(dǎo)致。該突變性狀受隱性單基因——控制，其編碼一個(gè)植物特異轉(zhuǎn)錄因子，無組織特異性表達(dá)，但在莖、葉、幼穗中表達(dá)量較高，正向調(diào)控穎殼橫向細(xì)胞數(shù)目和（或）細(xì)胞大小，可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控部分已知的粒型基因，進(jìn)而影響了部分細(xì)胞周期和細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因的表達(dá)，決定了穎殼細(xì)胞數(shù)目和大小的發(fā)育，最終參與了籽粒的形態(tài)發(fā)育。

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Map-based Cloning of theGenein Rice (L.)

Zhu HongHui, Li YingZi, Gao YuanZhuo, Lin Hong, Wang ChengYang, Yan ZiYi, Peng HanPing, Li TianYe, Xiong Mao, Li YunFeng

Rice Research Institute, Southwest University/Academy of Agricultural Sciences, Southwest University/Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Chongqing 400716

【】Rice yield is composed of effective panicle number per unit area, grains per panicle and grain weight, in which grain weight is mainly determined by grain morphology. Screening and identification of new grain type mutation materials and genes can lay a foundation for molecular design breeding of yield traits. 【】A short and wide grain mutant() was identified in the mutant population of indica rice maintainer line Xida1B(XD1B) induced by ethyl methane sulfonate (EMS). The grain morphology and other agronomic characters were analyzed, and the glume was observed and analyzed by histocytology. Gene mapping was carried out by BSA method, and candidate genes were identified by genetic complementarity experiment. qRT-PCR was used to analyze the expression pattern of the gene and the expression level of other genes related to grain shape and cell development.【】The analysis of agronomic characters showed that the grain length ofmutant was significantly lower and the grain width was significantly higher than that of wild type, showing the phenotype of short and wide grains, and further histological and cytological analysis showed that the shortening of longitudinal cells of glume was the main reason for the shortening of grain length, while the increase of grain width was due to the increase of the number and size of transverse cells of glume at the same time. The results of genetic analysis showed that the mutation was controlled by a recessive single gene, and the candidate gene forwas determined to beby map-based cloning and genetic complementary verification, which encoded a plant-specific transcription factor. qRT-PCR analysis showed that the expression of this gene had no obvious tissue specificity, and its expression is strong in stem, leaf and young panicle. According to the analysis of the expression of known genes related to grain shape, cell cycle and cell expansion, it was found thatand, which positively regulate the number and/or size of glume transverse cells to determine grain width, were significantly up-regulated in the mutants, while/genes, which positively regulated the number and size of longitudinal cells and negatively regulated the number and size of transverse cells, were significantly down-regulated in the mutants. Some genes related to cell cycle and cell expansion also showed significant differences between mutants and wild types. 【】encodes a plant-specific transcription factor, which affects glume cell proliferation and cell expansion by regulating grain shape genes,and G/, thus determining rice grain length and width.

rice (L.); grain; development of glumes; gene mapping

2022-12-08；

2023-01-16

國家自然科學(xué)基金（32172044，31971919）、重慶市杰出青年基金（cstc2020jcyj-jqX0020）、重慶市英才計(jì)劃（cstc2021ycjh-bgzxm0066）

朱洪慧，E-mail：1365358436@qq.com。李映姿，E-mail：1121962708@qq.com。朱洪慧與李映姿為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者李云峰，Tel：023-68251264；E-mail：liyf1980@swu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）